植物原生质体培养(PPT)
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第九章++植物原生质体培养
（五）复杂有机物
在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物， 可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞 团的形成。 常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解 酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。
二、培养方法
原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为： （一）液体浅层培养
（二）平板法培养
（三）悬滴法培养 （四）固液结合培养法
的压力。
（一）渗透压保护剂
（二应注意的问题
（一）渗透压保护剂
原生质体分离及培养过程中渗透压的调节通常 利用糖或糖醇来控制， 常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗 糖，其中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生 质体分离时最常用的为甘露醇（浓度为 0.23~0.90M）。 有效的渗透浓度决定于原生质体分离期间叶细 胞的渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的 影响，并且能够用暗处理植株和幼叶组织等措施加 以控制。
三、酶处理
1、原生质体分离在很大程度上取决于所用酶的性质 和浓度 ，因此要做好酶种类、处理浓度的选择。 2、酶处理的适宜条件 （1）pH值 酶的活性与pH有关，用于分离原 生质体的大多数酶适宜的PH为4.7-6.0 。 （2）温度 对用来分离原生质体的酶类来说， 最适温度是40~50℃，但分离原生质体时以25~30℃ 为宜。 （3）光照 通常在黑暗或在低光强下分离原生 质体。
（二）应注意的问题
1、在酶处理液、原生质体清洗介质及原生质体 培养基中必须加入合适的渗透压保护剂。 2、原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中 稳定。较高水平的渗透压虽可阻止原生质体破裂， 但影响细胞的代谢、分裂和生长。 3、在分离原生质体时，可以使用电解质渗压剂， 但在原生质体培养时一般不用。 4、当用非电解质为渗压剂时，在酶液中加入某 些盐类，如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾，可以 提高质膜的稳定性。
植物组织培养ppt课件
1946年：罗士韦在菟丝子茎尖培养地观察到花的形成，为试管 受精奠定了基础
1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解 除生长素对芽生长的抑制作用。
ppt精选版
42
1952-1953年：美国科学家Steward F.C. 用胡萝卜根的细胞悬浮 培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完 整植抹，证实了植物细胞全能性学说。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
ppt精选版
43
组织培养的奠基人
植物组织培养是由于人为控制培养条件，
根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同
的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比
较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植 物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于 植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说
成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗
或脱病毒种苗。
细胞全能性的高低：
受精卵>生殖细胞>体细胞
植物细胞>动物细胞
分化程度低的细胞>分化程度高的细胞
细胞分化的实质：基因的选择性表达。
ppt精选版
16
②全能性的表达
少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质, 因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞 核,因而没有全能性。
目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。
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3、 迅速发展阶段（1960-1980）
1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解 除生长素对芽生长的抑制作用。
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1952-1953年：美国科学家Steward F.C. 用胡萝卜根的细胞悬浮 培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完 整植抹，证实了植物细胞全能性学说。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
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组织培养的奠基人
植物组织培养是由于人为控制培养条件，
根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同
的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比
较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植 物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于 植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说
成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗
或脱病毒种苗。
细胞全能性的高低：
受精卵>生殖细胞>体细胞
植物细胞>动物细胞
分化程度低的细胞>分化程度高的细胞
细胞分化的实质：基因的选择性表达。
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16
②全能性的表达
少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质, 因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞 核,因而没有全能性。
目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。
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3、 迅速发展阶段（1960-1980）
植物原生质体培养与体细胞杂交 PPT
常用得 PEG 和高 pH高Ca 相结合诱导融合得 具体操作程序:
混合双亲原生质体悬液,吸一小滴悬液于小 培养皿中,5~15min后原生质体沉到底面形成薄层;
每一小滴悬液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG 溶液得组成:2难度ml 溶液(内含0、1 mol 葡萄糖、 10、5 mmol CaCI2、0、7 mol KH2PO4,KOH调节 pH到 5、5)加1g PEG-1560(或4000、6000,其她浓度)
45%,温度为19-21 度条件下生长得叶片可得到理想得原生
质体。
2、酶得种类
植物细胞壁就是由纤维素(25%~50%)、半纤维 素(50%左右)、果胶质(5%)组成。因此常用三种相 应得酶来降解细胞壁。一般认为纤维素酶和果胶 酶就是必需得,有些材料要加半纤维素酶。
商品酶制剂常含有杂质,对原生质体有不良影响, 有时要纯化。常用得方法就是将酶液在4 oC下过 Bio-Gel P6 或 Sephadex G-25。
3、渗透压得调控
如果溶液得渗透压和细胞内得渗透压不同,原生 质体有可能被涨破或收缩。因此在酶液、洗涤液和 培养液中渗透压应和原生质体内得相等或略大一些。 广泛使用得渗透压调节剂就是山梨醇和甘露醇,此 外还有蔗糖、葡萄糖、和麦芽糖,浓度约在0、40~0、 80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能够提高原生质 膜得稳定性,增加完整原生质体得数目和活力。
6、原生质体得活力鉴定
(1)细胞壁染色法:
荧光增白剂——细胞壁染色剂,既可以鉴定细 胞壁就是否除净,也可检查原生质体细胞壁得再生 情况。染色后在荧光显微镜下观察(360~440nm), 染料与细胞壁形成显眼得绿色荧光,无细胞壁处则 无荧光反应,略带红色。
(2) 原生质体活力得测定:
第八章植物原生质体培养
第八章 植物原生质体培养
一、原生质体的分离 二、原生质体的纯化 三、原生质体的培养方法 四、影响原生质体培养的因素 五、原生质体再生
原生质体： 原生质体：指脱去植物细胞壁 后裸露的、有生活力的原生质团。 后裸露的、有生活力的原生质团。 和植物正常细胞相比，除了没有细 和植物正常细胞相比， 胞壁外，具有活细胞的一切特征。 胞壁外，具有活细胞的一切特征。
封口后，离心， 封口后，离心，原生质体漂浮在上面
用吸管收集原生质体液面， 用吸管收集原生质体液面，放入液体培养基 或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次 或甘露醇悬浮洗涤原生质体 次
将原生质体悬浮在液体培养基中备用
漂浮法的优点： 漂浮法的优点：原生质体纯度高。 缺点：原生质体收率低。 缺点：
3、不连续梯度法 、
（2）酶分离法 ）
两步法： 两步法：
果胶酶处理材料
优点：
所获得的原生质 体均匀一致、 体均匀一致、质 量好； 量好；
游离出单细胞
纤维素酶处理单细胞
缺点：
操作复杂， 操作复杂，已被 淘汰。 淘汰。
分离出原生质体
一步法
外植体
酶液配制：注意纤维素酶、 酶液配制：注意纤维素酶、果胶酶和渗 透压稳定剂（甘露醇）的配比及pH 透压稳定剂（甘露醇）的配比及 酶液离心 过滤灭菌后-20℃ 过滤灭菌后 ℃保存 外植体放入酶液， 外植体放入酶液，真空泵抽引渗透处理 26℃摇床振荡2-8小时 ℃摇床振荡 小时
3、原生质体的分离方法 、
首先对外植体进行预处理，有两种方法： 首先对外植体进行预处理，有两种方法：
低温处理：外植体放在4℃下，黑暗中1-2天。 外植体放在 ℃ 黑暗中 天 等渗溶液处理：外植体放在等渗溶液中数小时。 外植体放在等渗溶液中数小时。
一、原生质体的分离 二、原生质体的纯化 三、原生质体的培养方法 四、影响原生质体培养的因素 五、原生质体再生
原生质体： 原生质体：指脱去植物细胞壁 后裸露的、有生活力的原生质团。 后裸露的、有生活力的原生质团。 和植物正常细胞相比，除了没有细 和植物正常细胞相比， 胞壁外，具有活细胞的一切特征。 胞壁外，具有活细胞的一切特征。
封口后，离心， 封口后，离心，原生质体漂浮在上面
用吸管收集原生质体液面， 用吸管收集原生质体液面，放入液体培养基 或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次 或甘露醇悬浮洗涤原生质体 次
将原生质体悬浮在液体培养基中备用
漂浮法的优点： 漂浮法的优点：原生质体纯度高。 缺点：原生质体收率低。 缺点：
3、不连续梯度法 、
（2）酶分离法 ）
两步法： 两步法：
果胶酶处理材料
优点：
所获得的原生质 体均匀一致、 体均匀一致、质 量好； 量好；
游离出单细胞
纤维素酶处理单细胞
缺点：
操作复杂， 操作复杂，已被 淘汰。 淘汰。
分离出原生质体
一步法
外植体
酶液配制：注意纤维素酶、 酶液配制：注意纤维素酶、果胶酶和渗 透压稳定剂（甘露醇）的配比及pH 透压稳定剂（甘露醇）的配比及 酶液离心 过滤灭菌后-20℃ 过滤灭菌后 ℃保存 外植体放入酶液， 外植体放入酶液，真空泵抽引渗透处理 26℃摇床振荡2-8小时 ℃摇床振荡 小时
3、原生质体的分离方法 、
首先对外植体进行预处理，有两种方法： 首先对外植体进行预处理，有两种方法：
低温处理：外植体放在4℃下，黑暗中1-2天。 外植体放在 ℃ 黑暗中 天 等渗溶液处理：外植体放在等渗溶液中数小时。 外植体放在等渗溶液中数小时。
遗传学ppt课件第4章 原生质体培养及融合配色
优点：可得到较为纯净、完整的原生质体。
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
植物原生质体培养
a Friable embryogenic calli, b suspension cell aggregates, c freshly isolated protoplasts from suspension culture, d protoplasts stained with FDA, e division of cell derived from protoplasts, f cell colonies derived from protoplast, g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose, h green shoot formation, Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye. i fertile green plant
①机械法
早在1892年，克莱若克（Klercker）就已采用机 械法分离原生质体。 方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织， 在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞 壁，从而释放出完整的原生质体。 缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织 和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能 用此法。
①材料准备：植物的幼嫩部分——幼叶、根、下 胚轴，亦可用成熟叶。禾本科用愈伤组织。 ②材料预处理：
叶片萎焉处理——日光下2－8小时 叶片预培养——如羽衣甘蓝诱导愈伤组织 培养基 培养7天后 预先质壁分离——糖溶液中质壁分离
③ 酶解 • • • • • 纤维素酶类（Cellulase） 果胶酶类（Pectolyase） 半纤维素酶类（Hemicellulase） 崩溃酶 蜗牛酶
②酶解法
植物原生质体培养
植物原生质体培养一、目的要求掌握用培养皿进行原生质体的液体浅层培养。
二、基本原理原生质体就是具有细胞质膜而没有细胞壁的植物细胞，具有全能性。
原生质体经过培养后再生出细胞壁就可进行正常的分裂生长与分化。
三、材料、试剂与主要仪器1．仪器与设备培养皿(6cm、9cm)、封口膜、温箱、培养箱、1mL定量移液器、枪头、滴管(近滴头端加入少许脱脂棉)、三角瓶、血球细胞计数器、移液管、洗耳球、无菌滤纸、漏斗、滤器、滤膜、针管(30mL)，光学显微镜、酸度计或pH试纸、电子天平等。
2．试剂（1）原生质体液体培养基MS+2,4-D1mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+葡萄糖0.4mol/L，pH 5.8,灭菌。
（2）酚红（0.1%）：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO3溶液使最终体积为100mL，瓶装保存，备用。
3．材料制备好的菠菜原生质体。
四、实验步骤1．原生质体纯化将菠菜原生质体沉淀重新悬浮于10mL原生质体纯化液中，500rpm 下离心10min，原生质体会在蔗糖溶液的顶部形成一条绿带，用无菌吸管或移液管将原生质体转入另一离心管中。
2．原生质体清洗用原生质体洗涤液（CPW液）重新悬浮原生质体沉淀，1000rpm下离心5min，使原生质体沉淀在试管底，重复清洗一次。
之后加适量原生质体液体培养基悬浮原生质体。
3．活力检查凡具活力的原生质体均呈圆球形，在显微镜下可以观察到明显的胞质环流运动。
在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流运动。
可取一滴原生质体悬浮液放在载玻片上，加一滴0.1%的酚红染液，凡有活力的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即染成红色。
4．密度调整用血球计数板于显微镜下计数，用液体培养基调整使原生质体浓度至105～106个/mL。
5．分装培养将调整密度后的原生质体悬浮液分装到直径6cm的培养皿中，每皿4mL，于28℃下培养，第1d是暗培养，第2～3d光照度为300Lx，以后移至光照度1500～2000Lx 条件下培养。
植物原生质体培养及细胞融合过程
2. 原生质体是各种遗传操作的理想受体， 从而可以进行品种的遗传改良。 可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒， 为高等植物的遗传饰变打下基础。
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不来自太高； 木本植物加入半纤维素酶。
植物原生质体培养及细胞融合过程
◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，
提高原生质体的稳定性植物；原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化；并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
植物原生质体培养及细胞融合过程
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不来自太高； 木本植物加入半纤维素酶。
植物原生质体培养及细胞融合过程
◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，
提高原生质体的稳定性植物；原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化；并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
植物原生质体培养及细胞融合过程
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
原生质体培养-课件
第八章 原生质体培养
目的与要求
掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质 分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植 物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、 产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生 质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植 株的鉴定方法。
具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质 体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。
一般起始密度为5000-10000个/ml，看护培养可降 低培养密度。 3、渗透压稳定剂
在原生质体培养中除用2-3%蔗糖作为稳定剂外， 还使用0.3-0.5mol/l的甘露醇。有的用葡萄糖完全或 部分取代甘露醇，效果也很高。
五、影响原生质体培养的因素
4、培养基成分 1）基本培养基：MS,B5，Nitsch、N6、KM-8P 2）碳源：葡萄糖（大多数用） 3）无机盐浓度和氮形态：无机盐浓度不宜过高，尤 其铵态氮浓度不宜过高。 4）植物生长调节剂的浓度配比：
（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100
（二）测定原生质体的密度 原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）
×104×稀释倍数
四、影响原生质体培养的因素
1、原生质体活力 选择生长健康植株上的外植体，或分裂旺盛的愈
伤组织或悬浮细胞，在酶解处理时酶制剂浓度不要过 高。 2、原生质体起始密度
四、杂种植株的鉴定 1、形态学鉴定 2、细胞学观察 3、DNA内切图谱分析法 4、同工酶分析法
思考题： 1、说明机械分离法和酶分离法的特 点 2、原生质体纯化方法有哪些？原生 质体活力的测定方法有哪些？ 3、简述原生质体五种培养方法及特 点 4、原生质体融合有哪几种方法？
目的与要求
掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质 分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植 物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、 产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生 质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植 株的鉴定方法。
具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质 体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。
一般起始密度为5000-10000个/ml，看护培养可降 低培养密度。 3、渗透压稳定剂
在原生质体培养中除用2-3%蔗糖作为稳定剂外， 还使用0.3-0.5mol/l的甘露醇。有的用葡萄糖完全或 部分取代甘露醇，效果也很高。
五、影响原生质体培养的因素
4、培养基成分 1）基本培养基：MS,B5，Nitsch、N6、KM-8P 2）碳源：葡萄糖（大多数用） 3）无机盐浓度和氮形态：无机盐浓度不宜过高，尤 其铵态氮浓度不宜过高。 4）植物生长调节剂的浓度配比：
（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100
（二）测定原生质体的密度 原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）
×104×稀释倍数
四、影响原生质体培养的因素
1、原生质体活力 选择生长健康植株上的外植体，或分裂旺盛的愈
伤组织或悬浮细胞，在酶解处理时酶制剂浓度不要过 高。 2、原生质体起始密度
四、杂种植株的鉴定 1、形态学鉴定 2、细胞学观察 3、DNA内切图谱分析法 4、同工酶分析法
思考题： 1、说明机械分离法和酶分离法的特 点 2、原生质体纯化方法有哪些？原生 质体活力的测定方法有哪些？ 3、简述原生质体五种培养方法及特 点 4、原生质体融合有哪几种方法？
《原生质体的制备》课件
选取动物组织
选择健康的动物组织作为制备 原生质体的材料。
酶解消化
将动物组织放入酶液中，在适 宜的温度和pH条件下进行酶 解消化。
洗涤和保存
清洗原生质体去除残留的酶液 和其他杂质，然后进行保存备 用。
微生物原生质体制备的步骤
选取微生物菌株
选择生长旺盛、无污 染的微生物菌株作为 制备原生质体的材料 。
成功案例2
在蓝细菌原生质体制备实验中，通过选择合适的酶种类和浓度，以及优化酶解和再生过程，成功制备 出可用于遗传转化实验的原生质体。
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实验过程中的注意事项
1 操作规范
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
2 酶液处理
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
3 离心条件
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
4 温度控制
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
实验后的处理事项
02
原生质体制备的实验材料
植物细胞原生质体制备所需的材料
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括 纤维素酶、果胶酶和离析酶等。
渗透压稳定剂
用于保持原生质体的稳定形态， 常用的渗透压稳定剂包括甘露醇 、山梨醇等。
01
植物组织
用于制备原生质体的材料，通常 选用幼嫩的叶片、茎段或根尖等 部位。
02
03
缓冲液
用于维持细胞内的酸碱平衡，常 用的缓冲液包括Tris-HCl和MES 等。
微生物原生质体制备所需的材料
微生物菌落
用于制备原生质体的材料，可以根据 实验需求选择不同的微生物菌落。
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括溶菌 酶、蜗牛酶等。
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杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体：
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力，因此，必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯（FDA）染色法。
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
叶、幼叶等；处于快速生长期的愈伤组织或 悬浮细胞。对于容易培养、再生能力强的叶 植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等） 也可用完全展开的叶片作材料。
二、 酶解处理
1. 酶解液准备：由于植物细胞壁的主要成 分是纤维素、半纤维素和果胶质组成的， 所以酶解液中一般应含有纤维素酶、半纤 维素酶和果胶酶，浓度为0.5-2.0%。在配酶 解液时可以用原生质体培养基作溶解剂， 也可用专门的溶液（CPW溶液）作溶解剂。
原生质体分布不均匀，易发生原生质体之间 粘连；
原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观 察单个原生质体的生长过程。
2. 固体培养 （平板培养）
含原生质体的固体培养基
35℃左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体 溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼脂或琼脂 糖凝固后，就成一薄层。
进行平板培养时，要注意混合时培养基的温 度。温度高对原生质体的伤害大；温度低，培 养基凝固，原生质体与培养基不能混匀。 特点：原生质体被固定，易观察、统计原生质 体的分裂情况；添加新鲜培养基和转移培养物 比较麻烦。
苜蓿原生质 体分裂
苜蓿原生质体形成细 胞团 6 weeks
8 weeks
苜蓿原生质体 再生植株
转GFP基因的苜蓿原生质体再生植株
夜来香原生质体植株再生
1天
7天
5天 10天
4周
5周
7周
单倍体烟草原生质体 培养与植株再生
杨树原生质体培养植株再生
7000,000cells/g fresh leaves 25000cells/ml; NH4NO3-free MS+5 M 2,4-D+ 0.05 TDZ M . PE: 34.7% at day 14
Tomato-potato hybrid
第二节 原生质体的分离
要进行原生质体培养和操作，就必需 有大量高质量的原生质体。分离原生质 体主要采用酶解法。
酶解法：利用酶降解植物细胞壁而获得原 生质体。酶解法分离原生质体的效率高， 用少量的材料就可以得到大量完整的原 生质体，已成为分离原生质体的最主要 方法。
CPW=Cell-Protoplast Wash Medium
KH2PO4 KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KI
27.2 mg/L 101.0 mg/L 148.0 mg/L 246.0 mg/L 0.16 mg/L
Cu SO4·5H2O 0.025 mg/L
为了保持释放出来的原生质体的活力和膜 稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境 中。因此，酶解液中 必须加入渗透压调节
GFP质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响
GFP=绿色荧光蛋 白
PEG介导的甜橙原生质体转GFP
Sothern杂交分析 PCR分析
3. 体细胞杂交（somatic hybridization）： 由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原 生质体可以相互靠近，发生融合。2种不 同植物体细胞发生融合的过程，称为体细 胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞， 再通过植株再生就可能创造出新的植物个 体。
剂。
常用的渗透压调节剂有葡萄糖、甘露醇和 山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体 用什么浓度，可根据材料的水势来确定。
酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进 行灭菌，并且随配随用。
2. 酶解：将植物材料放入酶解液中、释放 出原生质体的过程。
叶片、幼茎和根等材料要切成小片； 叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心 后再酶解。
原生质体活力（%）=发荧光的原生质 体数/原生质体总数×100
FDA
FDA光素双醋酸酯
细胞核
完整、有活力 的原生质体
第三节 原生质体培养
原生质体制 备好后，用 培养基将原 生质体调至 一定的密度 （最低起始 细胞密度以 上），及时 地进行培养。
在适宜的培养条件下，原生质体数 小时后开始形成新的细胞壁，在显微 镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为 方形、多边形等。约24-36h后，原生 质体开始发生第一次分裂；以后随着 细胞分裂，原生质体就形成细胞团， 进一步诱导出植株。
植物原生质体培养
第一节 原生质体的用途
• 植物原生质体 (protoplast)是 没有细胞壁的 裸露细胞，它 在一些研究方 面具有独特的 优势。
1.原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、 细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程 与机理等问题的良好实验体系。
2. 转基因的良好受体：与外源DNA（如质 粒）共培养时，原生质体可以直接吸收外 源DNA，并整合到染色体上，从而实现 对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株 再生就可得到转基因植物。