常用基因诊断技术

三、扩增片段长度多态性

小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性 可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用 于致病基因的连锁分析，这种诊断方法 称为扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP) 连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位 片段之间的差别有时只有几个核苷酸， 故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。 此法多用于突变性质不明的连锁分析.
图13-6 Southern印迹杂交示意图
二、聚合酶链反应
Hale Waihona Puke Baidu
首先应按照欲检测的DNA的5’和3’端的碱基顺序各合成一段长约 17-20余个碱基的寡核苷酸作为引物(primer)，其次是将待检测的 DNA变性后，加入四种单核苷酸(dNTP)、引物和耐热聚合酶。在 较低的温度，引物将与待扩增的DNA链复性结合，然后的聚合酶 的作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不断延伸合成新互补链， 这样，一条DNA双链就变成了两条双链。若继续按照变性(9295℃)→复性(40-60℃)→引物延伸(65-72℃)的顺序循环20至40个 周期，就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使 DNA扩增2n，即100余万倍。PCR反应特异性强，灵敏度高，极 微量的DNA即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。毛发、血 痕，甚至单个细胞的DNA即可供PCR扩增之用。因此它用于病原 体DNA的检查、肿瘤残留细胞的检出、罪犯或个体遗传物质的鉴 定以及遗传病的基因诊断等。
五、单链构象多态性诊断法
链构象多态性(signle strand conformation polymorphism,SSCP)是指单链DNA由于碱基序列的不同 可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单 链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基 的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基 因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引 物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在 聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将 表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。 PCR-SSCP法具有能快速、灵敏地检测有无点突变或多 态性的优点，但如欲阐明突变的碱基性质，则需作序列 分析
常用基因诊断技术
一、Southern印迹法 (Southern blot)

基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强， 当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压 上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的 单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置 保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于 膜上。当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素 标记了的探针进行杂交，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在 塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的 杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链 基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如 只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去 膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行 放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示 黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改 变。

四、等位基因的特异寡核苷酸 探针诊断法

当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的 寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO)用同位素或非同 位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测 点突变时一般需要合成两种探针，一种与正常基因序列完全一致， 能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变 基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因 序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因 区别开来. PCR可结合ASO，即PCR-ASO技术，即先将含有突变点的基因有 关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简 化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。