临床生物化学检验常用技术ppt课件 ppt课件
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熟悉离心技术，其它电泳技术和层析技术 中的HPLC及亲和层析的原理和应用；免疫分析 技术、生物传感技术的概念和应用原理。
了解色谱、层析等常用生化技术的应用原 理和方法，生物芯片技术的概念和应用原理。
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5
第一节 光谱分析技术
分光光度技术的基本原理 分光光度计的基本结构 分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法
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23
第二节电化学分析技术
电化学法概述
电化学分析：利用物质的电化学性质， 测定化学电池的电位、电流或电量的变 化进行分析的方法。主要有：电位法、 电导法、电容法。
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24
电位分析法基本原理
❖ 电位分析法是利用电极电位和浓度之间关 系来确定物质含量的分析方法。电极电位 由能斯特方程式确立。电极电位测定是通 过构建原电池电动势，其中一个电极的电 位随待测离子尝浓度改变而改变（指示电 极）；另一电极电位不受试液影响（参比 电极），通过测定原电池的电动势便可求 得待测离子浓度。
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6
❖ 光的本性 光的描述：波长和能量 可见光：400nm~760nm 紫外光:200 nm~400nm 红外光: 760nm~1000nm
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7
n 光谱分析技术原理：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征， 以此来确定物质性质、结构或含量。
光谱分析技术分类：
发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法
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12
❖ 1、光学因素
❖ 2、化学因素
❖ 3、为什么有的分光光度计使用双波长或双 光束？
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13
① 光源及光源要求
❖ 波长的选择原则:可按“吸收最大， 干扰最小”的原则进行。
❖ 2、单色器
❖ 3、比色杯及要求
❖ 4、检测器与显示器
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14
❖ 分光光度计的使用
1、开启电源，将比色池盖打开，通电20分钟 预热
吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光
度法和红外光谱法
散射光谱分析技术：比浊法
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8
一、分光光度技术的基本原理
（一）吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光 被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光 强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：
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22
制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
（1）浓度范围足够大 （2）减少偶然误差 （3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。
（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。
（5）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘 制。
（6）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。
2、调节波长
3、将空白液、标准液及样品液置于光路
4、空白调节T为0、100%
5、调A为0
6、重复4和5
7、测量标准和样品吸光度。
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15
（二）吸光度的校正
铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光 度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光 度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可 检测仪器吸光度的准确度。
T = I/I0
T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度 即：
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
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9
（二）Lambert-Beer定律
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其 表达式为：
第3章
临床生物化学检验常用技术
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1
本章主要内容
① 光谱检验技术 ② 电化学分析技术 ③ 电泳技术 ④ 干化学技术 ⑤ PCR技术
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2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
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16
四、分光光度技术的定性和定量方法
（一）分光光度技术的定性方法 定性依据：
最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε
wk.baidu.com
1.最大吸收波长λmax方法 2.摩尔消光系数ε方法
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17
❖ 1、对比法 1、将已知浓度的标准品和待测溶液有同一
方法、在相同条件下同时进行测定。
2、当标准液与标本用量可能不同时的测定。
标准液的要求：其浓度尽量接 近于样品浓度。（双标准）
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18
❖ 2.标准曲线法 用途：
1、确定分析范围 2、减少系统误差 3、比较方法的灵敏度
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19
方法：
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范 围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准 品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标 本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度， 以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对 应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标 准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可 查出其相应的浓度。
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
教学目标和要求
掌握光谱分析中的对比法、摩尔吸收系数
法、比浊法测定的方法原理，在生化检验中的 应用及注意事项；区带电泳的原理、应用及影 响因素；离子选择性电极法测定的原理和注意 事项。
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20
❖ 1、制备标准液 ❖ 2、显色反应 ❖ 3、比色 ❖ 4、作图 ❖ 5、制作检量表。
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21
标准曲
1
线法
0.5
吸光度
0 0 20 40 60 80 100
标准曲线
浓度
将一系列浓度不同的标准溶液按照、 一定操作过程显色后， 分别测吸光度，以吸光度为纵坐标， 浓度为横坐标绘制标准曲线。 从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度， 即标准曲线法。
A = KLC
（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）
式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液 层厚度，称为光径；C为溶液浓度
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10
Ａ
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
Y=ax+b
０１
２
３
４Ｃ
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11
吸光系数的应用
❖ １、定性 ❖ ２、判断方法的灵敏度 ❖ ３、定量测定物质浓度
了解色谱、层析等常用生化技术的应用原 理和方法，生物芯片技术的概念和应用原理。
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第一节 光谱分析技术
分光光度技术的基本原理 分光光度计的基本结构 分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法
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23
第二节电化学分析技术
电化学法概述
电化学分析：利用物质的电化学性质， 测定化学电池的电位、电流或电量的变 化进行分析的方法。主要有：电位法、 电导法、电容法。
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电位分析法基本原理
❖ 电位分析法是利用电极电位和浓度之间关 系来确定物质含量的分析方法。电极电位 由能斯特方程式确立。电极电位测定是通 过构建原电池电动势，其中一个电极的电 位随待测离子尝浓度改变而改变（指示电 极）；另一电极电位不受试液影响（参比 电极），通过测定原电池的电动势便可求 得待测离子浓度。
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❖ 光的本性 光的描述：波长和能量 可见光：400nm~760nm 紫外光:200 nm~400nm 红外光: 760nm~1000nm
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n 光谱分析技术原理：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征， 以此来确定物质性质、结构或含量。
光谱分析技术分类：
发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法
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❖ 1、光学因素
❖ 2、化学因素
❖ 3、为什么有的分光光度计使用双波长或双 光束？
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① 光源及光源要求
❖ 波长的选择原则:可按“吸收最大， 干扰最小”的原则进行。
❖ 2、单色器
❖ 3、比色杯及要求
❖ 4、检测器与显示器
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❖ 分光光度计的使用
1、开启电源，将比色池盖打开，通电20分钟 预热
吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光
度法和红外光谱法
散射光谱分析技术：比浊法
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一、分光光度技术的基本原理
（一）吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光 被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光 强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：
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22
制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
（1）浓度范围足够大 （2）减少偶然误差 （3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。
（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。
（5）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘 制。
（6）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。
2、调节波长
3、将空白液、标准液及样品液置于光路
4、空白调节T为0、100%
5、调A为0
6、重复4和5
7、测量标准和样品吸光度。
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15
（二）吸光度的校正
铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光 度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光 度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可 检测仪器吸光度的准确度。
T = I/I0
T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度 即：
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
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（二）Lambert-Beer定律
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其 表达式为：
第3章
临床生物化学检验常用技术
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1
本章主要内容
① 光谱检验技术 ② 电化学分析技术 ③ 电泳技术 ④ 干化学技术 ⑤ PCR技术
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
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四、分光光度技术的定性和定量方法
（一）分光光度技术的定性方法 定性依据：
最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε
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1.最大吸收波长λmax方法 2.摩尔消光系数ε方法
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❖ 1、对比法 1、将已知浓度的标准品和待测溶液有同一
方法、在相同条件下同时进行测定。
2、当标准液与标本用量可能不同时的测定。
标准液的要求：其浓度尽量接 近于样品浓度。（双标准）
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❖ 2.标准曲线法 用途：
1、确定分析范围 2、减少系统误差 3、比较方法的灵敏度
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19
方法：
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范 围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准 品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标 本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度， 以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对 应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标 准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可 查出其相应的浓度。
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
教学目标和要求
掌握光谱分析中的对比法、摩尔吸收系数
法、比浊法测定的方法原理，在生化检验中的 应用及注意事项；区带电泳的原理、应用及影 响因素；离子选择性电极法测定的原理和注意 事项。
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❖ 1、制备标准液 ❖ 2、显色反应 ❖ 3、比色 ❖ 4、作图 ❖ 5、制作检量表。
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标准曲
1
线法
0.5
吸光度
0 0 20 40 60 80 100
标准曲线
浓度
将一系列浓度不同的标准溶液按照、 一定操作过程显色后， 分别测吸光度，以吸光度为纵坐标， 浓度为横坐标绘制标准曲线。 从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度， 即标准曲线法。
A = KLC
（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）
式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液 层厚度，称为光径；C为溶液浓度
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Ａ
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
Y=ax+b
０１
２
３
４Ｃ
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吸光系数的应用
❖ １、定性 ❖ ２、判断方法的灵敏度 ❖ ３、定量测定物质浓度