第六章酶的固定化解析讲解
酶工程 第六章酶与细胞固定化 第二节酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径—般只有几 ㎛至几百㎛，称为微胶囊。制备时，—般是将酶液分散在 与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜， 将酶包埋在微胶囊之中。例如：将欲固定化的酶及亲水性 单体(如已二胺等)溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体 (如癸二酰氯等)溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将 这两种互不相溶的液体混和在一起，加入乳化剂（如司盘 -85等）进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的 已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透 膜，将酶包理在小球之内。再加进吐温-20(Tween-20)， 使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊 型的固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第二节 酶和菌体固定化
将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称 为酶的固定化。
酶的固定化
C.聚丙烯酰胺衍生物。该类衍生物的商品名称为bio-Gel或Enzacry。 如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，经重氮化可 固定酶。用此法制备的有氨基酰化酶，淀粉酶等固定化酶。
D.苯乙酰树脂。这是聚氨基苯乙烯(a)和一种异丁烯-间-氨基 苯乙烯(b)的共聚物，通过重氮化后可固定酶．如胃蛋白酶、 核糖核酸酶等。
缩合反应 一些带羧基、羟基或氨基的载体用羰二亚胺活化后，
与酶分子的氨基或羧基直接偶联，形成肽键，产生固定化 酶。—般在弱酸条件下(pH4.75—5)将酶、羰二亚胺、载体同时 混合，羰二亚胺与载体的羧基反应生成活泼的O-乙酰异脲衍生 物，与酶分子的氨基缩合成肽键或者重排为酰基脲。
包埋法
包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂(包 括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化
羟基聚合物 纤维素、葡聚糖、琼脂糖及壳聚糖等可用溴化氰法、氯 甲酸乙酯法、环氧化法及三嗪法等
葡聚糖
纤维素
琼Байду номын сангаас糖
壳聚糖
n溴化氰法
o 氯甲酸乙酯法
p 环氧化法
OH + CH 2 CH O
表氯醇
CH 2C l
H O CH 2 CH CH 2 O
P -NH 2 P -O H P-SH
O CH 2R P R = NH O S
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:
1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸
附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢
酶六章酶的固定化
迄今已有许多酶用离子结合 法固定化，例如1969年最早应用 于工业生产的固定化氨基酰化酶 就是使用多糖类阴离子交换剂 DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。
（二）化学结合法
——1 共价结合法 ——2 交联法
共价偶联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相
N OH
O
O O CO N
O
P-NH2
O CO NH P
CH2COOH SOCl2
CH2COCl
P-NH2 pH8~9
CH2CONH P
多胺载体
CH2NH2 Cl-CS-Cl
CH2 N C S P-NH2
HO CH2 N C NHP
CH2COOH
MeOH HCl
CH2COOMe NH2NH2
CH2CON3 P-NH2
O OH O CH2CH2 O S OH
O
O OH O CH2CH2 O S OH
O
NH2 N N-P
无机载体
——可采用直接法和涂层法（用 活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖 涂层）
O P-NH2
Si (CH2)3NH CH(CH2)3CHO
O
(1)
OHC-(CH2)3CHO
O Si (CH2)3NH CH(CH2)3CH=N-P O
O Si OH H2N(CH2)3Si (OEt)3 O Si OH
制备固定化酶要根据不同情况 （不同酶、不同应用目的和应用环境） 来选择不同的方法，但是无论如何选 择，确定什么样的方法，都要遵循几 个基本原则
原则1
——必须注意维持酶的催化活性 及专一性，保持酶原有的专一性、 高效催化能力和在常温常压下能 起催化反应的特点。
《酶的固定化》课件
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
酶的固定化名词解释
酶的固定化名词解释为了更好地理解酶的固定化，我们需要先了解一些基本的概念和名词。
酶是一种生物催化剂，它能够将化学反应的速率加快数百倍，甚至几千倍。
酶能够在体内进行催化作用，但是在工业中，酶的使用通常需要将其提取出来并进行固定化处理。
酶的固定化是对酶进行处理，使其能够在固定的材料上稳定存在并进行催化作用。
将酶固定在固体支持材料（例如聚四氟乙烯、聚丙烯等）上，然后将其包装成固定化酶催化剂，可以大大提高酶的稳定性和重复使用率，从而减少了生产成本和废弃物的产生。
下面，我们来具体了解一些与酶的固定化相关的名词和概念。
一、酶的特性1、酶的亲和力酶的亲和力指的是酶与反应物之间结合的强度。
酶与反应物之间的亲和力越大，酶的催化效率就越高。
2、酶的催化效率酶的催化效率指的是在特定条件下，酶催化反应的速率。
酶的催化效率越高，酶能够催化反应的速度越快。
3、酶的稳定性酶的稳定性指的是酶在特定条件下的稳定性。
稳定的酶能够长时间地保持其催化活性，从而减少了酶失活的可能性。
二、酶的固定化方式1、吸附法吸附法是将酶分子直接吸附到固体材料表面上，例如有机树脂、硅胶、纤维素等。
吸附法具有操作简单、易于控制等优点，但其中的酶易于脱落，稳定性较差。
2、包埋法包埋法是将酶固定在聚丙烯、聚乙烯等材料中。
在制备过程中，在酶与材料之间添加辅料，或利用聚合反应构筑复合材料结构。
包埋法的优点是稳定性强，但是酶催化效率较低。
3、共价固定化共价固定化是将固体支持材料和酶分子通过化学键或其他共价键结合在一起，从而形成一种新的化合物。
共价固定化的优点是稳定性强，催化效率高，但需要复杂的制备过程和化学反应条件的严格掌控。
三、固定化酶的应用1、废水处理将固定化酶催化剂添加到废水中，可以有效地去除废水中的有害物质和污染物，从而达到净化废水的目的。
2、食品加工固定化酶催化剂可以在食品加工中发挥重要作用，例如在面包、奶酪和啤酒等食品的制备过程中，利用固定化酶催化剂进行酵素催化反应。
酶的固定化
3、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1) 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。
常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2) 共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：(1 )天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；(2)有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等(3 )无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu 侧链的一COOH、C-末端的一COOH ; Tyr 的苯酚基；Cys 的一SH; Lys 的&NH2、N-末端一NH2；Thr、Ser 的一OH ; His 的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：(1 )重氮化法(2)叠氮法(3 )溴基化法(4)烷基化法等。
4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个一NH2,戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2〜7.2, 0C下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
酶的固定化技术及其应用
酶的固定化技术及其应用
1 固定化酶
固定化酶（Enzyme immobilization）是指将酶物质由可溶解状态
变为固体状态，可以将活性较弱、易水解的酶，其重复利用、反应时
间长等优点而被广泛应用。
固定化酶的方法有很多，比如粒子固定化、介孔固定化、水膜固
定化、络合固定化、键合固定化和分子印迹固定化技术等等。
它们之
间的差异在于固定化酶对酶的原始活性变化情况。
2 固定化酶的应用
固定化酶除了具有重复利用、反应时间长等普遍优点外，还可以
应用于多种领域，比如医疗诊断、分析检测、药物合成、制药工业等，深受科研和工业界的重视。
固定化酶在药物合成中，用于集中化学反应、启动物料的转化，
可以有效提高反应产率，减少有害物质的排放，从而获取纯度较高的
有效成分，在药品工业中可实现大规模的批量生产，降低成本。
此外，固定化酶还可用于环境污染问题，比如某些微生物中含有
放射性元素，可使用固定化酶将其净化，解决环境污染的问题，维护
环境健康。
同时，固定化酶还有广泛的应用于食品工业、饮料工业、制糖、
乳品加工以及有机合成等领域中，为生产过程提供工艺改进和工艺优
化技术。
3 总结
固定化酶是将酶物质由可溶解状态变为固体状态，应用技术繁多，在医疗诊断、药物合成、制药工业等多个领域发挥着重要作用。
未来，随着固定化酶技术的发展，它在医药、食品、生物工程和环保等领域
的应用将更加广泛。
6 酶学与酶工程 第六章 酶的固定化
2．蛋白总量 (1)双辛可宁酸法(BCA法) (2)考马斯亮蓝法 3．偶联率及相对活力 偶联率＝(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)／加入 蛋白活力X100％ 活力回收＝固定化酶总活力／加入酶的总活力 ×100％ 相对活力＝固定化酶总活力／(加入酶的总活 力一上清液中未偶联酶活力)X100％
物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅 藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉 价易得，而且可反复使用
于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢
固而容易脱落，
2.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方
法称为包埋法。
包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法（半透膜法） 将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包 埋法；
将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微胶囊法。包
埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，因 此可以应用于许多酶、微生物的固定化。
1）凝胶包埋法 凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法 主要用包埋载体： 琼脂凝胶， 海藻酸钙凝胶， 角叉菜胶， 明胶， 聚丙烯酰胺凝胶
固定化酶颗粒的扩散阻力会使反应速率下降；
只能用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适
宜。
必须注意维持酶的催化活性及专一性 应该有利于生产自动化、连续化
应有最小的空间位阻
酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮存，利 于反复使用
固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物，产物或 反应液发生化学反应
酶工程 第六章酶与细胞固定化 第四节 原生质体固定化
第四节 原生质体固定化
3.生物碱的生产 1985年，Kome等人进行固定化麦角菌原生质体生产麦 角碱的研究，虽然产率不高，但显示出较好的操作稳定性， 可连续使用15天。 4.甾体转化 1985年，Linsefors等人用固定化胡萝卜原生质体进 行甾体转化的研究，可以催化毛地黄毒苦进行5β-羟基化 反应，生成杠柳毒苷。 5.木质素降解 1988年，Boettcher等人用固定化白腐真菌原生质体 进行降解木质素的研究，其降解能力比游离细胞显著提高。 从上述例子可见，固定化原生质体技术虽然研究历史 不长，但已在多个领域的研究中显示出其优越性，具有广 阔的应用前景。
第四节 原生质体固定化
2.胞内酶的生产
1986年，华南理工大学生物工程研究所用固定化枯草 杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞间质中 的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36％，可 连续使用37天；用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化 酶，使细胞内的葡萄糖氧化酶，90％以上分泌到发酵液中； 用固定化谷氨酸棒杆菌原生质体生产谷氨酸脱氢酶，分泌 到发酵液中的谷氨酸脱氢酶占该酶总量的62％。
第四节 原生质体固定化
三、固定化原生质体的应用
固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特 性，可以照常产生原来在细胞内生产的各种代谢产物，另 一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不 断地分泌到胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺 而在发酵液中获得所需的发解产物，为胞内物质的工业化 生产开辟了新途径。
固定化原生质体的制备主要包括原生质体的制备和原 生质体固定化两个阶段。
一、原生质体的制备
酶固定化
酶的固定化摘要：水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。
在催化反应中以固相状态作用于底物。
关键词：固定化酶；不溶于水；包埋法；活性中心；功能基团。
正文：固定化酶（immobilized enzyme）不溶于水的酶。
是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。
酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。
便于运输和贮存，有利于自动化生产。
固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶操作的注意事项1．活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。
2．功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合。
3．酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
固定化的优点：1．不溶于水，易于与产物分离；2．可反复使用；3．可连续化生产；4．稳定性好。
酶的固定化方案
酶的固定化的方案一、材料和方法1.实验材料及试剂酶，25%戊二醛溶液，带氨基的载体，考马斯亮蓝，牛血清白蛋白。
2. 主要实验仪器紫外可见光分光光度计Uv-1800，THZ一C恒温振荡器，MD200一3型电子天平PHS一3C酸度计3.酶的固定化方法1）载体的活化a 对所得的载体表面带有大量的氨基，对其进行活化处理可用于酶蛋白的共价结合。
采用戊二醛为活化试剂，使凝胶表面连接上游离的醛基。
具体方法为:将lg带氨基的载体颗粒臵于3ml、10%的戊二醛溶液中振荡24h，然后真空过滤。
所得固体用去离子水洗涤多次，干燥后即为戊二醛活化的树脂颗粒。
b大孔树脂预处理方法：称取10g树脂于锥形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤，用1L蒸馏水冲洗。
树脂依次用25mL的5%HCl和5%NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用蒸馏水洗至中性。
抽滤后臵于4℃冰箱中干燥4h，室温保存备用。
举例：称取适量经预处理的大孔树脂于50mL锥形瓶中，加入适量磷酸缓冲液（pH7.5，0.05mol/L）和适量的酶，臵于恒温水浴振荡器中吸附一定时间后（37℃，150r/min）真空抽滤，并用100mL缓冲液冲洗载体，抽干后臵于4℃冰箱中干燥4h，并于4℃冰箱中密封保存。
2）固定化方法a 共价结合法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。
然后于冰浴中缓慢振荡24h。
之后离心收集固体，用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
b 酶聚集体包被法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。
然后于冰浴中缓慢振荡24h。
之后向混合液中加入0.5ml、2%的戊二醛溶液，继续振荡10h，离心收集固体。
最后用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
c.酶活性的测定d. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度固定化时溶液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定：考马斯亮蓝试剂的配制：将考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000mL。
酶工程第六章 固定化酶
酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合 法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。
6.3.1吸附法
吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶 分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的 方法，是固定化中最简单的方法。 酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相 互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。
（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基
团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用
最多的一种。
常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共
聚体和聚丙烯化生成叠氮化合物，再与酶分子上
的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等
其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项
研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新 技术。
6.1 固定化酶的定义与优点
所谓固定化酶(immobilized enzyme)， 是指在一定的空间范围内起催化作用，并 能反复和连续使用的酶。
固定化酶的优点：
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同 时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。
（1）物理吸附法
物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶
直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。
是制备固定化酶最早采用的方法。
如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此
法进行固定化。物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶 原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、 多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。
酶固定化的原理
酶固定化的原理
酶固定化是指将酶固定在载体上，形成酶固定化系统，用于生物催化反应。
其原理是将酶与载体通过物理或化学方法结合在一起，形成稳定的酶固定化系统，以提高酶的稳定性、重复使用性和操作性。
酶固定化的原理主要包括以下几个方面：
1. 物理方法：通过吸附、离子交换和包埋等物理方法将酶固定在载体上。
例如，将酶溶液与载体接触，通过物理吸附作用使酶附着在载体表面，形成酶固定化系统。
2. 化学方法：通过共价结合、交联和胶束等化学方法将酶固定在载体上。
例如，将酶与载体表面的功能基团发生共价键结合，形成稳定的酶固定化系统。
3. 复合方法：物理和化学方法可以结合使用，形成更稳定的酶固定化系统。
例如，先用物理方法将酶吸附在载体上，然后再进行化学修饰，增强固定效果。
酶固定化的原理主要是利用载体提供的稳定性和大面积接触酶的功能，从而增强酶的稳定性和重复使用性。
载体可以是天然的（如纤维素、凝胶等）或人工合成的（如高分子材料、纳米材料等）。
通过固定化酶，可以将其应用于工业生产中，提高反应效率，降低成本。
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2)、制备固定化酶遵循基本原则：
（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。 （ 2 ）固定化应该有利于生产自动化、连续化。 （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨 碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 （4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能 回收贮藏，利于重复使用。 （5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与 废物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
（2）固定化酶的制备机理
所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。
（3）优缺点
优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的 高级结构;方法简单，成本低。 缺点：酶吸附不牢固，易脱落； 防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应
吸附法固定化酶举例
载体 固定化酶
α －淀粉酶、β －淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶 脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶
三、酶的固定化方法原则和注意事项
1)、固定化酶操作的注意事项
活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的 氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定 化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的 羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求 不参与酶的固定化结合。 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理， 而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因 此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
四、酶的固定化方法
酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的 方法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于 结合的化学反应的类型进行分类，大体可概括 为四种类型： 1.吸附法； 3.交联法; 2.结合法； 4.包埋法
1.吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶 菌体吸附在其表面上，而使酶固定化 的方法称为物理吸附法。
60年千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定
化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸 酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固 定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生 产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶， 开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取 得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有 利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提 供了新的方向。
第六章 酶的固定化
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α -淀粉酶等； 和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在 高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容 易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样 酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后， 即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使 用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一 起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
亮氨酸氨肽酶 胰蛋白酶、核糖核酸酶 Β－淀粉液化酶
活性炭
多孔玻璃 氧化铝 碳酸钙凝胶 纤维素 麸素
硅胶
磷酸化酶
2.结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一 起的固定化方法称为结合法。 根据酶与载体结合的化学键不同，可分为共价结合法和离 子结合法。 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法 称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不 溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维 素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法 称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有： 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚 物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯 基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键， 必须首先使载体活化。
固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
缺点：
1.由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率 损失； 2.多了固定化载体成本费用及固定化操作费用，并且固定化 酶颗粒的扩散阻力作用会使酶的反应速率下降; 3.比较适用于水溶性的底物和小分子底物。
二、固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。