中和试验方法操作规程

中和试验方法操作规程

1.目的：建立中合实验法，统一操作标准，确保产品质量。

2.适用范围：公司生物制品效价测定的中合实验。

3.责任：质检人员有按此程序进行操作的责任，质量管理部经理有检查监督的责任。

4.程序：

4.1：实验前准备

①、9-10日龄的SPF鸡胚、病毒。

②、样品稀释管、病毒稀释管、打孔器、镊子、5ml吸头、1ml、200ul吸头各一盒、废弃物缸、烧杯，以上物品均需灭菌处理

③、照蛋器、电炉、旋涡混合器、5ml微量移液器、1ml微量移液器、200ul微量移液器、记号笔、酒精棉球、碘棉、打火机、蜡、玻璃棒、无菌手套

④、实验开始前记得要使房间温度达到30摄氏度左右，房间要紫外照射30min，生物安全柜紫外照射30min准备要用的检测用品同步放在生物安全柜里紫外照射。

4.2：稀释

①、将样品用生理盐水2倍系列稀释，使之成1:2;1:4;1:8;1:1;,1:32;1:64;1:128;1:256；1:512；1:1024......。

②、病毒的稀释：将病毒稀释成每单位剂量含200ELD50.。例如：病毒ELD50=10-8.375/0.1ml,将病毒稀释成每单位剂量含200ELD50的稀释倍数=108.375/200=1.2*106。即将病毒稀释 1.2*106倍即为200ELD50/0.1ml。

③、准备七根试管（或EP管），编号1-7，在1号管中加入0.2ml 灭菌生理盐水，2-7号管中各加入9ml 灭菌生理盐水.再将ELD50=108.375/0.1ml 的病毒取1ml加入1号管中震荡混匀，再从1号管中取1ml加入2号管中震荡混匀,依次10倍系列稀释至第7管。(依据最后接种量和接种鸡胚数计算出中和抗体用病毒的量,7号管可以多稀释几支备用。)

4.3：中和:将稀释成每单位剂量含200 ELD50的病毒与等量的2倍系列稀释的待检样品混合,37度中和1小时,准备接种鸡胚。

4.4：在中和的一个小时里准备工作:

①、照蛋,弃掉发育不好的和活力不强的鸡胚,

②、在血管较少的部位画出气室,

③、然后消毒鸡胚(先用碘棉酒毒再用酒精格脱碘),

④、随机分组,、编号:一个样品稀释度为一组,每个稀释度3~6枚鸡胚,进行编号。

⑤、然后在气室画出部位打孔(孔不宜太大也不宜太小,以刚好能插入针尖为宜)。

4.5:接种:每枚鸡胚接种0.2ml 中和后的相应稀释度的液体。接种完毕用石蜡将针孔封好,要仔细检查,确保封好,将封好口的鸡胚放置37度孵化箱继续孵育。

4.6:观察

①、24h照蛋,弃掉24h以内死亡的鸡胚.

②、每天观察确保孵化箱内温度、湿度。

③、七天后打蛋,记录实验结果。

距离比例=（高于或等于50%保护-50%）/（高于或等于50%保护-低于50%保护率）=（63.64%-50%）/（63.64%-45.45）=0.75

Lg中和效价=高于或等于50%保护率的稀释度的对数+距离比例*稀释系数的对数=Lg1/1024+0.75*Lg1/2=-3.01+0.75*(-0.30)=-3.24

中和效价=10-3.24=1：1737.8

4.8：注意

①、操作全过程要注意无菌操作。

②、打孔时要注意力度，孔不宜太大也不宜太小，以刚好能插入针尖为宜。

③、注意根据接种鸡胚枚数和接种量计算出所需的病毒、血清中和后液体的量，再进一步计算出所需病毒的量，以备稀释时心中有数。

④、封口时要封严，以防感染。

⑤、系列稀释时和接种鸡胚时要注意更换枪头和注射器。

⑥、接种时要将接种液混匀。

⑦、注意个人安全和环境安全。