最新第三章荧光分光光度法[002]PPT
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荧光相关光谱要点ppt课件
检测器分别检测。
三、应用
• 1.生物分子相互作用 • 金环蛇毒素和乙酰胆碱受体的作用 • 组氨酸标记肽与金属螯合脂的作用 • 转铁蛋白与人转铁蛋白受体的作用 • 秋水仙碱与微管蛋白的作用 • ……
2.活细胞相关研究
• A.细胞膜 • 磷脂双分子层4nm厚，可按二维模型处理
• 胰岛素原C-肽与人细胞膜的相互作用 • 表皮增长因子与膜结合受体的特异结合 • 神经肽在胰腺癌细胞细胞膜的结合作用
一、概念
• FCS通过测定溶液中微区内（fL）发光粒 子因布朗运动或化学反应而产生的荧光 涨落现象，分析荧光涨落的相关函数而 获得单个粒子（如分子）的浓度、化学 动力学参数等信息。
• 概念于20世纪70年代提出，90年代开始 发展。（计算机技术、光学检测技术、 激光共焦技术）
Rhodamine green 488nm激发
相关公式
• 微区内荧光分子数在任一时间t的变化导致荧光 强度的涨落值为：
• 用归一化自相关函数将荧光涨落与延迟时间τ 相关：
二、相关实验技术
• 激光器 • 共焦显微镜 • 高数值孔径物镜
• 1.单光子激发
• 2.双光子激发
• 3.荧光互相关光谱：
• 分子量之差小于8倍，扩散系数之差小于2倍。 • 标记两种不同荧光试剂，两个独立激光器激发，两个
• B.胞内 • 线粒体中NADH、黄素蛋白有自发荧光
• 乳胶微球在细胞内的扩散行为 • 寡聚核苷酸在细胞核内的分子运动 • β-半乳糖酶融合蛋白在胞内的运动
3.核酸研究 • DNA PCR扩增动力学研究 • DNA单个分子构象波动
4.疾病诊断
• 结合PCR扩增或其他扩增
• HIV • HBV、HCV、SARS • 朊病毒
三、应用
• 1.生物分子相互作用 • 金环蛇毒素和乙酰胆碱受体的作用 • 组氨酸标记肽与金属螯合脂的作用 • 转铁蛋白与人转铁蛋白受体的作用 • 秋水仙碱与微管蛋白的作用 • ……
2.活细胞相关研究
• A.细胞膜 • 磷脂双分子层4nm厚，可按二维模型处理
• 胰岛素原C-肽与人细胞膜的相互作用 • 表皮增长因子与膜结合受体的特异结合 • 神经肽在胰腺癌细胞细胞膜的结合作用
一、概念
• FCS通过测定溶液中微区内（fL）发光粒 子因布朗运动或化学反应而产生的荧光 涨落现象，分析荧光涨落的相关函数而 获得单个粒子（如分子）的浓度、化学 动力学参数等信息。
• 概念于20世纪70年代提出，90年代开始 发展。（计算机技术、光学检测技术、 激光共焦技术）
Rhodamine green 488nm激发
相关公式
• 微区内荧光分子数在任一时间t的变化导致荧光 强度的涨落值为：
• 用归一化自相关函数将荧光涨落与延迟时间τ 相关：
二、相关实验技术
• 激光器 • 共焦显微镜 • 高数值孔径物镜
• 1.单光子激发
• 2.双光子激发
• 3.荧光互相关光谱：
• 分子量之差小于8倍，扩散系数之差小于2倍。 • 标记两种不同荧光试剂，两个独立激光器激发，两个
• B.胞内 • 线粒体中NADH、黄素蛋白有自发荧光
• 乳胶微球在细胞内的扩散行为 • 寡聚核苷酸在细胞核内的分子运动 • β-半乳糖酶融合蛋白在胞内的运动
3.核酸研究 • DNA PCR扩增动力学研究 • DNA单个分子构象波动
4.疾病诊断
• 结合PCR扩增或其他扩增
• HIV • HBV、HCV、SARS • 朊病毒
荧光分光光度法.精选PPT
第八章荧光分光光度法
优选第八章荧光分光光度 法
§ 8- 1 概述
一、分，电子从基态跃迁到激发 态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分 子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析 法
较高激发态
吸收能
光辐射
量受激
退激
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激 返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激
2. 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的 能量以热的形式释放。包括：
内部转换（IC）—相同的多重态之间的转换 S-S
系间窜跃（ISC）—不同的多重态之间的转换 S-T
去激发光 * * n
基态
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电
子自旋方向总是相反的 ，处于基态单重态。用 “S0”
表示 ；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强
振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级 的过程
外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移， 使荧光或磷光强度减弱或消灭
发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内部转换困难
VR
VR：振动驰豫
S2
IC：内部转换
IC
ISC：系间窜跃
VR 计算 I前/I后
T1
优选第八章荧光分光光度 法
§ 8- 1 概述
一、分，电子从基态跃迁到激发 态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分 子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析 法
较高激发态
吸收能
光辐射
量受激
退激
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激 返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激
2. 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的 能量以热的形式释放。包括：
内部转换（IC）—相同的多重态之间的转换 S-S
系间窜跃（ISC）—不同的多重态之间的转换 S-T
去激发光 * * n
基态
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电
子自旋方向总是相反的 ，处于基态单重态。用 “S0”
表示 ；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强
振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级 的过程
外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移， 使荧光或磷光强度减弱或消灭
发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内部转换困难
VR
VR：振动驰豫
S2
IC：内部转换
IC
ISC：系间窜跃
VR 计算 I前/I后
T1
第三章紫外可见分光光度法ppt课件
2、影响紫外吸收光谱的主要因素
二苯乙烯顺式反式异构体的紫外吸收光谱
2、影响紫外吸收光谱的主要因素
(2) 跨环效应 跨环效应指非共轭基团之间的相互作用。 如对亚甲基环丁酮在214nm处出现一中等强度的吸收 带，同时284nm处出现R带。 这是由于结构中虽然双键与酮基不产生共轭体系，但 适当的立体排列，使羰基氧的孤电子对与双键的π电子 发生作用，相当于n→π*跃迁的R带向长波移动。
苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）
4、E带——芳香族化合物特征吸收带
由苯环结构中3个乙烯的环 状共轭系统的π →π*跃迁所 引起。 分为E1和E2两个吸收带。 E1 吸 收 带 约 在 184nm ， εmax=60000 ，强吸收带。 E2 吸 收 带 在 204nm 以 上 ， εmax=8000 ，强吸收带。
2、K带——Konjugation(共轭作用)
由共轭双键中π →π*跃迁引起。 吸收峰出现在200nm以上，吸收强度大（ε＞105）。 随着共轭双键的增加，吸收峰红移，吸收强度有所增加。 如丁二烯λmax =217nm为K带。
3、B带——benzenoid(苯)
芳香族（包括杂芳香族） 特征吸收带。 由苯等芳香族化合物的π →π*跃迁所引起的吸收带 之一。 吸 收 峰 出 现 在 230~270nm 之间，中心波长256nm。 在极性溶剂中，B带精细 结构变得不明显或消失。
22
1、有机化合物的紫外吸收光谱
(2)不饱和烃及共轭烯烃 含孤立双键或叁键的简单不饱和脂肪化合物，可以产生σ→σ* 和π→π*两种跃迁。 最大吸收波长λmax小于200nm。 具有共轭体系的不饱和化合物，共轭体系越长，跃迁时所需能 量越小，吸收峰红移越显著。 如1,3,5,7,9,11-十二烷基六烯λmax为364nm，εmax为138000。
荧光光谱分析法-课件
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关
电子可以跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一
个发射态，如l 3 。
为什么？
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c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似,故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关,各小峰的 高度与跃迁 几率有关。
电子能级的多重性 M=2S+1
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则),三重态能级比相应
单重态能级低;
大多数有机分子的基态处于单重态；
11
小结:激发单重态与激发三重态的不同√
激发单重态分子中没有净电子自旋,因而具有反磁性;激发 三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态 的长（10-4~10s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻 跃迁
2008年诺贝尔化学奖
2
3
澳大利亚科学家最新发现, 一种叫“螳螂虾”的海里 动物通过发出色彩鲜艳的 荧光来恐吓警告敌对者或 者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之 原生动物
4
green-fluorescent protein (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
S0→S1、S2 允许跃迁; S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小；
12
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
分光光度法专业知识课件
E1’ molecular vibration E1’’ molecular rotation E0 Ground level
互补（色）光
complementary colors
第一节 分光光度法 基本原理
若溶液选择性地吸收了某种颜色旳光， 则溶液呈吸收光旳互补色。
二．物质旳吸收光谱
用不同波长旳单色光依次
① c 一定, A∝b Lambert ② b 一定, A∝c Beer
A =εbc
三、Lambert-Beer定律
A =bc
溶液厚度b, 单位:cm
浓度c，单位molL-1
摩尔吸光系数，单位Lmol -1cm-1
若用质量浓度替代c
A = ab
质量浓度 , 单位: gL-1
质量吸光系数a, 单位: Lg -1cm-1
常用参比溶液
成份 溶剂 显色剂
溶剂空白 √ ×
试样
×
其他 合用范 围
× 显色剂、试 样均无吸收
试剂空白 √ √ 试样空白 √ ×
×
√ 试样无吸收 显色剂有吸
收
√
√ 显色剂无吸 收，试样有
吸收
第四节
提升测量敏捷度和精确度旳措施 自学 要点看： 分光光度法旳误差起源 显色剂旳选择 测定条件旳选择
本章小结
As，在相同条件下测出试样溶液旳吸光度 Ax，则试样溶液浓度cs可按下式求得：
Ax /As= cx / cs cx = cs Ax /As
参比（空白）溶液 blank
I 参比溶液旳作用：扣除一切不起源于 目旳产物旳光吸收。
如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物旳影响。
常用参比溶液：
①溶剂空白 ②试剂空白 ③试样空白
荧光分光光度法
第二节 分子荧光强度的影响因素
一、荧光与有机化合物的结构
1. 跃迁的类型 对于有机荧光物质: 对于有机荧光物质: n →π* εmax＜ 100 平均寿命10 平均寿命10-5~10-7sec π→π* εmax≥104 平均寿命10 平均寿命10-7~10-9sec kS → T小 π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 强荧光的有机化合物具备下特征: 强荧光的有机化合物具备下特征 具有大的共轭π键结构 键结构； ①具有大的共轭 键结构； 具有刚性的平面结构； ②具有刚性的平面结构； ③具有最低的单重电子激发态为S1为π * →π型； 具有最低的单重电子激发态为 型 取代基团为给电子取代基。 ④取代基团为给电子取代基。
4 3 2 1
S0
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
λex =290nm (MAX)
λ
λem= 620nm(MAX) 620nm(MAX)
2. 三维荧光光谱 I F ∝f (λex 、λem) 固定发射波长、扫描激发波长 固定发射波长、
1−
It = 1 −T = 1 − e−2.303εbC I0
I0 − It = I0 ( 1− e−2.303εbC )
荧光强度（ 与相应的吸光分数成正比： 荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：
IF =φ( I0 − It ) = φI0 ( 1− e−2.303εbC )
按照级数展开式： 按照级数展开式：
C. 激发光谱与发射 光谱的镜像关系
4 3 2 1
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
荧光分光光度计课件
光学分析仪器培训
22
荧光分光光度法 3、荧光分光光度法的特点
（5）受外界影响较大 ， 外界因素如温度、 PH值、溶剂和其它因素都可能显著地影响分析 结果。其中温度对他的影响最大，这也是荧光 分析需标准的原因。
2017/4/23
光学分析仪器培训
23
荧光分光光度法 3、荧光分光光度法的特点
3.2、荧光分光光度法的发展 近年来，荧光分光度计随着新技术的的采用，
2017/4/23 光学分析仪器培训 8
荧光分光光度法 1、荧光分光光度法简介
分子能级图：
2017/4/23
光学分析仪器培训
9
荧光分光光度法 2、荧光分光光度计的基本结构
F-7000荧光分光光度计
2017/4/23
光学分析仪器培训
10
荧光分光光度法 2、荧光分光光度计的基本结构
荧光分析仪器的结构和主要部件：
2017/4/23 光学分析仪器培训 28
荧光分光光度法 3、荧光分光光度法的特点
3.3、荧光和分子的关系： 取代基的类型和位置：取代基对荧光体的影响分 为加强荧光的、减弱荧光的和影响不明显的。
加强荧光的取代基有—OH—ORR—NH2—
CN、—NHR、—NR2、—OCH3等给电子取代基，由
于它们n电子的电子云几乎与芳环上的π轨道平行，因
发展非常快，特别是计算机和其它先进技术应用的引
入，是荧光光度计发生了根本的变化，相应的分析方 法也得到很快的发展，象激光荧光分析技术、时间分 辨荧光分光光度法、同步荧光分析法，这些又大的推 动了分析方法在理论和应用方面的进展。同时促进荧
光分析技术的不断完善。
2017/4/23 光学分析仪器培训 24
荧光分光光度法课件
实验证明：O2的熄灭作用，似乎是随溶 剂的介电常数的减小而增加，所以O2在水溶 液中熄灭作用较小，而在有机溶剂中熄灭作 用较强。
荧光分光光度法课件
（d）发生电子转移反应的熄灭
某些熄灭剂分子与荧光物质的分子相互 作用时，发生了电子转移的反应，即氧化还原反应，因而引起荧光的熄灭。
例：甲基兰荧光溶液被Fe2+熄灭
重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某 些杂环化合物，容易转入三重线级，溶液中 绝大部分转入三重线级的分子在一般温度下 不发光，它们将多余的能量消耗于它们与其 它分子的碰撞之中，因而荧光产生熄灭作用。 这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激 发态的荧光物质分子相作用，促进形成顺磁 性的三重态荧光分子，即加速系间窜跃所致。
D* + Fe2+ D- + Fe3+
有荧光
无荧光
荧光分光光度法课件
发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金 属离子，I-， Br-，S2O32-等易于给出电子的 阴离子对奎宁、罗丹明及荧光素钠等有机荧 光物质也会发生熄灭作用。
荧光分光光度法课件
（e）荧光物质的自熄灭 荧光物质溶液的浓度大于1g/L时，常常
散射和拉曼散射、器壁的散射及胶粒的散射 （丁铎尔散射）。
荧光分光光度法课件
当物质分子吸收了频率较低的光能后， 并不足使分子中的电子跃迁到电子的激发态， 而只是上升到基态中较高的振动能级上去， 若在10-15~10-12s返回到原能级，此时辐射出 和激发光相同波长的光，称为瑞利散射。
荧光分光光度法课件
荧光分光光度法课件
❖ 氙弧灯（氙灯）是连续光源，发射光束强 度大，可用于200~700nm波长范围。在200~ 400 nm波段内，光谱强度几乎相等。
荧光分光光度法课件
（d）发生电子转移反应的熄灭
某些熄灭剂分子与荧光物质的分子相互 作用时，发生了电子转移的反应，即氧化还原反应，因而引起荧光的熄灭。
例：甲基兰荧光溶液被Fe2+熄灭
重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某 些杂环化合物，容易转入三重线级，溶液中 绝大部分转入三重线级的分子在一般温度下 不发光，它们将多余的能量消耗于它们与其 它分子的碰撞之中，因而荧光产生熄灭作用。 这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激 发态的荧光物质分子相作用，促进形成顺磁 性的三重态荧光分子，即加速系间窜跃所致。
D* + Fe2+ D- + Fe3+
有荧光
无荧光
荧光分光光度法课件
发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金 属离子，I-， Br-，S2O32-等易于给出电子的 阴离子对奎宁、罗丹明及荧光素钠等有机荧 光物质也会发生熄灭作用。
荧光分光光度法课件
（e）荧光物质的自熄灭 荧光物质溶液的浓度大于1g/L时，常常
散射和拉曼散射、器壁的散射及胶粒的散射 （丁铎尔散射）。
荧光分光光度法课件
当物质分子吸收了频率较低的光能后， 并不足使分子中的电子跃迁到电子的激发态， 而只是上升到基态中较高的振动能级上去， 若在10-15~10-12s返回到原能级，此时辐射出 和激发光相同波长的光，称为瑞利散射。
荧光分光光度法课件
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❖ 氙弧灯（氙灯）是连续光源，发射光束强 度大，可用于200~700nm波长范围。在200~ 400 nm波段内，光谱强度几乎相等。
第3章荧光分析法ppt课件
3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N
CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有
荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强
⑶ 取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而 吸电子取代基则使荧光强度降低。
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 长共轭结构示例 比较：λex (nm)/ λem (nm)/ f
苯 205/278/0.11
萘 286/321/0.29
蒽 356/404/0.36
2. 荧光和磷光的产生
➢ 辐射跃迁－发光失活 荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>
2. 荧光和磷光的产生
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
➢ 例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和
散射光谱
H
O H3C
H HO
N H
CH CH2
1/2H2SO4 H2O
N
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N
CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有
荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强
⑶ 取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而 吸电子取代基则使荧光强度降低。
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 长共轭结构示例 比较：λex (nm)/ λem (nm)/ f
苯 205/278/0.11
萘 286/321/0.29
蒽 356/404/0.36
2. 荧光和磷光的产生
➢ 辐射跃迁－发光失活 荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>
2. 荧光和磷光的产生
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
➢ 例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和
散射光谱
H
O H3C
H HO
N H
CH CH2
1/2H2SO4 H2O
N
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
荧光分光光度法共49页
，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
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平行自旋比成对自旋稳定（洪特规则）， 三重态能级比相应单重态能级低。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 激发态→基态的能量传递途径： （1）多种途径和方式（见能级图）：返回 速度最快、 激发态寿命最短（停留时间短） 的途径占优势，发生的几率大，发光强度相 对大。
（2）第一、第二、…电子激发单重态表示 为S1、S2…；
❖ 相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法 的应用较多。
本章主要讨论荧光分析。
第三章荧光分光光度法[002]
3.1 分子荧光产生的本质(Molecular Fluorescence)
图3-1 吸收第光三谱章荧和光分荧光光光度光法[0谱02]能级跃迁示意图
❖ 电子激发态的多重度：M=2S+1（S为电子 自旋量子数的代数和（0或1）
第一、第二、…电子激发三重态表示 为T1、T2…。
第三章荧光分光光度法[002]
（3）电子处于激发态是不稳定状态，返回基 态时，通过辐射跃迁（发光）和无辐射跃迁 等方式失去能量； （4）辐射跃迁：荧光、延迟荧光和磷光；
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 无辐射跃迁（非辐射能量传递过程）：系间 跨越、内转移、外转移和振动弛豫。
第三章荧光分光光度法[002]
时至今日，荧光分析在方法上取得了极 大的进展。促进了诸如时间分辨、相分辨、 荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析 新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光 分析仪器的出现。
第三章荧光分光光度法[002]
在仪器化方面，微机控制的全自动荧光 分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光 度法高2~3个数量级）、选择性好、工作曲 线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光 谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振 和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重 要的痕量分析技术。
❖ 通过化学反应使分子受激而发光称为“化 学发光”。利用化学发光进行分析工作叫 “化学发光分析”。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称 为“分子发光分析(molecular luminescence)”。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 荧光和磷光同属光致发光。通过测定发光 的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有 机物。
第三章荧光分光光度法[002]
在生物、医学、医药、环境和石油工业 等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。 不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物， 而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多 无机元素的测定。
第三章荧光分光光度法[002]
随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质进一步被揭 开。
需要注意的是： （1）整个过程是在单线态之间进行的；
（2）产生荧光的过程极快，约在10-8秒左右 内完成；
（3）荧光的产生是由第一电子激发态的最低
振动能级开始，而与荧光分子被激发至哪一
个能级无关。
因此，荧光光谱的形状和激发光的波长
无关。
第三章荧光分光光度法[002]
2. 磷光（Phosphorescence） 当某些物质分子被激发到较高的能级，
1.产生荧光的原因 荧光物质的分子吸收了特征频率的光能
后，由基态跃迁到能级较高的第一电子激发 态或第二电子激发态，然后通过无辐射跃迁 返回到第一电子激发态的最低振动能级上， 再从该能级降落至基态的各个不同的振动能 级上，同时放出相应能量的分子荧光，最后 以无辐射形式回到基态的最低振动能级。
第三章荧光分光光度法[002]
第三章荧光分光光度法[002]
3. 迟滞荧光（延迟荧光） 某些分子在跃迁至三重线态之后，通过
热激活作用，可以再回升至第一电子激发态 的各振动能级上，然后再由第一电子激发态 的最低振动能级（v=0）降落至基态的各个不 同振动能级而发出荧光，这种光叫做迟滞荧 光（或：延迟荧光）。
（1）振动弛豫：激发态分子由同一电子能级 中的较高振动能级转至较低振动能级的过程， 其效率较高。发生振动弛豫的时间10-12s。 （2）内转换：相同多重态的两个电子能级间， 电子由高能级回到低能级的分子内过程。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的 电子跃迁回第一激发单重态的最低振动能级。
第三章荧光分光光度法[002]
第ometry)
第三章荧光分光光度法[002]
前言： ❖ 1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在 暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光， 他把这种光命名为“荧光”。
❖ 1868年 Goppelstroeder发表了利用Al-桑色 素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见 荧光分析是一种历史悠久的分析方法。
并通过无辐射跃迁降落至第一电子激发态的 最低振动能级之后，尚不能继续直接降落至 基态，而是通过另一次无辐射跃迁降至一个 中间的亚稳态能级—三重线态上，这些分子 在三重线态上经短暂停留后，再降落至基态 的各个不同的振动能级上，同时发出辐射光， 称这种发出的辐射光为磷光。
第三章荧光分光光度法[002]
磷光与荧光的区别主要为： （1）产生磷光的过程稍长，约在10-5秒~0.1 秒，有时长达1秒以上； （2）两者发光机理不同； （3）在辐射停止几秒或更长一段时间后，仍 能检测到磷光，而上述荧光现象在照射光一 旦停止照射，荧光便立即消失。
（3）外转换：激发分子与溶剂或其它分子之 间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
（4）系间跨越：不同多重态，有重叠的转动 能级间的非辐射跃迁。/激发态分子的电子自 旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过 程。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋-轨 道耦合进行。 第三章荧光分光光度法[002]
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 除了吸收光能使分子激发而发光，根据起 始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发 光类型（例如：生物发光、热发光、化学发 光和摩擦发光）区别开来。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 激发态→基态的能量传递途径： （1）多种途径和方式（见能级图）：返回 速度最快、 激发态寿命最短（停留时间短） 的途径占优势，发生的几率大，发光强度相 对大。
（2）第一、第二、…电子激发单重态表示 为S1、S2…；
❖ 相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法 的应用较多。
本章主要讨论荧光分析。
第三章荧光分光光度法[002]
3.1 分子荧光产生的本质(Molecular Fluorescence)
图3-1 吸收第光三谱章荧和光分荧光光光度光法[0谱02]能级跃迁示意图
❖ 电子激发态的多重度：M=2S+1（S为电子 自旋量子数的代数和（0或1）
第一、第二、…电子激发三重态表示 为T1、T2…。
第三章荧光分光光度法[002]
（3）电子处于激发态是不稳定状态，返回基 态时，通过辐射跃迁（发光）和无辐射跃迁 等方式失去能量； （4）辐射跃迁：荧光、延迟荧光和磷光；
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 无辐射跃迁（非辐射能量传递过程）：系间 跨越、内转移、外转移和振动弛豫。
第三章荧光分光光度法[002]
时至今日，荧光分析在方法上取得了极 大的进展。促进了诸如时间分辨、相分辨、 荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析 新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光 分析仪器的出现。
第三章荧光分光光度法[002]
在仪器化方面，微机控制的全自动荧光 分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光 度法高2~3个数量级）、选择性好、工作曲 线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光 谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振 和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重 要的痕量分析技术。
❖ 通过化学反应使分子受激而发光称为“化 学发光”。利用化学发光进行分析工作叫 “化学发光分析”。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称 为“分子发光分析(molecular luminescence)”。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 荧光和磷光同属光致发光。通过测定发光 的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有 机物。
第三章荧光分光光度法[002]
在生物、医学、医药、环境和石油工业 等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。 不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物， 而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多 无机元素的测定。
第三章荧光分光光度法[002]
随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质进一步被揭 开。
需要注意的是： （1）整个过程是在单线态之间进行的；
（2）产生荧光的过程极快，约在10-8秒左右 内完成；
（3）荧光的产生是由第一电子激发态的最低
振动能级开始，而与荧光分子被激发至哪一
个能级无关。
因此，荧光光谱的形状和激发光的波长
无关。
第三章荧光分光光度法[002]
2. 磷光（Phosphorescence） 当某些物质分子被激发到较高的能级，
1.产生荧光的原因 荧光物质的分子吸收了特征频率的光能
后，由基态跃迁到能级较高的第一电子激发 态或第二电子激发态，然后通过无辐射跃迁 返回到第一电子激发态的最低振动能级上， 再从该能级降落至基态的各个不同的振动能 级上，同时放出相应能量的分子荧光，最后 以无辐射形式回到基态的最低振动能级。
第三章荧光分光光度法[002]
第三章荧光分光光度法[002]
3. 迟滞荧光（延迟荧光） 某些分子在跃迁至三重线态之后，通过
热激活作用，可以再回升至第一电子激发态 的各振动能级上，然后再由第一电子激发态 的最低振动能级（v=0）降落至基态的各个不 同振动能级而发出荧光，这种光叫做迟滞荧 光（或：延迟荧光）。
（1）振动弛豫：激发态分子由同一电子能级 中的较高振动能级转至较低振动能级的过程， 其效率较高。发生振动弛豫的时间10-12s。 （2）内转换：相同多重态的两个电子能级间， 电子由高能级回到低能级的分子内过程。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的 电子跃迁回第一激发单重态的最低振动能级。
第三章荧光分光光度法[002]
第ometry)
第三章荧光分光光度法[002]
前言： ❖ 1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在 暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光， 他把这种光命名为“荧光”。
❖ 1868年 Goppelstroeder发表了利用Al-桑色 素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见 荧光分析是一种历史悠久的分析方法。
并通过无辐射跃迁降落至第一电子激发态的 最低振动能级之后，尚不能继续直接降落至 基态，而是通过另一次无辐射跃迁降至一个 中间的亚稳态能级—三重线态上，这些分子 在三重线态上经短暂停留后，再降落至基态 的各个不同的振动能级上，同时发出辐射光， 称这种发出的辐射光为磷光。
第三章荧光分光光度法[002]
磷光与荧光的区别主要为： （1）产生磷光的过程稍长，约在10-5秒~0.1 秒，有时长达1秒以上； （2）两者发光机理不同； （3）在辐射停止几秒或更长一段时间后，仍 能检测到磷光，而上述荧光现象在照射光一 旦停止照射，荧光便立即消失。
（3）外转换：激发分子与溶剂或其它分子之 间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
（4）系间跨越：不同多重态，有重叠的转动 能级间的非辐射跃迁。/激发态分子的电子自 旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过 程。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋-轨 道耦合进行。 第三章荧光分光光度法[002]
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
第三章荧光分光光度法[002]
❖ 除了吸收光能使分子激发而发光，根据起 始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发 光类型（例如：生物发光、热发光、化学发 光和摩擦发光）区别开来。