第六章酶的固定化解析讲解
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亮氨酸氨肽酶 胰蛋白酶、核糖核酸酶 Β－淀粉液化酶
活性炭
多孔玻璃 氧化铝 碳酸钙凝胶 纤维素 麸素
硅胶
磷酸化酶
2.结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一 起的固定化方法称为结合法。 根据酶与载体结合的化学键不同，可分为共价结合法和离 子结合法。 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法 称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不 溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维 素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法 称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有： 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚 物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯 基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键， 必须首先使载体活化。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的
千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定
化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸 酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固 定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生 产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶， 开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取 得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有 利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提 供了新的方向。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
缺点：
1.由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率 损失； 2.多了固定化载体成本费用及固定化操作费用，并且固定化 酶颗粒的扩散阻力作用会使酶的反应速率下降; 3.比较适用于水溶性的底物和小分子底物。
二、固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
（2）固定化酶的制备机理
所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。
（3）优缺点
优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的 高级结构;方法简单，成本低。 缺点：酶吸附不牢固，易脱落； 防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应
吸附法固定化酶举例
载体 固定化酶
α －淀粉酶、β －淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶 脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶
Βιβλιοθήκη Baidu
2)、制备固定化酶遵循基本原则：
（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。 （ 2 ）固定化应该有利于生产自动化、连续化。 （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨 碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 （4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能 回收贮藏，利于重复使用。 （5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与 废物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
第六章 酶的固定化
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α -淀粉酶等； 和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在 高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容 易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样 酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后， 即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使 用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一 起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
四、酶的固定化方法
酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的 方法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于 结合的化学反应的类型进行分类，大体可概括 为四种类型： 1.吸附法； 3.交联法; 2.结合法； 4.包埋法
1.吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶 菌体吸附在其表面上，而使酶固定化 的方法称为物理吸附法。
三、酶的固定化方法原则和注意事项
1)、固定化酶操作的注意事项
活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的 氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定 化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的 羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求 不参与酶的固定化结合。 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理， 而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因 此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
活性炭
多孔玻璃 氧化铝 碳酸钙凝胶 纤维素 麸素
硅胶
磷酸化酶
2.结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一 起的固定化方法称为结合法。 根据酶与载体结合的化学键不同，可分为共价结合法和离 子结合法。 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法 称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不 溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维 素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法 称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有： 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚 物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯 基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键， 必须首先使载体活化。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的
千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定
化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸 酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固 定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生 产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶， 开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取 得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有 利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提 供了新的方向。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
缺点：
1.由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率 损失； 2.多了固定化载体成本费用及固定化操作费用，并且固定化 酶颗粒的扩散阻力作用会使酶的反应速率下降; 3.比较适用于水溶性的底物和小分子底物。
二、固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
（2）固定化酶的制备机理
所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。
（3）优缺点
优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的 高级结构;方法简单，成本低。 缺点：酶吸附不牢固，易脱落； 防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应
吸附法固定化酶举例
载体 固定化酶
α －淀粉酶、β －淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶 脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶
Βιβλιοθήκη Baidu
2)、制备固定化酶遵循基本原则：
（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。 （ 2 ）固定化应该有利于生产自动化、连续化。 （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨 碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 （4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能 回收贮藏，利于重复使用。 （5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与 废物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
第六章 酶的固定化
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α -淀粉酶等； 和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在 高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容 易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样 酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后， 即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使 用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一 起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
四、酶的固定化方法
酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的 方法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于 结合的化学反应的类型进行分类，大体可概括 为四种类型： 1.吸附法； 3.交联法; 2.结合法； 4.包埋法
1.吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶 菌体吸附在其表面上，而使酶固定化 的方法称为物理吸附法。
三、酶的固定化方法原则和注意事项
1)、固定化酶操作的注意事项
活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的 氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定 化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的 羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求 不参与酶的固定化结合。 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理， 而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因 此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。