现代生物技术在发酵中的应用

2、工程菌的培养
（1）基因重组细胞的种类 宿主细胞可以采用原核的大肠杆菌和枯草杆菌、真核细胞的酵母菌和 哺乳动物细胞等。所以，生产基因重组产物就有不同的菌体或细胞。但当前 生产上使用多的仍以大肠杆菌为主，因为在大肠杆菌中，多种哺乳动物和其 他微生物的蛋白基因能够得到高效表达，产物能得到过量生产、产量可达大 肠杆菌菌体总蛋白的50%（如人胰岛素）。这就为生产多种蛋白药物（如白细 胞介素-2，人生长激素、干扰素等），提供了基础。但大肠杆菌不具备分泌 系统，产生的产物以包含体（inclusion body）形式存在于细胞质中，这给 分离纯化造成了困难。因此，人们才研究能分泌蛋白的酵母系统和枯草杆菌 系统 （2）工程菌的培养 工程菌的培养与普通微生物的好气培养无大差异，但有其特点。从培养 工程来看，其主要因素有：营养源（碳源、氮源、氨基酸、溶解氧等）浓度 的控制和有毒代谢产物的排除。在生物学上还应考虑：质粒的稳定性、质粒 拷贝数的控制、转录效率的提高与控制、翻译效率的提高以及菌体向外分泌 产物等因素。因此，工程菌的开发研究仍须重视培养技术，才能获得大量产 物。
① 培养装置
在进行以工业化为目的DNA重组实验，以及为生产异种基因产物而培养 重组菌，应采用简便易行的培养系统。以大肠杆菌为主的宿生的培养多使用 一般的通气搅拌罐。基因重组动物细胞的培养，实际上与过去动物细胞培养 一样，所用的培养装置和措施与微生物培养并不相同。 工程菌的基础实验仍使用常规的培养皿、试管、玻璃瓶等培养器。实验 者应按实验准则的要求，谨慎进行操作，应使用移液抢处理重组体，操作应 在安全柜（或室）中进行，目前已有规定的细则，以防止工程菌外漏和扩散 。 中间试验或大量提纯产物时，必须进行重复性好的稳定培养。要取得 大量培养液或培养数据，要用带各种传感器的培养罐，以测定和控制 pH值、 溶解氧、底物浓度等参数。许多培养数据还可通过联机取得，或经自动分析 记录下来，这样自动化系统能有效地减少实险操作者与基因重组体的接触机 会。密闭型通气搅拌培养罐按采用高压蒸气灭菌。工程菌的培养装置既要防 止外界微生物侵入罐内，污染杂菌，又必须不使重组体外漏。这是与沿用的 通气搅拌式培养罐的区别所在。
抗李斯特菌致死攻击、血管生成等 具有强利尿、扩张血管和降压作用等
像基因工程所获得的工程菌一样，许多哺乳动物的基因克隆在大肠杆菌 等宿主中能够得到表达等等。使用小鼠体内法生产单克隆抗体，产品常含有 毒性杂质和不易大量生产等缺点，目前也采用同微生物发酵一样的发酵罐的 生物反应器来进行催化反应，获得所需的产物。酶工程中的固定化细胞（或 酶）也可用类似发酵罐的生物反应器来进行催化反应，获得所需的产物。这 些事实都说明它们之间的密切关系，也说明发本酵（或类似发酵）技术在制 得产品中的地位。另外，计算机技术用于发酵控制也已趋于广泛。
比较理想的、能够成为工业使用的基因工程菌应具备下列条件： 1）发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，当然也是分泌型菌株； 2）菌株能利用常用的碳源（如糖蜜、淀粉等），并可进行连续培养； 3）菌株是不致病的，也不产生内毒素； 4）发酵所产生的热量和需氧量都较低，发酵温度也适当； 5）代谢控制容易进行； 6）能进行适当的重组DNA，并且稳定，重组的DNA不易丢失。 基因工程技术已趋于成熟，所得工程菌已得到应用，并已开发出不少产 品投入市场如胰岛素、干扰素、生长激素和乙型肝炎疫苗等，还有几十种可 能成为药物的产品正在开发中。在氨基酸工程菌组建上，也获得了成功，如 高产的苏氨酸工程菌。在抗生素生物合成上，在分析和分离生物合成基因结 构特点和表达调节的基础上，已成功地把基础因工程技术用于提高抗生素的 产量上，如将头孢菌素生物合成的限制性扩环酶基因克隆到产生菌中，使头 孢菌素C的产量提高了15%。我国在基因工程研究开发上，也取得了不少成就： 已获得青霉素酰化酶基因工程菌，并中试成功，达195u/ml水平；利用工程菌 也中试成功人a型干扰素等。
生物技术的内容大致分为两个方面：直接型生物细胞的利用技术和模拟 型生物细胞的利用技术。以现代前沿技术来说，一般认为有四方面：即基因 操作技术；细胞融合技术；细胞大量培养技术和生物反应器技术。可概括为 基因工程，细胞工程，发酵工程和酶工程，与生化工程关系也很密切，也可 并入，构成五大工程。 生物技术的应用，已经取得相当大的成果，特别是在医药方面，已经开 发展出了不少的新药，见表1。 生物技术中，当前人们最感兴趣的是基因工程和细胞工程，它们是生物 技术的主导领域，也是热点。形成独特产业的发酵工程和酶工程等也是生物 技术中的重要组成部分。这几方面的内容是相互联系和互相促进的。基因工 程和细胞工程常常是发酵工程和酶工程的基础，所以现代发酵工程包括整个 生物工艺过程。作为发酵工业来说，除了传统的利用天然微生物发酵生产初 级代谢产物和次级代谢产物外，由于生物技术的出现，发酵工业所涉及的范 围得到扩大，生产技术得到改造，因而发酵生产能力和控制水平大为提高。
DNA重组技术获得的部分药品
药物名称
胰岛素 生长激素
适应性
糖尿病 侏儒症
血清白蛋白
蛋白因子 Ⅶ 尿激酶
外科 休克 烧伤
血友病 心脏病发作、中风
组织血纤维蛋白溶酶原活化剂
干扰素 淋巴激活素 白细胞介素 肿瘤坏死因子 (TNF) 心钠素 （ANP）
血栓症
癌症 病毒感染 癌症 自动免疫病 感染 是一种淋巴因子具多种功能
一. 工程菌的发酵
1. 工程ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的来源和应用
基因工程是在生物体外对DNA分子进行重新组合，然后克隆到适合的宿 生细胞，进行增殖和表达的遗传操作。所得重组体菌株即是工程菌。获得它 的基本过程如图。 基因工程的关键问题在于目的基因在宿主细胞中能否表达，即DNA在宿 主细胞中能否转录和翻译，表达形成的产物在胞内不被分解，并能分泌到胞 外。而基因表达过程是多层次的，因此影响基因表达的因素也是多方面的。
② 培养基和高密度发酵
微生物生产的蛋白质类产物，常是一种粗品，因此可以使用各种复杂培 养基。但工程菌的产物多属于人或畜体内蛋白质，需要有很高的纯度，否则， 不能在体内使用，所以，发酵生产须要有严格的要求。工程菌发酵有两条基 本要求，首先是要使菌体生长良好，获得高浓度菌体（即高密度发酵），这 样才能得到最多的产物；其次是发酵所用培养基的成分必须保持尽可能的简 单，以便分离产物。 据报道，培养大肠杆菌最高可得干重菌体125g/L，酿酒酵母可得145 g/L。 枯草杆菌大概可得干菌体20-40 g/L。这些数值还不是工程菌培养的结果。我 国对人a1型干扰素工程菌（大肠杆菌K12系BMH71-18株），进行高密度发酵， 得到100.25 g/L的菌体。这与培养非工程菌的菌量相接近。 大肠杆菌、其他细菌和酵母菌在合成培养中都能良好地生长。工程菌发 酵所使用的培养基也是合成培养基，包括葡萄糖、铵盐和无机盐等。其组成 必须满足获得高浓度菌体的要求，发酵中间过程还必须补加碳源和氮源，也 用氨水来调节控制发酵pH。其他的培养条件，如搅拌转速（与剪切力有关）、 溶解氧、培养温度、培养pH、接种龄和接种量等条件，对菌体生长和产物产 量都有影响。