小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养
小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养及鉴定
源 的未 成 熟 和 成 熟 Ｄ Ｃ．
［ 关键词］树突状细胞 ；小 鼠；近交系 ；骨髓 细胞 ；吞 噬作用
［ 中图分类号］Ｒ ３ ２ ２ ． ２［ 文献标识码］Ａ ［ 文章编号］２ ０ ９ ５ －６ １ ０ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ）１ １ －０ ０ ０ ５ －０ ４
Ｃｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ Ｉ ｄｅ ｎｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄｅ ｎｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｍｏ ｕｓ ｅ Ｂｏ ｎｅ Ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｉ ｎ Ｖｉ ｔ ｒ ｏ
Ｗ ＡＮＧ 一 ｙ ｉ ｎ”， ＣＨＥＮ Ｒｕ ｉ ”， Ｗ ＡＮＧ Ｊ ｕ ｎ ，Ｓ Ｕ Ｘｉ ａ ｏ — ｓ ａ ｎ”， Ｚ ＨＡＮＧ Ｌ ｅ ｉ ”
（ １ ）Ｂ ｉ ｏ ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ，Ｔ ｈ ｅ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｃ ｌｍ ａ ｅ ｔ ｔ ｅ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ ｏ ｆＫｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｋｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ １ １ ； ２）Ｄ ｅ ｐ ｔ ． ｆＡ ｏ ｎ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，Ｔ ｈｅ Ｉ ｓ ｔ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ｔ ａ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｆＫ ｏ ｕ ｎ ｍ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｋｔ ｍｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ ３ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） ［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｅ ｎ ｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＤＣ ） ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍ ａ ｒ ｒ ｏ ｗ
小鼠树突状细胞(DC)培养
8．加入树突细胞培养液重悬细胞，调整细胞数至1×106/ml(Scepter自动细胞计数器,美国Millipore公司)，按2ml/孔接种至12孔细胞培养板（4.5cm2/孔），置37℃、5%CO2孵箱培养。
9．于培养第3，5天每孔分别更换2ml树突细胞培养液。第6天收集悬浮细胞，流式抗体染色后，流式细胞仪检测树突状细胞的表型。
1.4.4 红细胞裂解液pH7.2（1L）：
NH4CL 8.56g
Tris碱 2.059g
MilliQ水定容至1L 调节pH至7.2
1．处死BALB/c小鼠并浸泡于75%医用酒精10min，随后取小鼠股骨及胫骨并用眼科剪剔除附着在骨骼上的肌肉。
2．剪掉两侧股骨头，将吸满PBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗骨髓腔，直至骨变白。
3．将收集到的骨髓细胞悬液500×g离心5mim，弃上清。
4．向骨髓细胞沉淀中加入红细胞裂解液并反复吹打混匀，置37℃孵箱孵，吸弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，200钼铜网过滤除去骨髓细胞悬液中组织碎块。
6．用1ml PBS缓冲液重悬细胞，加入功能纯化抗体抗-小鼠CD4/CD8a/ MHC-Ⅱ/CD45R及兔血清补体，37℃孵育1h，以去除T淋巴细胞、B淋巴细胞及MHC-Ⅱ+细胞。(功能纯化抗体抗-小鼠 CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD45R(B220)、MHC-Ⅱ（I-A/I-E）抗体购自eBioscience公司)
bmdc培养方法
bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。
以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。
将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。
将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。
3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。
此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。
在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。
此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。
4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。
将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。
将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。
5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。
用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。
用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。
总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。
一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法
专利名称：一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法专利类型：发明专利
发明人：国林沛,解晖,杨宪法,王准,彭双鹤,唐慧琴
申请号：CN202111468217.1
申请日：20211203
公开号：CN114058585A
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞培养领域，特别是小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的原代培养。
该细胞培养步骤，包括：步骤A：获取小鼠完整的股骨；步骤B：获取股骨中的骨髓干细胞；步骤C：将骨髓干细胞接种于细胞培养板中，并加入细胞因子，刺激分化为树突状细胞。
本发明提供了一种经济高效的培养小鼠骨髓来源树突状细胞的方法，数十分钟即可获得大量的骨髓干细胞，加入少量的细胞因子培养6‑8天即可获得2×107以上成熟的树突状细胞。
申请人：无锡市第二人民医院
地址：214001 江苏省无锡市梁溪区中山路68号
国籍：CN
代理机构：天津佳盟知识产权代理有限公司
代理人：林玉慧
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小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF 至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
小鼠骨髓及脾脏来源的树突状细胞培养及鉴定
Ｃ Ｆ 和 白细 胞 介 素 （Ｌ ４ 协 同 诱 导 下 培 养 ， Ｓ） Ｉ－ ） 光镜 下 观 察 Ｄ 的 形 态 ， 式 细 胞 仪 检 测 Ｃ ８ 、 Ｄ ６表 达 水 平 。结 果 Ｃ 流 Ｄ ０Ｃ ８ 骨髓 细 胞 体 外 诱 导 培 养 ３天 后 ， 镜 下 显 示 细 胞 表 面 不 规 则 ， 树 突 状 突 起 ， 光 呈 可见 典 型 的 树 突 状 细 胞 形 态 ， 表 达 共 刺 低 激分 子 （ Ｄ ０Ｃ ８ ） Ｃ ８ ， Ｄ ６ 。结 论 与 脾 脏 细 胞 相 比 ， 髓 细 胞 中不 仅 富 含 大 量 的 ＤＣ的 前 体 细 胞 而 且 诱 导 成 ＤＣ时 间 短 。 骨 关 键 词 ： 突状 细 胞 ； 髓 ； 脏 ； 树 骨 脾
ｄ ｔ ｃ ｅ ｗｉｈ ｆｏ ｅｅ ｔｄ ｔ ｌ ｗ ｃ ｔ ｙ ｏｍｅ ｒ ｔ ｙ．Ｒｅ ｕ ｔ ｂｏ ｍ ａ ｒ ｓ ｌｓ ｎｅ ｒｏｗ ｃ ｌｓ ｐｐ ａ ｅ ｉｒ ｇｕｌｒ ａ ｏｒ ｅ ｎ ｉｉ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ａ ｔ ｒ ｅ ｌ ａ ｅ ｒ ｄ ｒ ｅ ａ ｎｄ ｆ ｍ ｄ ｄｅ ｄｒｔｃ ｏｃ ｓ ｅ ｆｅ ３
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bmdc细胞提取步骤
bmdc细胞提取步骤BMDC（骨髓源性树突状细胞）的提取步骤通常包括以下几个步骤：1.准备工作：a.高效细胞培养基：根据实验要求选择适合的培养基，常见的包括RPMI-1640培养基、DMEM等。
b.包含20%胎牛血清（FBS）的细胞培养基。
c.手术器械：包括手术刀、剪刀、镊子和注射器等。
d.消化酶：常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。
e.细胞培养条件：包括恒温恒湿的细胞培养箱以及含5%CO2的细胞培养箱。
2.动物准备：a.选择符合实验要求的动物（常用小鼠）。
b.按照实验室动物管理规定进行麻醉和安乐死操作。
c.用70%乙醇对动物表面进行消毒。
3.BMDC提取：a.彻底消毒动物表面后，在操作实验纸上将动物放置在耳板的背面。
b.使用消毒的剪刀和镊子，从动物的骨髓中提取骨骼。
c.将提取的骨骼置于含有培养基的试管中，并用注射器吸入10mL的培养基，将髓腔彻底清洁。
d.将清洗后的骨骼放在含有培养基的培养皿中，在恒温恒湿的培养箱中孵育24小时。
4.BMDC筛选和分离：a.24小时后，将培养皿中的骨骼取出，用胰蛋白酶和胶原酶进行胶原酶消化处理。
b.消化结束后，用细胞培养基将胶原酶停止消化，并通过筛选筛除未消化的骨骼颗粒。
c.将筛选后的纯化细胞放入含有培养基的96孔培养板中，每孔种植一定数量的细胞。
d.将种植后的培养板放入恒温恒湿的培养箱中进行细胞培养和观察。
5.细胞培养和扩增：a.用培养基进行细胞培养，每2-3天更换一次培养基。
b.确保培养皿内有适当的氧气和营养物质。
c.观察细胞的生长情况，密度达到一定程度后，用胰蛋白酶进行细胞裂解。
d.细胞数目达到要求后，用所需的方式进行实验或培养。
BMDC的提取过程需要严格的操作和分离步骤，确保获取纯化的树突状细胞，这对进一步的实验研究是非常重要的。
小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存
中国组织工程研究与临床康复第14卷第45期 2010–11–05出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research November 5, 2010 Vol.14, No.45 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH8455 Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,ChinaZhu Guo-hui★, Studying for master’s degree, Departmentof Urinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrzhugh@hotmail.com Correspondence to:Liu Xiu-heng, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrliuxh@Supported by: the National Natural Science Foundationof China, No. 30672107*Received: 2010-05-01 Accepted: 2010-06-30小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存*★朱国辉，翁小东，刘修恒，匡幼林Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cellsZhu Guo-hui, Weng Xiao-dong, Liu Xiu-heng, Kuang You-linAbstractBACKGROUND: Dendritic cell is an ideal carrier of tumor antigen due to the presenting function and the promotion of T cell proliferation. How to obtain large numbers of dendritic cells is important for producing tumor vaccine.OBJECTIVE: To induce, culture, amplify and cryopreserve dendritic cells derived from mouse bone marrow, then compare the biological characters of cryopreserved dendritic cells with the fresh dendritic cells, than find an effective method to obtain and store large numbers of dendritic cells.METHODS: Dendritic cells from mouse bone marrow cells were induced, cultured and amplified in complete medium with recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rmGM-CSF) (10 μg/L) and recombinant mouse interleukin 4 (rmIL-4) (5 μg/L). On day 6, the dendritic cells were frozen in complete medium with dimethyl sulphoxide. After thawing, lipopolysaccharide was added to induce the maturation. At last, large number of mature dendritic cells was obtained. Then the viability, morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction were compared between the thawed cells and fresh cells.RESULTS AND CONCLUSION: After thawing, the recovery rate of cells was (82.2±4.73)%. The survival cells became mature dendritic cells induced by lipopolysaccharide. Compared with fresh dendritic cells, there was no significant difference in morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction. Results suggest that there was no significant difference in biological characters between frozen-thawed dendritic cells and fresh dendritic cells. To store dendritic cells through cryopreservation can avoid repeating culture in different times and can obtain large numbers of dendritic cells.Zhu GH, Weng XD, Liu XH, Kuang YL.Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(45): 8455-8459. [ ]摘要背景：树突状细胞因其良好的抗原提呈功能及促T细胞增殖功能，成为肿瘤抗原的良好载体。
小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定
小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【摘要】To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells ( DC) from mouse bone marrow in vitro and observe their morphology, recombinant mouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor( GM-CSF) and interleukin-4( IL4) induction were used to induce mouse bone marrow cells to form dendritic cells in vitro. After 9 days , the percentage of the cultured DCs was more than 80％ with typical morphology of DCs under light microscope. The mature cells had clear marker on their surface. This meant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.%用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,进行形态学变化观察,分析细胞表面分子,刺激T细胞增殖,探讨小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)体外诱导培养并进行初步鉴定.体外培养9d后BMDC可达80%以上m,光镜下可见典型的树突状细胞形态.清楚表达成熟期主要表面标志物,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖.获得了较高纯度的BMDC,避免了使用传统磁珠分离方法所带来的成本高,操作复杂,产出率低的弊端,为研究BMDC功能以及运用开展下游实验提供材料.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)002【总页数】4页(P25-27,31)【关键词】树突状细胞;体外诱导培养;初步鉴定【作者】刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【作者单位】儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地【正文语种】中文【中图分类】Q813.5Abstract:To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells(DC)from mouse bone marrow in vitro and observe theirmorphology,recombinantmouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor(G M-CSF)and interleukin-4(I L4)induction were used to inducemouse bonemarrow cells to for m dendritic cells in vitro.After9 days,the percentage of the culturedDCswasmore than 80%with typicalmorphology ofDCs under lightmicroscope.The mature cells had clearmarker on their surface.Thismeant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.Keywords:dendritic cells;culture in vitro;initial appraisal树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种专职性抗原提呈细胞,在肿瘤、抗感染免疫、移植排斥等方面起着关键的引导和调节作用,并能显著激活初始型 T淋巴细胞并诱导其增殖,处于免疫应答过程的中心环节。
bmdms培养方法
bmdms培养方法
BMDMS是指骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages）。
它们是一种重要的免疫细胞，常被用于研究免疫学、生物学和疾病模型等方面。
下面我将从多个角度介绍BMDMS的培养
方法。
1. 材料准备。
常用培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）或RPMI 1640培养基，其中含有10%胎牛血清（FBS）或去
血清培养基，还有抗生素如青霉素/链霉素。
2. 培养骨髓细胞。
首先需要从小鼠或大鼠的骨髓中分离细胞。
通常使用灭菌的
方式，将小鼠或大鼠的胫骨和腓骨取出，用培养基冲洗骨髓腔，将
细胞悬浮液通过滤网筛选，得到单个的骨髓细胞。
3. 培养和分化。
将分离得到的骨髓细胞接种在培养皿中，培养基中含有巨噬细胞分化因子如M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）。
细胞培养在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，每隔2-3天更换一次培养基，培养7-10天左右，即可得到成熟的BMDMS。
4. 细胞纯化。
有时为了得到更纯净的BMDMS，可以利用差速贴壁法（adherence method）或密度梯度离心分离等技术进行细胞纯化。
总之，BMDMS的培养方法是一个复杂而精细的过程，需要严格控制培养条件和培养基的配方，以确保得到高质量的巨噬细胞。
同时，培养过程中的细胞分化、纯化等步骤也需要根据具体实验的要求进行调整和优化。
希望以上信息能够对你有所帮助。
香菇多糖对小鼠骨髓树突状细胞表型和功能的影响
香菇多糖对小鼠骨髓树突状细胞表型和功能的影响胡婷婷;孟一鸣;单风平【摘要】通过研究香菇多糖(Lentinan,LNT)对小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)功能调节的机制,进一步阐明香菇多糖的免疫活性.本实验将BMDCs分成脂多糖(LPS)阳性对照组、LNT处理组和RPMI1640空白对照组,应用酸性磷酸酶活性检测、流式细胞仪检测技术、吞噬实验、酶联免疫吸附试验检测各组BMDCs表型和功能的各种指标.结果显示,LNT(50 μg/mL)处理组BMDCs酸性磷酸酶活性降低;BMDCs吞噬能力比RPMI1640空白对照组明显下降;BMDCs表面MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205的表达增加;BMDCs白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达增加.证明了适宜浓度的LNT可以促进BMDCs表型及功能的成熟.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2014(034)002【总页数】5页(P54-58)【关键词】香菇多糖;骨髓树突状细胞;表型;功能成熟【作者】胡婷婷;孟一鸣;单风平【作者单位】中国医科大学免疫学教研室,辽宁沈阳 110001;中国医科大学免疫学教研室,辽宁沈阳 110001;中国医科大学免疫学教研室,辽宁沈阳 110001【正文语种】中文【中图分类】Q939.93;R392香菇多糖(Lentinan，LNT)是香菇子实体提取物中的主要有效成分之一，是1969年 Chihara等［1］首次从香菇中分离出的具有抗肿瘤活性的多糖。
研究发现，LNT具有多种药理学作用，是一种兼有抑制肿瘤和提高免疫功能的多糖类生物反应调节剂［2］。
LNT可以增强巨噬细胞的吞噬功能，激活T淋巴细胞释放活化因子，提高NK细胞活性，诱导干扰素或白细胞介素等细胞因子的产生［3］。
树突状细胞(dendritic cells，DCs)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，具有独特的抗原递呈和激活功能;作为免疫反应的核心和关键，在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用［4］。
树突状细胞培养方法
2.2.4 小鼠骨髓源性树突状细胞的培养1）颈椎脱位法处死健康雄性4到6周龄的BABLIc小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。
2）无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剥离附着的肌肉软组织后浸泡在75%乙醇中2分钟。
RPMI1640冲洗，剪开骨的两端，1 ml 注射器抽取RPMI1640，分别从骨两端插入骨髓腔反复冲洗直至变白，RPMI1640清洗骨髓细胞后重悬。
3）在离心管中预先加入小鼠脾淋巴细胞分离液，将相同体积的骨髓细胞悬液小心加入淋巴细胞分离液上层，不打乱两层液体界面。
4）4℃，1500rpm离心7min后吸取中间白膜层，PBS清洗所获的单个核细胞。
5）BMDC完全培养液重悬后，以2×106每孔的浓度分种至6孔培养板中，每孔4ml完全培养基。
6）将细胞培养板放入37℃，含5%CO2的培养箱中培养6小时。
7）弯头滴管轻轻吹打，连同培养液一起弃去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞；加入新鲜完全培养基和500 U/ml的rmGM-CSF及rmIL-4继续培养。
8）隔日半量换液，补加相同浓度细胞因子，尽量保留悬浮细胞。
9）培养至第6天，轻轻吹打收集所有悬浮细胞，即为未成熟的BMDC。
10）诱导培养过程中每天观察细胞集落及形态变化并拍照。
11）流式检测所诱导的未成熟BMDC表面分子CD11c的表达以评估BMDC 的纯度。
收集培养至第6天的BMDC，PBS洗2次，1×106个细胞用冷的Buffer （PH7.2的PBS+150mMNacl+ 0.09%NaN3+0.2%BSA）100µL悬浮。
加入3µL FITC-CD11c，对照管加入PBS，4℃冰箱避光反应45min。
Buffer洗2次，弃上清，500µL 1%多聚甲醛固定。
送第四军医大学流式细胞室上机检测。
小鼠骨髓源树突状细胞制备
试验研究 | Experimental research0 引言1973年Steinman和Cohn首次分离出一类同巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞形态与功能不同的细胞，命名为树突状细胞(DCs)。
其主要来源是骨髓CD34+多能造血干细胞，是体内唯一能直接激活初始T细胞的抗原提呈细胞(APC)[1]，是机体免疫的始动者及固有免疫和适应性免疫的桥梁。
髓系树突状细胞通过血液与淋巴液从骨髓移动并分布到皮肤，后趋向淋巴组织启动免疫反应。
淋巴系树突状细胞是T细胞集聚区的固定哨兵，分布主要局限在胸腺髓质及淋巴结T细胞区，具有免疫调节和免疫耐受作用。
当抗原性物质侵入机体时，宿主体内的免疫系统会启动一系列免疫防卫机制识别并清除病原体，特异性免疫应答启动前，需要APC摄取、加工、处理抗原并将抗原信息提呈给免疫应答的淋巴细胞。
主要组织相容性复合物（MHC）是一段基因密度高的染色体区段，是一种复杂且多态性高的遗传系统。
主要存在2个途径即溶酶体途径（MHC-Ⅱ类途径）和胞质溶胶途径（MHC-Ⅰ类途径）。
另外，还存在MHC非依赖性的抗原提呈途径，称为CD1分子提呈途径。
DCs的成熟经历前体期、幼稚期及成熟期3个时期。
开始由骨髓进入血液循环，随后到达靶组织或器官，停留在潜在抗原物质出现位置，主要有MHC-I型和MHC-II型2种抗原提呈途径。
成熟DCs生物学特征有：能有效活化初始T细胞，有效摄取和处理抗原，CD80和CD11c可作为成熟DCs的标志，成熟DCs能启动免疫应答、释放干扰素等细胞因子等。
DCs 能摄取抗原并将其加工处理成能够被T细胞识别的多肽段。
T细胞受体特异性识别抗原肽-MHC分子复合物，刺激T细胞活化，进而启动胞内信号转导，诱导细胞增殖和分化有关基因的表达。
成熟T细胞主要包括CD4+T细胞（辅助T细胞）和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）2个亚群。
免疫应答中，辅助T细胞最先激活，并释放细胞因子，激活巨噬细胞，诱导CTL成熟，促进细胞免疫应答，辅助B细胞产生抗体等。
小鼠骨髓源性树突细胞的体外优化培养及其生物学特性鉴定
１２）、白细胞介 素 一１０（ＩＬ一１０）］分泌及诱导 Ｔ淋 巴细胞 的增殖能 力等进 行鉴定 。结果 镜下观 察细胞 有 明显 的
不规则枝 状突起 ，有典 型 ＤＣｓ形态特征 。流式结 果显示 细胞 纯度 为 ７７．４％左右 ；经 ＬＰＳ刺激 后树 突细胞 ＣＤ８６、
ＭＨＣ ｌＩ的比例 均明显增加 （Ｐ＜０．００１）；ＥＬＩＳＡ结 果显示与 对照组 相 比，ＬＰＳ刺激组 ＩＬ一１２、ＩＬ一１０的含量 明显增
续培 养 ，４８ ｈ收集上清 细胞 离心后种于 ６孔板 中以上培养基继续培养 ，９６ ｈ后换液处理 ，第 ８天时添加 ＬＰＳ刺 激作
为 ＬＰＳ刺激组 ，未添加 ＬＰＳ作为对照组 ，结合流式细胞仪 （ＦＣＭ）、酶联免疫 吸附技术 （ＥＬＩＳＡ）等从 细胞形 态 、表 面
分子 ［Ｂ７—２分子 （ＣＤ８６）］及主要组织相容性 复合 体 Ⅱ（ＭＨＣⅡ）的特异 性表达 、相关 因子［白细胞介 素 一１２（ＩＬ一
【关键词】 树突细胞；体外优化 ；生物学特性
【中图分类号 】Ｒ２８５．５
【文献标 识码 】Ａ
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍ ａｒｒｏｗ ——ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅｉｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍ ｉｃｅ
· ４８２ ‘
世界中西 医结合杂志 ２０１８年第 １３卷第 ４期 ｗ。ｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ。ｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１８，Ｖｏ１．１３，Ｎｏ．４
实 验 研 究 ·
小 鼠骨髓 源性 树 突 细胞 的体 外 优 化 培 养 及 其 生 物 学 特 性 鉴 定
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞提取及培养小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
小鼠骨髓来源树突状细胞对T细胞的活化作用
小鼠骨髓来源树突状细胞对T细胞的活化作用王荣朝;吴雨岗【期刊名称】《江苏医药》【年(卷),期】2008(34)3【摘要】目的从小鼠骨髓中体外诱导、扩增树突状细胞(DCs),检测DCs对T细胞的活化作用.方法从小鼠骨髓中分离单个核细胞(MNCs),在重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落因子(rmGM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导下培养扩增DCs.光学显微镜观察其形态特征,流式细胞仪分析其表型特征,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力.结果 MNCs经过rmGM-CSF、IL-4和TNF-α诱导培养12 d后,具有典型的DCs形态,高表达MHCⅡ类分子、CD11c、CD80、和CD86抗原.具有极强的激发刺激同种异体T细胞增殖的能力.结论体外诱导、扩增DCs具有极强的激发刺激同种异体T细胞增殖的能力.【总页数】2页(P275-276)【作者】王荣朝;吴雨岗【作者单位】213000,常州市第一人民医院普通外科;213000,常州市第一人民医院普通外科【正文语种】中文【中图分类】R363【相关文献】1.CpG-ODN促进小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟作用的实验研究 [J], 聂志林;靳风烁;梁培禾;叶锦2.小鼠骨髓来源树突状细胞吲哚胺2,3-过氧化酶表达对T细胞增殖的影响 [J], 韩澍;王全兴;李咏梅;王慕;张明刚;闵志廉3.氧化型低密度脂蛋白对C57BL/6J小鼠骨髓源性树突状细胞趋化作用和成熟活化的影响 [J], 许增祥;杨永宗;唐雅玲;彭茜;彭旷;夏妍;何钒;李方;王双4.落新妇苷对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及免疫功能的抑制作用 [J], 宋少华;沈筱芸;丁国善;刘芳;王振猛;傅志仁5.小鼠脾来源树突状细胞与NS_1骨髓瘤细胞融合体的抗肿瘤作用 [J], 赵明耀;张义国;董子明;杨洪艳;郑智敏;陈宁;黄幼田;郑光因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠树突状细胞的体外扩增培养及形态观察
小鼠树突状细胞的体外扩增培养及形态观察肖景莹;蔡连顺;阎冬梅;毕胜;齐宗春【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2006(029)004【摘要】目的:建立体外诱导和扩增小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)的方法,并进行形态学观察.方法:将健康小鼠股骨骨髓细胞分离,去除悬浮细胞,贴壁细胞中加入细胞因子(IL-4和GM-CSF)继续进行培养,2周后,诱导的DC经相差显微镜和透射电镜进行观察.结果:培养的DC表面有几个大而长的突起,具有DC的典型形态学特征.结论:小鼠骨髓细胞经贴壁处理后,加入细胞因子(IL-4和GM-CSF)进行培养是可行的,采用这种方法能获得大量较高纯度的具有典型形态特征的DC.【总页数】2页(P8-9)【作者】肖景莹;蔡连顺;阎冬梅;毕胜;齐宗春【作者单位】佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007;佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007;佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007;佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007;佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007【正文语种】中文【中图分类】Q343.6;R329.2+4【相关文献】1.小鼠脾脏来源树突状细胞的体外扩增培养 [J], 李宗辉;黄军华;刘俊峰;赵要顺2.小鼠脾脏来源树突状细胞的体外扩增培养 [J], 黎辉;曹宇皎;黄军华;刘俊峰3.感染伯氏疟原虫的小鼠树突状细胞体外扩增培养及形态观察 [J], 肖景莹;蔡连顺;代月;车世伟;齐宗春;毕胜4.成熟树突状细胞和转化生长因子β联合体外扩增小鼠调节性T细胞 [J], 范莎莎;罗荣城;段华新;石詠中;袁友红;肖佩玲5.小鼠脾脏树突状细胞的体外扩增与培养 [J], 成建平;黄军华;王杰;韩超因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法
基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法郑磊;顾春瑜;王前;包杰;裘宇容【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2005(009)035【摘要】目的:通过建立简单经济的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法,比较不同成熟状态下树突状细胞生物免疫学特性的变化.方法:实验于2004-07/2005-06在南方医院检验医学中心完成.①取C57B/L小鼠骨髓细胞作为树突状细胞的前体细胞.将培养的树突状细胞分成两组,未成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4诱导);成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4+脂多糖),每天光镜观察各组细胞生长情况.第6天收集细胞,其形态采用电镜观察.②两组树突状细胞表型分析采用流式细胞仪分析.③取BALB/c小鼠脾脏细胞,分离T细胞作为反应细胞.用两组树突状细胞作为刺激细胞.按刺激细胞与反应细胞1:5,1:10,1:20,1:40的比例混合培养,并用T细胞悬液作阴性对照,观察混合淋巴细胞反应情况.结果:①树突状细胞培养的光镜观察:未成熟树突状细胞多为圆形,少量菌幕样突起;脂多糖刺激后,树突状细胞呈悬浮状态,表面较多细长突起.②树突状细胞电镜观察结果:扫描电镜示未成熟树突状细胞表面皱褶和较少的毛刺;成熟树突状细胞表面大量树枝状细长突起.透射电镜示未成熟树突状细胞形态较规则,突起较少,胞浆内有许多吞饮泡及多泡体;成熟树突状细胞形态不规则,胞内囊泡结构减少,细胞器较丰富,细胞核偏向一侧,表面有细长树枝状突起.③各组树突状细胞表型分析:未成熟树突状细胞表面中度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子,低水平表达CD40,CD86和CD25;成熟树突状细胞表面高度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子,高水平表达共刺激分子.④混合淋巴细胞反应:未成熟树突状细胞只能轻度刺激同种T细胞增殖;成熟树突状细胞能够刺激T细胞大量增殖.结论:采用重组小鼠粒-巨集落刺激因子和白细胞介素4联合诱导骨髓前体细胞可在体外培养出大量未成熟树突状细胞,低表达共刺激分子,体外诱导同种T细胞增殖能力较弱,呈现耐受性树突状细胞特性,有望应用于移植排斥反应及或自身免疫疾病的生物治疗.【总页数】4页(P102-105)【作者】郑磊;顾春瑜;王前;包杰;裘宇容【作者单位】南方医科大学南方医院检验医学中心,广东省广州市510515【正文语种】中文【中图分类】R33-33【相关文献】1.小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建 [J], 刘振明;胡何节;方征东;王晓天;孙小杰;葛新宝2.小鼠骨髓来源调节性树突状细胞的体外诱导分化及鉴定 [J], 王进京;袁晶华;乔磊;刘义;张晓宁;李克秋;李光3.五种植物粗多糖诱导小鼠骨髓来源树突状细胞成熟的体外筛选 [J], 董晓筱;李博野;张季瑶;陈颖;胡秦;彭博4.小鼠骨髓浆细胞样与髓样树突状细胞的体外培养及对比研究 [J], 谭剑峰;李东方;郭权威;况军;张建华5.布鲁菌M5侵染小鼠骨髓源性树突状细胞后抗原肽的筛选 [J], 张凡;高剑峰;周永顺;陈福龙;李刚;何营;韩凯;孟凡则;李婷婷;刘子超因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养
1、取骨髓，对倍稀释
2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)
3、2000转，离心30分钟
4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液
5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）
6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml
7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）
8、重复两至三次
9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞
离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—
4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮
11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：
1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度
10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。
7. 加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF，继续培养至第5天。
8. 半量换液，并补足rmGM-CSF；尽量保留悬浮细胞。
9. 继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-
derived dendritic cell, BMDC)。
经鉴定，此时BMDC的纯度可达80%以上。
楼上的cherry_28提供的好像是外周血DC的培养方法。
我本人没有培养外周血DC的经验，但培养了2年半的小鼠骨髓DC，有稍许体会。
其中体会最深的是：强烈反对初次铺板不到24小时就去除悬浮细胞的做法，我接触的网友中用贴壁时间<48小时而养不出DC不少于15位，而延长贴壁时间就可以大大提供集落形成率。
下面是我用上述方法培养的小鼠DC，供朋友们共同讨论。