蛋白质的测定方法

蛋白质的测定方法

测定食物中的蛋白质含量有二种方法，一是凯氏微量法，二是自动定氮分析法。

一．凯氏微量法

有手工滴定定氮和自动定氮仪定氮，实验者可根据经济条件设备而定。

1.原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O

（NH4）2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4

2.方法

本法参照GB 5009.5 -85

适用于各类食品及饲料中蛋白质的测定

3.试剂

所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。

3.1硫酸铜

3.2硫酸钾

3.3浓硫酸

3.4 2%硼酸溶液（或1%的硼酸）

3.5 混合指示剂：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

3.6饱和氢氧化钠：500g氢氧化钠加入500ml水中，搅拌溶解，冷却后放置数日，澄清后使用。

3.7 0.01mol/L或0.05mol/L盐酸标准溶液：需标定后使用(配制及标定方法见附录)

4.仪器

消化炉凯氏定氮蒸馏装置万分之一电子天平

凯氏定氮蒸馏装置：如图所示

5. 操作步骤

5.1样品处理：精密称取0.1~2.0g固体样品或2~5g半固体样品或吸取液体样品5~20ml，放入100ml或500ml凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜，0.3g硫酸钾及3~20ml浓硫酸，放置过夜后小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，取下放冷后用约2～10ml蒸馏水冲洗瓶壁，混匀后继续加热至液体呈蓝绿透明，取下放冷，小心加10~20ml水混匀，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白实验。

5.2按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

5.3向接收瓶内加入10ml ,1~2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10ml样品消化稀释液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将3~10ml饱和氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯中，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻璃塞盖紧，并加水于小玻璃杯中以防漏气。加紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏2min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，然后用少量中性水冲洗冷凝管下端外部，再蒸馏1min取下接收瓶，以0.01或0.05mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。

同时吸取10ml试剂空白消化液按5.3操作。

6. 计算

X = （V-V0 ）×C× 0.014× B/m ×100× F

式中：

X 一样品中蛋白质含量，g／100g；

V 一样品消耗盐酸标准液的体积，ml;

V0 - 空白消化液消耗盐酸标准液体积，ml;

C 一盐酸标准液摩尔浓度,mol/L;

0. 014一1mol/L 盐酸标准液1 ml相当氮克数.

B 一定容体积/取液量

m 一样品的质量，g;

F 一氮换算为蛋白质计算因子。蛋白质的氮素含量不同，故换算因子不同。详见下表。

蛋白质计算因子

食物计算因子

蛋，鱼，肉及制品，禽类，玉米，高粱，豆类，水果和蔬菜类 6.25

乳及乳制品 6.38

大米 5.95

小麦面普通粉 5.70

全麦，大麦，燕麦，裸麦,小米，小麦面全麦 5.83

小麦 5.80

黄豆 5.71

花生 5.46

芝麻，向日葵，核桃和榛子 5.30

麸皮 6.31

7. 举例

设取样品0.1000g，消化后稀释至100 ml; 。取10 ml样品稀释液，标准盐酸为0.01 mol/L ，空白滴定为0.12 ml; ，样品滴定用去的标准盐酸为3.21 ml; ，测得样品中蛋白质百分率为：（3.21-0.12）×0.01×0.014×10／0.01× 100× 6.25

＝（3.21-0.12）×8.75＝27.0%

8. 附录：

（1）标准HCl溶液（0.1 mol/L HCl）配制及标定：

配制：量取9毫升HCl，加适量水稀释至1000毫升。

标定：精确称取约0.15克左右在270～300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠，加50毫升水使之溶解，加10滴溴甲酚绿-甲基红混合指示液，（量取30ml 0.2%溴甲酚绿乙醇溶液，加入20ml 0.1%甲基红乙醇溶液，混匀）用配制的盐酸滴定至溶液由绿色变紫红色，煮沸2min，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。同时做试剂空白实验。

（2）计算：

C = m

（v-v0）×0.0530

C - HCl标准滴定溶液的实际浓度,mol/L

m - 基准无水碳酸钠的质量,g;

v - HCl标准滴定溶液用量,ml;

vo - 试剂空白HCl标准滴定溶液用量,ml;

0.0530-1.00 ml HCl标准滴定溶液〔C（HCl）=1mol/L〕相当基准无水碳钠g。

0. 01mol/L HCl：精确吸取标定过的0.1mol/L HCl 10 ml，准确稀释至100 毫升。必要时重新标