小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养

小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养

1、取骨髓，对倍稀释

2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)

3、2000转，离心30分钟

4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液

5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）

6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml

7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）

8、重复两至三次

9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞

离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—

4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮

11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。

参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。即：

1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。

2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。

3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。

4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度

10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。

5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。

6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。

7. 加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF，继续培养至第5天。

8. 半量换液，并补足rmGM-CSF；尽量保留悬浮细胞。

9. 继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-

derived dendritic cell, BMDC)。经鉴定，此时BMDC的纯度可达80%以上。

楼上的cherry_28提供的好像是外周血DC的培养方法。我本人没有培养外周血DC的经验，但培养了2年半的小鼠骨髓DC，有稍许体会。其中体会最深的是：强烈反对初次铺板不到24小时就去除悬浮细胞的做法，我接触的网友中用贴壁时间<48小时而养不出DC不少于15位，而延长贴壁时间就可以大大提供集落形成率。下面是我用上述方法培养的小鼠DC，供朋友们共同讨论。