第八节 疏水层析法

四、影响疏水层析分离的因素

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1、盐类和盐组成 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的保留 值具有最为重大的影响。某些离子对蛋白质构象有稳 定作用，如SO42-可以提高蛋白质构象的稳定性，能 使蛋白质的溶解度下降，对蛋白质有盐析效应，使蛋 白质与固定相的疏水作用增强，这些盐或离子的洗脱 能力就较弱。有些离子对蛋白质构象具有不稳定作用， 如Cl- , Ca2＋会使蛋白质构象稳定性降低，使蛋白质 发生不同程度的变性，增加蛋白质的溶解度，具有盐 溶效应。这样的盐或离子的洗脱能力就比较强。

盐析和盐溶作用的特性可以作为选择疏水层析上 样和洗脱条件的依据。根据盐析效应和洗脱能力 的强弱，将常用的离子和盐类排列如下： 负离子PO4- ,SO42- 、 CH3COO- ,Cl- ,Br- ,NO3,ClO4- ,I- ,SCN正离子(CH3)4N+ ,NH4 -,Na+ ,Li+ ,Mg2+ ,Ca2+ ,Ba2+ 盐类Na2SO4, KH2Po4 ,Na2HPo4,(NH4)2SO4,NH4Ac、 KAc,NaAc,NaCl

多缓冲离子交换剂可利用普通的凝胶过滤介质偶 联特殊的离子交换基制备，如Amersham Biosciences公司生产的Polybuffer exchanger PBE系列（PBE118和94）即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte匹配 使用，后者与Polybuffer 96和Polybuffer 74匹 配使用。Amersham Biosciences生产的另一种 多缓冲离子交换剂为Mono P，其离子交换基为 具有不同pKa值的弱碱性氨基。Mono P可与上述 三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅l0um，用作高效 色谱聚焦柱的固定相。

例如某些蛋白质在水溶液中溶解度很大，分子 的极性较大；在高盐溶液中疏水性明显增大， 溶解度降低，出现盐析现象；在低盐溶液中疏 水性减小，溶解度增大。 因此疏水层析可以通过改变盐溶液的离子强度、 控制蛋白质分子的极性或非极性，使样品中极 性相近的蛋白质组分形成具有一定差异的疏水 分子，然后利用它们之间的疏水特性进行层析 分离。
来，达到分离目的。

2、产生疏水作用的因素 （1）介质的疏水性

疏水层析介质的一个显著特征是其表面含有 疏水性配基。配基是不同长度的烷烃或芳香族 化合物。以烷烃类作为配基的介质，碳链链长 一般在8碳以内，以芳香类作为配基一般是单 苯基、联苯、苯的衍生物等。疏水配基交联琼 脂糖凝胶珠是疏水层析中使用最广泛的介质， 如正辛基（C8）-琼脂糖和苯基-琼脂糖凝胶。


4、柱温 一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变 化，疏水作用增加，保留值增加，有利于提高 层析柱的分离度，所以有时可以通过提高柱温 来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性 质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常 有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类， 在高温条件下易变性失活，因此不宜在高温条 件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。


2、离子强度

离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的 保留值。一般通过增加离子强度来增加组分的 保留值，降低离子强度来提高组分的解吸附能 力。
HIC实验中，改变离子强度进行洗脱的方式， 一般宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。




3、溶液的酸碱度 溶液的pH主要考虑能维持生物大分子的生物 活性较稳定的pH环境。大多数蛋白质在pH 48范围是稳定的。 一般情况，溶液的pH接近蛋白质的等电点， 其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作用； 远离其等电点，其疏水性减少，不利于与固定 相配基结合，有利于蛋白质洗脱。通过改变溶 液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。但在HIC 实验中通常采用改变溶液的离子强度来改变蛋 白质的疏水性。
二、疏水层析原理


1、疏水基团与疏水作用
疏水层析介质表面上的配基是一些具有疏水性能
的基团，如-CH2-，-CH3、苯基等。生物大分子
（如蛋白质等）结构中或多或少都含有一定数目
的疏水基团，有些疏水基团被包埋在分子内部， 有些则暴露在外面，每个分子暴露在表面的疏水 基团的数量不同，表现出其疏水性的强弱也不一 样。
第九节 色谱聚焦


一、原理
色谱聚焦（chromatofocusing）是基于离 子交换的原理，根据两性电解质分子间等 电点的差别进行分离纯化的洗脱色谱法， 可用于蛋白质、多肽和核酸等生物大分子 的分离纯化。

色谱聚焦利用离子交换剂为固定相，因此是一 种离子交换色谱法。但是，与一般离子交换色 谱所不同的是：色谱聚焦利用在较宽pH值范 围内具有缓冲作用的多缓冲离子交换剂 (polybuffer exchanger）为固定相，同时利 用在较宽pH值范围内具有缓冲作用的多缓冲 剂（polybuffer）为流动相。所以，当向色谱 柱内输入与柱内初始pH值不同的多缓冲剂时， 柱内pH值缓慢改变，在轴向形成连续的 pH梯 度，使料液中的溶质依据各自的等电点或者吸 附，或者脱附，逐次向下移动，彼此之间得到 分离。


三、色谱聚焦的应用
色谱聚焦需使用特殊的固定相和流动相，难于
应用在大规模分离纯化过程，主要用于生化实 验规模的样品制备或成分分析。但作为一种蛋 白质分离纯化手段，色谱聚焦的分辨率极高， 峰宽可小到0.02-0.05pH单位，可分离等电点 相差仅0.02的蛋白质。

作业： 1、影响疏水层析的因素有哪些? 2、聚焦色谱的原理是什么？
第八节 疏水层析法
刘耀玺



一、定义 疏水层析亦称疏水相互作用层析 （hydrophobic interaction chromatography, HIC），是利用盐-水体系 中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之 间的疏水力的不同而使样品组分得以分离的一 种层析方法。 也就是说：是利用待分离组分中的疏水基团与 固定相的疏水配基发生亲和作用的差异，在用 流动相洗脱时各组分在介质中的迁移率不同而 达到分离目的。

在分离过程中，溶液中的疏水分子经过疏水层析
介质时，介质上的疏水配基即与它们发生亲和吸
附作用，疏水分子被吸附在介质的配基上面，这
种吸附力的强弱与疏水分子的疏水性大小相关，
疏水性大（极性小）的组分吸附力强，疏水性小 （极性大）的组分吸附力弱，通过改变洗脱液的 盐-水比例，改变其极性，使吸附在固定相上的 不同极性组分根据其疏水性的差异先后被解吸下


三、疏水层析与反相层析的区别
在用液相层析分离时，能满足疏水特性的有两种 不同模式，一是反相层析（RPC)，一是疏水层析。 反相层析也是基于溶质、极性流动相和非极性固定 相表面的疏水效应建立的一种层析模式（是用亲脂 性溶剂作固定相，极性溶剂作流动相的分配层析 法）。疏水介质和反相介质的配基都是不同长度的 烷烃或芳香类化合物。疏水层析的原理与反相层析 相同，区别在于疏水层析介质表面的疏水性没有反 相层析强，配基密度比反相层析要低10-100倍。



盐析作用增强
洗脱作用增强

排在最左边的离子或盐，盐析作用最强， 洗脱能力最弱；排在最右边的离子或盐， 洗脱能力最强，盐析作用最弱。 选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分 离 后 蛋 白 质 的 活 性 都 很 重 要 。 (NH4)2SO4,NH4Ac,NaCl和磷酸盐是疏水层 析分离常用的几种盐。

正辛基和苯基作为疏水配基具有较强的疏水
性，它们对疏水性大的蛋白质具有较强的亲和
吸附作用。载体表面所偶联的疏水配基不同 （如C1 –C8烷烃或苯基等）对溶液中的疏水 分子的亲和力也不一样，因此，应该根据被分 离组分的极性强弱选择适当疏水性大小的层析 介质，以获得理想的分离效果。



2．分离样品组分的疏水性 疏水层析正是利用蛋白质之间疏水性的差异进 行蛋白质组分的分离。 3.溶液所产生的疏水特性 天然蛋白质分子在细胞内有独特的空间结构维 持着天然活性和生物学功能，但是，当它置于 体外的特定溶液中，蛋白质分子的空间构象会 受到一定的影响，产生不同程度的伸展或收缩， 这些变化的结果可能导致其分子内部疏水基团 向外伸展暴露在表面，造成分子极性的减弱、 非极性增强，疏水性总效应也发生改变。


1972年，Erel Z．等人将不同链长的a，ω-二胺同系 物键合在琼脂糖上，以不同pH的含盐缓冲液作流动相 成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分 离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子方面的重 要作用。 蛋白质分离纯化目的是要求获得具有生物活性的组分， 而生物活性的保持与蛋白质的空间结构的完整性密切 相关。在分离纯化过程中一旦破坏了蛋白质的三级结 构，都可能使其丧失生物活性。疏水层析的分离过程， 可以根据蛋白质分子的疏水特性，采用温和的实验条 件，有效保护蛋白质的空间结构不受破坏，保持其原 有的生物活性。因此疏水层析是纯化活性蛋白质的有 效手段。


二、多缓冲剂与多缓冲离子交换剂
多缓冲剂是两性电解质缓冲剂，由相对分子质量 大小不一的多种组分构成，每种构成成分均为多 羧基多氨基化合物，存在各自的等电点。常用的 多 缓 冲 剂 有 Amer-sham Biosciences 公 司 生 产 的 Polybuffer 96、Polybuffer 74和Pharmalyte，缓冲 pH值范围分别为pH=9-6, pH=7-4和pH=10.5-8。 在相应的缓冲pH值范围内，各种多缓冲剂具有均 衡的缓冲容量，在色谱聚焦操作中提供平滑的pH 梯度。


用RPC分离生物大分子，流动相多采用酸性、
低离子强度的水溶液，并加入一定比例的异丙
酮、乙腈或甲醇等有机改性剂。但过强的疏水 性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸 附及其三级结构的不可逆变性。

HIC分离时，流动相一般为中性盐水溶液，pH 68，通常不需有机添加剂。HIC对疏水性很强的蛋 白质保留较强，而对亲水性蛋白质保留都十分弱。 分离疏水性相差较大的蛋白质混合物，如细胞色 素c和溶菌酶，用HIC会得到比RPC好得多的效果。 HIC最显著的优势在于它基本不破坏蛋白质的三 级结构。通常在HIC分离纯化酶的过程中，失活 最大不超过10%左右；而用RPC分离，酶活性一 般会损失20%以上，甚至50%。所以活性蛋白质 用HIC分离纯化较为理想，这就使得HIC有更大的 开发潜力。