第八节 疏水层析法
疏水层析标准操作规程
疏水层析标准操作规程疏水层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
下面是疏水层析的标准操作规程，供参考：一、实验前的准备工作1. 根据实验目的，选择合适的疏水相和适宜的反相色谱柱，并进行校准。
2. 配制高纯度的溶剂，保证溶剂的质量，并按照方法要求调节溶剂的pH值。
3. 确保色谱仪及其相关设备准备就绪，包括流速泵、样品自动进样器、检测器等。
二、样品的处理1. 准备样品溶液，并通过过滤或离心将悬浮物去除，以保证样品的纯度。
2. 根据样品特性选择合适的提取方法，如溶剂萃取、固相萃取等。
3. 根据实验要求，进行必要的前处理，如稀释、酸化、碱化等。
三、系统的初始设置1. 对色谱系统进行初始设置，包括流速、检测器的温度、波长等。
2. 开始预洗柱，选择合适的洗柱溶剂，将样品进样口与引入口连接，设置洗柱时间。
四、方法的优化和验证1. 选择合适的进样量和洗柱时间，确定最佳的色谱条件。
2. 根据样品的复杂程度，适当调整固定相的选择和柱温。
3. 针对不同样品进行方法验证，包括线性度、准确度、精密度等指标的验证。
五、正式实验过程1. 将样品进样器与色谱仪连接，并设置好进样量和进样速度。
2. 开始注入样品，根据方法要求选择适当的流速，并同时进行监测。
3. 在实验过程中，密切注意流速、柱温和检测器的响应。
六、数据处理和结果分析1. 对实验结果进行数据处理，包括峰面积的计算、峰高的测量等。
2. 根据标准曲线或参考物质进行定量分析，计算样品中目标物质的含量。
3. 分析结果的统计学处理，包括平均值、相对标准偏差等指标的计算。
七、实验结束后的工作1. 关闭色谱仪及相关设备，清洁色谱柱和进样器，并存储在适当的环境中。
2. 处理实验废液和废物，保证环境安全和实验室的整洁。
3. 归档实验数据和结果，记录实验过程中的问题和改进方向。
疏水层析标准操作规程需要根据具体实验目的和方法要求进行调整，上述只是一个基本的操作指南，希望对您有所帮助。
第8章 疏水层析
第八章 疏水层析
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.2 流动相 流动相Ph
• 行为复杂；
• 多数情况下pH升高会减弱疏水作用，反之则增加；
• 洗脱时可不断提高Ph。
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8.1.1.1 什么是疏水性、疏水作用？
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常小 ，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)，这些非极性的分子在水相环境中具有 避开水而相互聚集的倾向，称为疏水作用。
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盐类的存在对蛋白质的疏水作用起道非常重要的作用。 • 高盐时，盐离子夺取疏水分子周围的水分子，疏 水区域受到水分子的挤压力减弱，疏水区域的面 积增大，促进蛋白质疏水区域与介质间的疏水作 用（更有效地与介质上的疏水基团结合）；
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8.2.2 常见疏水作用介质的种类
烷nhui University of Technology and Science
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
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二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
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疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
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4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
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5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
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三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
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四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水作用层析
疏水作用层析实验概要通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
实验原理疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。
主要试剂1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.03. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO44. 蛋白质样品溶于溶液B主要设备层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计实验步骤1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析是一种常用的色谱分析技术，其原理基于样品分离时固定相与移动相之间的亲疏水性差异。
疏水层析中，固定相通常是一种非极性材料，如疏水性树脂或疏水性硅胶。
移动相则是一种有机溶剂，如甲醇或乙腈，其疏水性介于固定相和要分离的样品之间。
在疏水层析柱中，样品溶液由于亲疏水性差异而与固定相发生不同程度的相互作用。
亲疏水性强的物质会与固定相发生较强的相互作用，停留时间相对较长，而亲疏水性弱的物质则会较快地通过固定相，停留时间较短。
疏水层析的分离原理可解释为两种相互竞争的作用力。
一方面，固定相表面具有较大的亲疏水性，使得亲疏水性强的物质更容易与其发生相互作用，并在固定相上停留。
另一方面，移动相中的有机溶剂对固定相表面也有一定的亲疏水性，这种亲疏水性决定了溶剂与固定相之间的相互作用力。
当亲疏水性强的物质进入移动相后，相互作用力较弱，从而更容易通过固定相。
在实际应用中，疏水层析常用于分离极性较强的化合物，如多肽、核苷酸、脂肪酸等。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
总而言之，疏水层析利用样品与固定相之间亲疏水性差异实现分离。
疏水性强的物质在固定相上停留时间较长，而疏水性弱的物质则更容易通过固定相。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
疏水层析填料
2008-6 Volume 8疏水层析填料疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。
影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。
疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。
结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。
通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。
然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。
Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。
在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）色谱柱：8.2 x 150 mm柱体积：8 ml流动相：2.0 – 0.0MAmmonium Sulfatein 0.01M phosphate, pH 7.0流速：1.32 ml/min样品：5 mg/3 ml– 100 µl2008-6 Volume 8Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱）Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。
Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。
与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。
疏水作用层析
疏水作用层析1. 疏水层析的原理：疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
由于蛋白质是一类有序三维结构的活性大分子，但其空间排列很容易受到外界环境的影响，极易从有序的结构变成无序结构。
当立体结构发生变化时，常常失去原有的活性，即蛋白质的失活。
使用适度疏水性的分离介质，在含盐的水溶液体系中，借助于分离介质与蛋白质分子之间的疏水作用达到吸附活性蛋白分子的目的，这种层析技术称为疏水作用层析。
蛋白质的一级结构中有很多非极性氨基酸，这些氨基酸在三级结构上由于疏水相互作用会被尽量包在分子内部，但是仍不可避免地有一些非极性侧链暴露在表面，这些非极性的表面是它和疏水层析介质作用的结合部位。
因为蛋白质分子的疏水性不同，它们和疏水层析介质的作用力强弱也不同，所以非极性表面的大小和含量决定了蛋白质分子的疏水性强弱。
疏水层析就是利用各种蛋白质分子和疏水功能基团之间作用力的差异对蛋白质进行分离、纯化的一种技术。
蛋白质可以看成是一种有亲水性外壳包裹着疏水性核心的四级结构的复杂体系。
蛋白质表面存在一些非极性的疏水基团，这些基团多为非极性的氨基酸残基。
由于各种基团疏水性的差别、疏水基团暴露数量的不同、疏水区与亲水区在数量、大小和分布的不同等因素，使各种蛋白质之间存在较大的差异，同时，对于同一种蛋白质在不同的溶液中，使疏水基团暴露的程度也呈现出一定的差异。
由于这种差异，致使各种蛋白质分子与同一种分离介质疏水基团的相互作用不同，吸附能力不同，可以达到分离的目的。
如果在水溶液中加入中性盐，使溶液处于高盐浓度时，可以破坏蛋白质分子表面水分子的有序排列，使大分子与分离介质的功能基团之间产生疏水作用。
同时，由于高盐的存在，使蛋白质分子的疏水基团暴露增多，增加了大分子的疏水性，增强了蛋白质分子与分离介质功能基团之间的疏水作用，相互结合力增强。
疏水作用层析法蛋白质纯化实验原理及步骤
疏水作用层析法(蛋白质纯化实验)原理及步骤原理在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。
当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。
这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。
苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。
疏水相互作用介质苯基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-C6H5辛基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-(CH2)7-CH3溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。
因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。
所以在硫酸镂沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析纯化。
温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置(10~100mg∕m1)使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。
材料与仪器蛋白质样品液苯基琼脂糖C1-4BNaC1硫酸铉磷酸钠盐层析柱步骤下述方案设定样品是在75%硫酸镂沉淀后溶在50%硫酸镂溶液的情况。
1.装填5m1苯基琼脂糖C1-4B进入柱内；2.10倍柱床体积层析缓冲液(20mmo1∕1,PH7.0磷酸钠盐，50%硫酸钱)洗柱；3.调整样品液符合要求，即在pH7.0磷酸钠缓冲液中含50%硫酸镂。
上样总蛋白量200-500mg；4.3倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线；5.用分步梯度法洗脱。
每步依次分别采用两倍体积各含40%、30%、20%、10%或0%硫酸镂的pH7.0磷酸钠缓冲液洗脱；6.再依次用5倍体积水、5倍体积1mo1/1NaC1和5倍体积水洗柱，使其获得再生。
疏水层析和反相层析的原理及区别
疏水层析：
根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白，高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。
常用：苯基琼脂糖凝胶
反相层析:
在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。
如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。
则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。
这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。
目前用HPLC做反相层析常用的ODS柱，即在支持物的表面上连接了C18H37Si—基团（C18柱）。
二者的区别：
疏水作用层析：溶液配置简单，性状温和，能保持蛋白活性，但操作复杂，分离效率低
反向液相层析：洗脱液要求高，蛋白变性，操作简单，分离效率高。
第八节 疏水层析法
1972年，Erel Z．等人将不同链长的a，ω-二胺同系 物键合在琼脂糖上，以不同pH的含盐缓冲液作流动相 成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分 离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子方面的重 要作用。 蛋白质分离纯化目的是要求获得具有生物活性的组分， 而生物活性的保持与蛋白质的空间结构的完整性密切 相关。在分离纯化过程中一旦破坏了蛋白质的三级结 构，都可能使其丧失生物活性。疏水层析的分离过程， 可以根据蛋白质分子的疏水特性，采用温和的实验条 件，有效保护蛋白质的空间结构不受破坏，保持其原 有的生物活性。因此疏水层析是纯化活性蛋白质的有 效手段。
四、影响疏水层析分离的因素
1、盐类和盐组成 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的保留 值具有最为重大的影响。某些离子对蛋白质构象有稳 定作用，如SO42-可以提高蛋白质构象的稳定性，能 使蛋白质的溶解度下降，对蛋白质有盐析效应，使蛋 白质与固定相的疏水作用增强，这些盐或离子的洗脱 能力就较弱。有些离子对蛋白质构象具有不稳定作用， 如Cl- , Ca2＋会使蛋白质构象稳定性降低，使蛋白质 发生不同程度的变性，增加蛋白质的溶解度，具有盐 溶效应。这样的盐或离子的洗脱能力就比较强。
第八节 疏水层析法
刘耀玺
一、定义 疏水层析亦称疏水相互作用层析 （hydrophobic interaction chromatography, HIC），是利用盐-水体系 中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之 间的疏水力的不同而使样品组分得以分离的一 种层析方法。 也就是说：是利用待分离组分中的疏水基团与 固定相的疏水配基发生亲和作用的差异，在用 流动相洗脱时各组分在介质中的迁移率不同而 达到分离目的。
疏水层析名词解释
疏水层析名词解释
嘿，你知道啥是疏水层析不？疏水层析啊，就好比是一场特殊的“相亲大会”！那些具有疏水性质的分子们，就像是一群害羞的小伙子或者大姑娘，在这个特殊的场合里，寻找着自己的“另一半”。
比如说吧，蛋白质就是这场“相亲大会”里的主角之一。
它们有着不同的疏水区域，就像每个人都有自己独特的性格和魅力。
而疏水层析的柱子呢，就像是布置好的相亲场地，上面有着特定的疏水基团，专门吸引那些有疏水性质的分子。
想象一下，这些蛋白质分子在溶液中游走，当它们碰到疏水层析柱的时候，那些疏水区域就会被柱子上的疏水基团所吸引，就好像是两个人看对眼了一样，然后就结合在了一起。
而其他没有疏水性质或者疏水性质不强的分子呢，就像是那些没有找到合适对象的人，就继续在溶液中晃荡啦。
这时候呢，我们就可以通过改变一些条件，比如改变溶液的盐浓度或者酸碱度，来让结合在柱子上的蛋白质分子“松松手”，从柱子上下来。
这就好像是在“相亲大会”上，主持人稍微调整一下氛围，让那些已经结合的人也有机会重新考虑一下。
疏水层析在生物化学领域可是有着重要的作用呢！它可以帮助我们分离和纯化各种蛋白质、多肽等生物大分子。
哎呀呀，没有它可不行呢！
我觉得疏水层析就像是一个神奇的魔法棒，能把那些我们需要的分子从复杂的混合物中精准地挑出来，是不是超级厉害呀！它真的是生物化学研究中不可或缺的好帮手！。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析原理，也称为非极性层析原理，是一种分离和纯化化合物的常用方法。
该原理利用化合物在疏水性固定相（如疏水性硅胶）和溶剂中的亲水性差异来进行选择性分离。
在疏水层析中，化合物混合物首先通过一个填充有疏水性固定相的柱子（如硅胶柱）；然后用一个选择性的溶剂进行洗脱，使得各种化合物可以以不同的速度从柱中流出。
疏水性固定相作为分离介质，最主要的特点是表面疏水性强，与非极性或疏水性化合物具有较好的相互作用能力。
这种相互作用可以通过范德华力、氢键等进行，使得疏水性化合物被相互作用力留在柱上。
而亲水性化合物则更容易与溶剂发生作用而从柱中洗脱。
在进行疏水层析时，溶剂的选择是非常重要的。
选择的溶剂应该足够强大，可以与疏水性化合物发生相互作用，从而实现其分离。
常用的溶剂包括乙腈、甲酸乙酯、异丙醇等。
总之，疏水层析原理是通过利用化合物在疏水性固定相和溶剂中的亲水性差异，实现化合物的选择性分离。
这种方法在分析化学和生物化学等领域中广泛应用，能够有效地纯化和分离化合物。
疏水层析
2011~2012年度第一学期《酶工程与蛋白质工程》作业姓名：蔺重阳班级：10生物技术专升本2班学号：1006703232疏水层析一.原理：蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。
在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。
二.性质：是利用分离介质中固定的疏水配位体和被分离的蛋白质的疏水表面区域之间的相互作用进行的分离方法。
疏水相互作用力的大小随引入烃链的延长而不断增加，从而能将欲纯化的蛋白质有效地分离开来。
三应用实例：纯化鸡胗钙调蛋白取新鲜鸡胗(除去结缔组织)切成1cm3小块，置组织捣碎机中，加2倍于固形物体积的缓冲液(50mmol／L Tris-HCl，pH8.0，2mmol ／L EDTA，1mmol／Lα-巯基乙醇)高速匀浆三次(30s／次)，离心(8000 r／min，4℃，0.5h)收集鸡胗钙调蛋白抽提液(沉淀重复抽提一次)，合并抽提液，加硫酸铵盐析(pH8.0，60％饱和度)，除去大量杂蛋白，上清液采用等电点沉淀(用H2S04调pH=4.0)，离心收集含有效成分的沉淀物，加蒸馏水悬浮，用三羟甲基氨基甲烷(Tris)调pH=7.5～8.0，令其缓慢溶解，经透析，离心得到溶液上阴离子DEAE-Sephadex A50层析柱(pH8.0)（离子交换层析），用梯度缓冲液(10mmol／Ltris-HCl，pH8.0-0.2mol／L NaCl-1mmol／L EDTA-1mmol／L α-巯基乙醇，盐浓度变化范围为0.2~0.7mol／L NaCl)洗脱，通过分部收集和活性测定，合并有效成分溶液进行疏水层析。
此层析用的固定相为苯基-Sepharose CL-4B，用其纯化钙调蛋白的流程见图4-1。
疏 水 层 析
7、 柱子的预平衡：10倍床体积的层析缓冲液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸铵（这个浓度要你选择，50%还是30%？）），使其平衡。
8、 上样：当平衡层析缓冲液流至恰好与床面相切时，关闭出液口（有泵的话，把它一关就OK!），然后上样。注意：尽量小心，保持床面的平整性！打开出口，让样品缓缓进入柱床，再次相切时，加入少量（很少就可以，稍稍盖过床面就行！）层析缓冲液（20mM PBS, 50%硫酸铵）洗一下。
2、 柱子的装填：如果是预装柱，就不存在装柱的问题了。不是，则从头开始：首先，把柱子洗干净，一定要洗干净，不然会出现气泡。填料预先融涨（注意，进口一般已经是融涨好的，不必再做这一步），取一定的填料（例如：想装5.0ml的柱子，一般将瓶子里的填料（沉淀的填料：上清=1：1的话）取10.0ml出来）先脱一下气（请人帮忙，不然控制不好会暴沸出来！），然后缓缓装入柱子（柱子上下口一定不要搞错！！！），打开下口让水流出，最好一次性装完，等待其自然沉降，柱子就装好了。（实际上，因为疏水层析的原理与分子筛不同，所以其装柱远远没有分子筛的柱子那么严格，很容易的！放心好了！看着顺眼就应该差不多吧）
13、 好了，就这么多，有什么问题再讨论吧。或者到丁香园去问一下，chromatography很内行的！
疏 水 层 析
1、 疏水层析是根据不同蛋白质的疏水力强弱不同来分离的。在高盐离子强度的情况下，蛋白质的疏水基团充分暴露与填料的疏水介质相互作用，从而结合在柱子上。不同蛋白质的疏水性强弱不同从而导致其与柱子填料的结合力也不同。随后，逐渐降低洗脱缓冲液的盐离子强度就可以将不同的蛋白分布洗脱下来，形成一个个的蛋白质洗脱峰。
3、 注意：柱子装好之后，任何时间都不能让缓冲液流到柱面以下而干柱，切记！
疏水层析洗脱条件
疏水层析洗脱条件
疏水层析是一种常用的分离和纯化技术，广泛应用于生物制药、食品工业、环境监测等领域。
在疏水层析过程中，洗脱条件的选择对于分离效果和纯化程
度至关重要。
以下是几个影响疏水层析洗脱条件的关键因素：
1.洗脱缓冲液的pH值：pH值对于洗脱物质的电荷状态和分配系数有着重
要影响。
根据目标物质的酸碱性质选择合适的洗脱缓冲液pH值，可以有
效地调节目标物质的亲和性。
2.洗脱缓冲液的离子浓度：离子浓度会影响洗脱物质与固定相之间的竞争
关系，进而影响洗脱效果。
根据目标物质的亲和性选择合适的离子浓度，
可以优化分离效果。
3.洗脱缓冲液的洗脱剂浓度：洗脱剂浓度高低直接影响洗脱效果。
过低的
洗脱剂浓度可能导致目标物质无法有效洗脱出来，而过高的浓度则可能
导致非特异性洗脱。
需要根据具体情况进行调节。
4.洗脱流速：洗脱流速对于洗脱效果和纯化程度也有一定影响。
过高的流
速可能导致目标物质被冲刷出来，而过低的流速则可能导致洗脱效果不
理想。
需要根据具体情况选择合适的洗脱流速。
综上所述，选择合适的疏水层析洗脱条件是确保分离效果和纯化程度的关键。
通过调节洗脱缓冲液的pH值、离子浓度、洗脱剂浓度以及洗脱流速，可以优化疏水层析的洗脱效果。
疏水层析法分离多肽类物质的研究进展
（ Ｈ Ｉ Ｃ ）ｈ ａ ｓ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ａ ｄ ｖ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ｅ ｓ ｂ ｅ ｓ ｉ ｄ ｅ ｓ ｂ ｅ ｉ ｎ ｇ ｓ ｉ ｍ ｐ ｌ ｅ ｔ ｏ ｏ ｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｄ ｕ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ．
疏水 层析 也 称 疏 水 作 用 下 层 析 （ ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｂ ｉ ｃ ｉ ｎ —
体不同生命 活动密切 相关 （ 如 免疫 调节 、 抗 血
栓、 抗氧化 、 抑制细菌 和病 毒 、 抗 癌等作用 ） Ｊ 。 随着科 学技 术 的发展 ， 多 肽物 质 的分离 纯化 俨然
疏 水 层 析 法 分 离 多 肽 类 物 质 的 研 究 进 展
韩 婧师 李 波 陈旭 东 １ ０ ０ １ ９ ３ ） （ 北 京 中农颖 泰 生物技 术 有 限公 司 ， 北京
摘
要： 多肽 类 物质 对 于生物体 生理机 能的调 节作 用越 来越 受到研 究者 的重视 ， 分 离技
术 更是 其技 术 实现 产 业化 的 关键 ， 疏水层 析 法分 离多肽 类 物质具 有操 作 简便 、 蛋 白质 变性 小 等优 势 。本 文综 述 了疏水层 析 法分 离多肽 类物质 的原 理 、 影响 因素及 应 用。
Ｈａ ｎ Ｊ ｉ ｎ ｇ ｓ ｈ ｉ Ｌ ｉ Ｂ ｏ Ｃ ｈ ｅ ｎ Ｘｕ ｄ ｏ ｎ ｇ
Ａｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ：Ｐ ｏ ｌ ｙ ｐｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ｓ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｇ ａ ｎ ｉ ｓ ｍ ｇ ｅ ｔ ｍｏ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ｍｏ ｒ ｅ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｅ ｒ ｓ ａ ｔ ｔ ｅ ｎ ｔ ｉ ｏ ｎ． Ｉ ｔ ｉ ｓ ｓ ｉ ｇ ｎｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｎ ｔ ｔ ｏ ｓ ｔ ｕｄ ｙ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｐａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｏ ｌ ｙ ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄｅ ｓ Ｓ Ｏ ａ ｓ ｃ ｏ ｎ — ｔ ｒ ｉ ｂ ｕ ｔ ｅ ｔ ｏ ｉ ｎｄ ｕ ｓ ｔ ｒ ｉ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ．Ｐ ｏ ｌ ｙ ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ｓ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｂ ｉ ｃ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ
疏水层析
蛋 白 质 结 合 容 量 （ mg/ ml 凝 胶 床）
洗脱的方式：
（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱 （最常用） （2）通过往流动相中添加有机溶剂 ，如： 乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极 性的方式洗脱 （溶剂中稳定性良好的物质） （3）往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本 身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在 其上的目标组分置换下来 （分离膜蛋白）
温度升高会增加疏水作用，但注意蛋 白质等生物大分子在较高温度下会变性。 对特定的分离，操作温度需保持恒定，才 能确保层析结果具良好的重复性。
层析介质的再生、贮存
再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强 的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质 上，则需合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶 液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析 柱的同时还能使微生物钝化灭活起到消毒的 效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的 清洗剂 贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶 液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂， 以防止微生物的生长
Hydrophobic Interaction Chromatography HIC
疏水作用层析
原理 介质 技术
概述
疏水层析分离的概念早在1948年由Tiselius 提出，真正发展是1970年开发出一系列适合 疏水层析的固定相以后； 疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或 凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经 常联合使用来分离复杂的生物样品；
一般来说每个分子被吸附的过程 都会有一个以上的配基参与，换句话 说，分子在介质上发生的结合是多点 结合.
疏水层析与反相层析的区别 ：
RPC介质上疏水配基的取代程度大 大高于HIC介质，RPC更适合在水-有机 溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分 子蛋白质的分离纯化； HIC过程洗脱条件温和，通常降低 洗脱剂的盐浓度就能达到目的，在蛋白 质的纯化中有较广泛的应用。
疏水层析
H
不同的分子由于疏水性不同
疏水性作用力强弱不同
固定相P：
基质M（琼脂糖类凝胶）
疏水层析介质
配体L（疏水性基团）
中等疏水的高分子 配基(如聚乙二醇和 聚丙三醇等) 不仅可提供足够的 结合力，且避免了 上述缺点。
太强：洗脱需用有机溶剂，变性 太弱：洗脱效果不好
就球形蛋白质的结构而言，其 分子中的就球形蛋白质的结构 而言，其分子中的
疏水层析（HIC）
HIC概念:利用固定相载体上偶联的疏水性配基与 流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行 分离的层析技术。
是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质 和多肽等生物大分子的一种较缓冲液 固定相
原理
蛋白质： 疏水补丁：
H H
S H
H
疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部， 但有些暴露在外，在蛋白质表面形成疏水区域，这 部分暴露在外疏水性基团称为疏水补丁
L H S
+
W
通过降低流动相的离子强度， 疏水作用弱(即亲水性强)的物质， 用高浓度盐溶液洗脱时，会先被 洗下来。 当盐溶液浓度降低时，疏水作用 强的物质才会随后被洗下来。 （相同盐浓度下，疏水作用弱的 物质先被洗下来，疏水作用强的 物质随后被洗下来）
缓冲液：
高浓度盐溶液 原因：
可令蛋白质发生局部变性， 暴露出掩藏于分子内的疏 水性残基
在纯水中，任何疏水效应太弱， 不能导致配基和蛋白之间或蛋白 自身的相互作用
暴露于分子表面的疏 水性残基才能与疏水 性固定相作用，即配 基。
P
L
+ H
S
P：固相支持物 L：疏水性配体 S：蛋白质或多肽等生物大分子 H：疏水补丁 w：盐溶液
疏水层析
亲硫性疏水层析
该技术主要在疏水作用的基础上增加了硫元素的 相互作用。利用层析介质与含硫蛋白质和非硫蛋 白质的亲硫性差异，对蛋白质加以分离。具体应 用条件和HIC类似。
通常这类介质通过硫醚键将配基和基质联接，如 Butyl—S-Sepharose 6 Fast Flow，已用于乙肝 病毒表面抗原的分离纯化。
疏水电荷诱导层析(HCIC)
HCIC是近几年来发展起来的一类不同于HIC的新 技术，由Burton等 1998年提出；
HCIC与蛋白质的作用除了疏水作用，还有电荷间 的相互作用；
HCIC与蛋白质的结合是由疏水作用推动的，与 HIC不同的是，这一过程通常是在不改变离子强度 的条件下实现的；
流动相A的缓冲液的种类、pH ，盐的种类和浓度的选 择：
缓冲液种类据所需的pH选择，注意目标物的稳定性，浓度一 般在0.01--0.05mol/L；
不同盐类对疏水作用的强度有影响，层析中的选择性也不尽相 同 0.7；5盐～浓2m度o也l/随L，目N标a分Cl子为的1～疏4水m性ol而/L异；，(NH4)2SO4常用
“疏水作用”一词是Kauzmann于1959年首次在“蛋 白质进展”杂志中提出的，随后陆续有学者发表用疏 水层析成功分离蛋白质的文献报道；如钙调蛋白、苯 丙氨酸裂解酶、凝集素等。
1972年，Erel Z.等人将不同链长的α，ω—二胺同系 物键合在琼脂糖上，以不同pH的含盐缓冲液作流动相 成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分 离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子的重要作 用。
HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8之间， 苯基的疏水性大致与戊基相当，因与溶质发生π-π相 互作用，它与戊基有不同的选择性，而寡聚乙二醇固 定相的疏水性介于丁基与苯基之间 。
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盐析作用增强
洗脱作用增强
排在最左边的离子或盐，盐析作用最强， 洗脱能力最弱；排在最右边的离子或盐， 洗脱能力最强，盐析作用最弱。 选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分 离 后 蛋 白 质 的 活 性 都 很 重 要 。 (NH4)2SO4,NH4Ac,NaCl和磷酸盐是疏水层 析分离常用的几种盐。
例如某些蛋白质在水溶液中溶解度很大，分子 的极性较大；在高盐溶液中疏水性明显增大， 溶解度降低，出现盐析现象；在低盐溶液中疏 水性减小，溶解度增大。 因此疏水层析可以通过改变盐溶液的离子强度、 控制蛋白质分子的极性或非极性，使样品中极 性相近的蛋白质组分形成具有一定差异的疏水 分子，然后利用它们之间的疏水特性进行层析 分离。
在分离过程中，溶液中的疏水分子经过疏水层析
介质时，介质上的疏水配基即与它们发生亲和吸
附作用，疏水分子被吸附在介质的配基上面，这
种吸附力的强弱与疏水分子的疏水性大小相关，
疏水性大（极性小）的组分吸附力强，疏水性小 （极性大）的组分吸附力弱，通过改变洗脱液的 盐-水比例，改变其极性，使吸附在固定相上的 不同极性组分根据其疏水性的差异先后被解吸下
多缓冲离子交换剂可利用普通的凝胶过滤介质偶 联特殊的离子交换基制备，如Amersham Biosciences公司生产的Polybuffer exchanger PBE系列（PBE118和94）即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte匹配 使用，后者与Polybuffer 96和Polybuffer 74匹 配使用。Amersham Biosciences生产的另一种 多缓冲离子交换剂为Mono P，其离子交换基为 具有不同pKa值的弱碱性氨基。Mono P可与上述 三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅l0um，用作高效 色谱聚焦柱的固定相。
4、柱温 一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变 化，疏水作用增加，保留值增加，有利于提高 层析柱的分离度，所以有时可以通过提高柱温 来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性 质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常 有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类， 在高温条件下易变性失活，因此不宜在高温条 件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。
第九节 色谱聚焦
一、原理
色谱聚焦（chromatofocusing）是基于离 子交换的原理，根据两性电解质分子间等 电点的差别进行分离纯化的洗脱色谱法， 可用于蛋白质、多肽和核酸等生物大分子 的分离纯化。
色谱聚焦利用离子交换剂为固定相，因此是一 种离子交换色谱法。但是，与一般离子交换色 谱所不同的是：色谱聚焦利用在较宽pH值范 围内具有缓冲作用的多缓冲离子交换剂 (polybuffer exchanger）为固定相，同时利 用在较宽pH值范围内具有缓冲作用的多缓冲 剂（polybuffer）为流动相。所以，当向色谱 柱内输入与柱内初始pH值不同的多缓冲剂时， 柱内pH值缓慢改变，在轴向形成连续的 pH梯 度，使料液中的溶质依据各自的等电点或者吸 附，或者脱附，逐次向下移动，彼此之间得到 分离。
来，达到分离目的。
2、产生疏水作用的因素 （1）介质的疏水性
疏水层析介质的一个显著特征是其表面含有 疏水性配基。配基是不同长度的烷烃或芳香族 化合物。以烷烃类作为配基的介质，碳链链长 一般在8碳以内，以芳香类作为配基一般是单 苯基、联苯、苯的衍生物等。疏水配基交联琼 脂糖凝胶珠是疏水层析中使用最广泛的介质， 如正辛基（C8）-琼脂糖和苯基-琼脂糖凝胶。
1972年，Erel Z．等人将不同链长的a，ω-二胺同系 物键合在琼脂糖上，以不同pH的含盐缓冲液作流动相 成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分 离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子方面的重 要作用。 蛋白质分离纯化目的是要求获得具有生物活性的组分， 而生物活性的保持与蛋白质的空间结构的完整性密切 相关。在分离纯化过程中一旦破坏了蛋白质的三级结 构，都可能使其丧失生物活性。疏水层析的分离过程， 可以根据蛋白质分子的疏水特性，采用温和的实验条 件，有效保护蛋白质的空间结构不受破坏，保持其原 有的生物活性。因此疏水层析是纯化活性蛋白质的有 效手段。
三、疏水层析与反相层析的区别
在用液相层析分离时，能满足疏水特性的有两种 不同模式，一是反相层析（RPC)，一是疏水层析。 反相层析也是基于溶质、极性流动相和非极性固定 相表面的疏水效应建立的一种层析模式（是用亲脂 性溶剂作固定相，极性溶剂作流动相的分配层析 法）。疏水介质和反相介质的配基都是不同长度的 烷烃或芳香类化合物。疏水层析的原理与反相层析 相同，区别在于疏水层析介质表面的疏水性没有反 相层析强，配基密度比反相层析要低10-100倍。
盐析和盐溶作用的特性可以作为选择疏水层析上 样和洗脱条件的依据。根据盐析效应和洗脱能力 的强弱，将常用的离子和盐类排列如下： 负离子PO4- ,SO42- 、 CH3COO- ,Cl- ,Br- ,NO3,ClO4- ,I- ,SCN正离子(CH3)4N+ ,NH4 -,Na+ ,Li+ ,Mg2+ ,Ca2+ ,Ba2+ 盐类Na2SO4, KH2Po4 ,Na2HPo4,(NH4)2SO4,NH4Ac、 KAc,NaAc,NaCl
Hale Waihona Puke 2、离子强度离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的 保留值。一般通过增加离子强度来增加组分的 保留值，降低离子强度来提高组分的解吸附能 力。
HIC实验中，改变离子强度进行洗脱的方式， 一般宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。
3、溶液的酸碱度 溶液的pH主要考虑能维持生物大分子的生物 活性较稳定的pH环境。大多数蛋白质在pH 48范围是稳定的。 一般情况，溶液的pH接近蛋白质的等电点， 其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作用； 远离其等电点，其疏水性减少，不利于与固定 相配基结合，有利于蛋白质洗脱。通过改变溶 液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。但在HIC 实验中通常采用改变溶液的离子强度来改变蛋 白质的疏水性。
三、色谱聚焦的应用
色谱聚焦需使用特殊的固定相和流动相，难于
应用在大规模分离纯化过程，主要用于生化实 验规模的样品制备或成分分析。但作为一种蛋 白质分离纯化手段，色谱聚焦的分辨率极高， 峰宽可小到0.02-0.05pH单位，可分离等电点 相差仅0.02的蛋白质。
作业： 1、影响疏水层析的因素有哪些? 2、聚焦色谱的原理是什么？
用RPC分离生物大分子，流动相多采用酸性、
低离子强度的水溶液，并加入一定比例的异丙
酮、乙腈或甲醇等有机改性剂。但过强的疏水 性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸 附及其三级结构的不可逆变性。
HIC分离时，流动相一般为中性盐水溶液，pH 68，通常不需有机添加剂。HIC对疏水性很强的蛋 白质保留较强，而对亲水性蛋白质保留都十分弱。 分离疏水性相差较大的蛋白质混合物，如细胞色 素c和溶菌酶，用HIC会得到比RPC好得多的效果。 HIC最显著的优势在于它基本不破坏蛋白质的三 级结构。通常在HIC分离纯化酶的过程中，失活 最大不超过10%左右；而用RPC分离，酶活性一 般会损失20%以上，甚至50%。所以活性蛋白质 用HIC分离纯化较为理想，这就使得HIC有更大的 开发潜力。
正辛基和苯基作为疏水配基具有较强的疏水
性，它们对疏水性大的蛋白质具有较强的亲和
吸附作用。载体表面所偶联的疏水配基不同 （如C1 –C8烷烃或苯基等）对溶液中的疏水 分子的亲和力也不一样，因此，应该根据被分 离组分的极性强弱选择适当疏水性大小的层析 介质，以获得理想的分离效果。
2．分离样品组分的疏水性 疏水层析正是利用蛋白质之间疏水性的差异进 行蛋白质组分的分离。 3.溶液所产生的疏水特性 天然蛋白质分子在细胞内有独特的空间结构维 持着天然活性和生物学功能，但是，当它置于 体外的特定溶液中，蛋白质分子的空间构象会 受到一定的影响，产生不同程度的伸展或收缩， 这些变化的结果可能导致其分子内部疏水基团 向外伸展暴露在表面，造成分子极性的减弱、 非极性增强，疏水性总效应也发生改变。
四、影响疏水层析分离的因素
1、盐类和盐组成 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的保留 值具有最为重大的影响。某些离子对蛋白质构象有稳 定作用，如SO42-可以提高蛋白质构象的稳定性，能 使蛋白质的溶解度下降，对蛋白质有盐析效应，使蛋 白质与固定相的疏水作用增强，这些盐或离子的洗脱 能力就较弱。有些离子对蛋白质构象具有不稳定作用， 如Cl- , Ca2＋会使蛋白质构象稳定性降低，使蛋白质 发生不同程度的变性，增加蛋白质的溶解度，具有盐 溶效应。这样的盐或离子的洗脱能力就比较强。
第八节 疏水层析法
刘耀玺
一、定义 疏水层析亦称疏水相互作用层析 （hydrophobic interaction chromatography, HIC），是利用盐-水体系 中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之 间的疏水力的不同而使样品组分得以分离的一 种层析方法。 也就是说：是利用待分离组分中的疏水基团与 固定相的疏水配基发生亲和作用的差异，在用 流动相洗脱时各组分在介质中的迁移率不同而 达到分离目的。
二、多缓冲剂与多缓冲离子交换剂
多缓冲剂是两性电解质缓冲剂，由相对分子质量 大小不一的多种组分构成，每种构成成分均为多 羧基多氨基化合物，存在各自的等电点。常用的 多 缓 冲 剂 有 Amer-sham Biosciences 公 司 生 产 的 Polybuffer 96、Polybuffer 74和Pharmalyte，缓冲 pH值范围分别为pH=9-6, pH=7-4和pH=10.5-8。 在相应的缓冲pH值范围内，各种多缓冲剂具有均 衡的缓冲容量，在色谱聚焦操作中提供平滑的pH 梯度。