第11讲 动物细胞生物制药应用

问题回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？
细胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使两个或两个 以上的细胞合并形成一个细胞的技术。
体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传重组，在育 种方面意义重大。
杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。
基础知识回顾
（一）免疫学基础 1 抗原 进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证 骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3.细胞融合
（1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完 全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培 养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养 液洗涤2次。 （2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在 一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心， 弃上清，用滴管吸净残留液体。
包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。
特点：外源性、结构性（分子表面具有稳定的环状结构基团 作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。
2 抗体
动物免疫系统分泌的中和或消除 抗原物质的影响的物质，存在于 血清中，本质是免疫球蛋白 （Immuniglobulin,Ig）。 互补性决定区 （Complementarity determining region，CDR）VH和VL的三个高 变区共同组成Ig的抗原结合部位 （Antigen-binding site）。该 部位形成一个与抗原决定簇互补 的表面，决定抗体的多样性与特 异性。
SARS病毒
SARS病毒属于冠状病毒科， 病毒粒子多呈圆形，有囊膜， 外周有冠状排列的纤突，病 毒直径在80-120nm之间。 感染病毒的细胞线粒体肿胀， 部分线粒体外膜或嵴溶解， 病毒颗粒主要分布在胞浆的 内质网池、胞浆空泡内和细 胞外，多聚集成堆。
HIV病毒-艾滋病
HIV是艾滋病病毒（human immunodeficiency virus）的缩写。 “人类免疫缺陷病毒”。逆转录病毒， 遗传信息存在于两个相同的RNA单链 模板中。艾滋病是1981年发现的。 生存于人的血液中并攻击人体免疫系 统。把人体免疫系统中最重要的T4淋 巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破 坏T4淋巴细胞，从而使整个人体免疫 系统遭到破坏，最终人体丧失对各种 疾病的抵抗能力而导致死亡。
（二）杂交瘤技术
将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够分泌 抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培 养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通 称为杂交瘤技术（hydridoma technique）。
（三）单克隆抗体应用领域
单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、 与抗原结合的特异性强，广泛应用于生物学和医学研究领 域： 1.作为亲合层析的配体 2.作为生物治疗的导向武器 3.作为免疫抑制剂
病毒进入细胞：血凝素（H）能和细胞膜上的蛋白结合， 在细胞上打开一个通道，使得病毒能进入细胞。
病毒要钻出宿主细胞：神经氨酸酶（N）通过“水解”的 方式切断病毒和宿主细胞的最后联系，使病毒脱离宿主细 胞。
首批36万支甲型H1N1流感病毒疫苗抵达新疆 http://www.ccots.com.cn 2009-10-16
7.单克隆抗体的大量生产
（1）实体瘤法
对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107cells／ml 接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml。待肿瘤 达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血 清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。
采血量有限。
（2）腹水制备法
腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天
人—鼠杂交瘤：融合方法基本与鼠—鼠杂交瘤相同。亲 本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本B细胞则来源于人 外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但是，人—鼠 杂交瘤的人单克隆抗体分泌性能很不稳定，多数情况下 杂交瘤会很快失去抗体分泌能力。 人—人杂交瘤：可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系与 人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体。人源性融合亲本 细胞需具有较高的融合率、产生的杂交瘤核型稳定并能 产生一定量的具有特异性的抗体等特征。人—人杂交瘤 核型稳定，然而遗憾的是可供利用的人类骨髓瘤细胞种 类非常有限。
第11讲 动物细胞生物制药应用
新民周刊 2010,5.17-23.P76-9
2010.11.2：世界肺炎日（第2个）
全球每年约有160万人死于肺炎链球菌疾病， 平均每38秒就有1名5岁下儿童死于此病， 1100万儿童因肺炎住院。导致儿童死亡的 头号杀手，并高致残：智力低下、癫痫 （17%）、耳聋（27.7%）。 中国是10个肺炎发病率最高的国家之一， 1/4儿童携带病菌；死亡儿童该病占46.8%。 占西太平洋区的70%。 1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗PPV23 诞生。2000年针对2岁以下儿童的7价肺炎 链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世。目前已经 接种3亿剂，世界第一大单个疫苗。 肺炎链球菌发现100年后，真正安全有效的 PPV7疫苗才大规模使用。制造工艺非常复 杂，约需要一年左右。只有爱尔兰、美国 两家工厂。
4.探针
5.增强抗原的免疫原性 6. 作为医学检验试剂
（三）技术流程 视频： http://v.youku.com/v_show/i d_XMTY1ODg5MDI0.html
亲本细胞的准备 细胞融合
杂交瘤细胞的筛选
可分泌特异性单克隆抗体 的杂交瘤细胞的筛选
杂交瘤细胞的克隆化培养 单克隆抗体的生产和纯化
1.动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备
一般要经过初次免疫、第二次免疫（向动物腹腔内 注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体） 三个过程。如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次 加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。
免疫方法：
体内法或体外法。 体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射入小鼠体内，可 溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入 到动物体内。3－4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴 结制成悬液，存活率在95％以上的可以用于融合。 体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml， 加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。
2009年12月3日，国家食品药品监督管理局在监督检 查中发现，江苏延申和河北福尔生物制药股份有限 公司的7个批次人用狂犬病疫苗存在质量问题。
2010.3.17：山西疫苗事件
本节主要内容
1.杂交瘤技术生产单克隆抗体 2.病毒疫苗生产
本节关键问题
杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程
一 杂交瘤技术生产单克隆抗体
H、N的意思
世界卫生组织2009年4月30日建议使用“A/H1N1流感”的 名称。 病毒根据抗原性的不同，可分为A、B、C三型。根据血凝 素(Hemagglutinin，H)和神经氨酸酶(Neyramidinase，N) 的抗原特性，将A型流感病毒分成不同的亚型。目前，有 15种特异的H亚型和9种特异的N亚型。
亲本细胞的准备
B 淋巴细胞的准备
B淋巴细胞
注入小鼠皮下或腹腔
取出脾脏
2.骨髓瘤细胞的获得与培养
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合 率高。骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细胞培养液。 小牛血清的浓度一般在10％—20％，细胞的最大密度不得 超106个／ml，一般扩大培养以1：10稀释传代，每3-5天 传代一次。细胞的倍增时间为16-20h。 通常采用HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）与TK （胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞系。
问题的引出
血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一 个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须 采用其他方法。 如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的B淋巴细 胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？
问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？
很难离体培养B淋巴细胞。
（一）历史发现
1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外 培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B 淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双 亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无 限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。
主要困难
（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的 细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且 细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来 说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不 可行的； （3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂 交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目 的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。
（3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的 PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完 全培养液，终止PEG作用。
（4）离心，弃上清，用20％小牛血清等轻轻混悬。 将融合后细胞悬液加入96孔板，100μl／孔，37℃、 5％CO2孵箱培养。
4 融合细胞的筛选 融合后的细胞类型
融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的 瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及 细胞的多聚体等。 正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选， 细胞的多聚体形式也容易死去。 剩余：脾细胞与瘤细胞的融合细胞+未融合的瘤细胞+融合 的瘤细胞和瘤细胞，其中后两种需进行特别的筛选去除。
后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试 管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注
射器抽取腹水，可反复收集数次。
腹水中单克隆抗体含量可达5～20mg/ml， 这是目
前最常用的方法。
（3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产 单抗
杂交瘤细胞
生物反应器
培养液
离心除去细胞，收集源自文库清液提取抗体。
（五）人源化单克隆抗体简介
红霉素不敏感几乎达到100%，青霉素达86%。
病毒及病毒疾病
甲型H1N1流感病毒
猪流感（Swine Flu），是猪群中发现的一种可引起地方性 流行性感冒的正黏液病毒，属呼吸系统疾病，由甲型流感病 毒(A型流感病毒)引发。
以往曾经发生人类感染猪流感，但未有发生人传人案例。 2009年4月墨西哥猪流感造成数150多死亡事件，并在多个 国家蔓延。
体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。
6.分泌抗体的融合细胞的筛选
酶联免疫吸附法（ELISA） EILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并 保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持 其免疫活性和酶催化活性的基本原理。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标 抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起 反应，形成的抗原抗体复合物，加入酶反应的底物后，底 物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的 量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
抗体产生的途径
免疫系统：包括体液免疫和细胞免疫，参与的细 胞包括
B淋巴细胞——发育成浆细胞，分泌抗体，参与体 液免疫，脾脏可以分泌。 T淋巴细胞——发育成吞噬细胞，直接参与细胞免 疫，经胸腺分泌。不能产生抗体，帮助B淋巴细胞 产生抗体。
多克隆抗体与单克隆抗体
动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆， 它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。 一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多 个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体 是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆 抗体。
HAT培养基筛选法
培养基中有三种关键 成分：次黄嘌呤 （hypoxanthine，H）、 氨基蝶呤 （aminopterin，A） 和胸腺嘧啶核苷 （thymidine，T）， 所以取三者的字头称 为HAT培养基。
筛选原理
5.克隆化培养
将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每
一孔中的细胞数在0至数个细胞之间，培养一段时 间后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞。 找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻存、
鼠源性单抗仍带有鼠抗原决定簇而使其应用存在一定的局限 性: （1）不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统 （2）被人体免疫系统所识别, 产生人抗鼠抗体( Human antigen mouse antibody,HAMA) （3）在人体循环系统中很快被清除掉。 通过人源化改造获得低免疫原性、高效性、人源性单克隆抗 体，解决鼠杂交瘤单抗用于人体的变态反应的问题。