核酸提取与鉴定共52页文档
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取核酸（DNA 或 RNA）的基本原理和方法。
2、学习使用各种试剂和仪器进行核酸提取的操作步骤。
3、了解核酸鉴定的常用方法及其原理。
4、培养实验操作技能和科学研究的严谨态度。
二、实验原理核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生物体遗传信息的携带者。
核酸提取的基本原理是利用细胞裂解液将细胞破碎，使核酸释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法将核酸与其他细胞成分分离，最后得到纯度较高的核酸样品。
DNA 提取常用的方法有酚氯仿抽提法、盐析法等。
酚氯仿抽提法是利用酚和氯仿的混合液去除蛋白质，然后通过乙醇沉淀得到 DNA。
盐析法是利用高浓度的盐使蛋白质变性沉淀，从而分离出 DNA。
RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法、Trizol 法等。
Trizol 法是基于异硫氰酸胍和酚的作用，能够有效地裂解细胞并抑制 RNA 酶的活性，从而提取出完整的 RNA。
核酸鉴定的方法主要有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。
紫外分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 处的吸光度值（A260 和 A280）来评估核酸的纯度和浓度。
A260/A280 的比值在 18 20 之间表示 DNA 纯度较高，在 19 21 之间表示 RNA 纯度较高。
琼脂糖凝胶电泳法则是根据核酸分子在电场中的迁移率不同来分离和鉴定核酸，DNA 分子在琼脂糖凝胶中迁移距离与分子量大小成反比，RNA 通常会呈现出 28S、18S 和 5S 三条带。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）或培养的细胞。
大肠杆菌菌液。
2、实验试剂细胞裂解液（含蛋白酶 K）。
酚氯仿混合液（酚：氯仿＝ 1:1）。
无水乙醇、75%乙醇。
3M 醋酸钠（pH 52）。
Trizol 试剂。
异丙醇。
RNA 酶抑制剂。
琼脂糖。
50×TAE 电泳缓冲液。
核酸染料（如 EB 或 GelRed）。
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告核酸的提取与鉴定实验报告引言：核酸是生命的基础，它存在于细胞的核内，承载着遗传信息的传递和表达。
在现代生物学研究中，核酸的提取与鉴定是非常重要的实验步骤。
本实验旨在探究核酸提取的方法以及鉴定核酸的质量和纯度。
一、核酸提取方法核酸的提取方法有多种，本实验采用了常用的酚-氯仿法。
首先，将待提取的细胞或组织样品加入细胞裂解液中，通过离心将细胞碎片沉淀下来。
然后，使用酚和氯仿进行提取，酚层中含有核酸和脂质，氯仿层中含有蛋白质。
通过离心将酚层和氯仿层分离，进一步提取纯净的核酸。
二、核酸的鉴定1. 纯度检测核酸的纯度是指核酸溶液中核酸与其他杂质的比例。
常用的纯度检测方法有比色法和光谱法。
本实验中使用了光谱法，即通过测量核酸溶液的吸光度来评估其纯度。
纯度越高，吸光度比值（A260/A280）越接近1.8。
实验结果显示，所提取的核酸样品的纯度在可接受范围内。
2. 浓度测定核酸的浓度是指单位体积核酸溶液中核酸的含量。
浓度测定常用的方法有比色法和荧光法。
本实验中采用了比色法，即通过比较核酸溶液的吸光度与标准曲线的关系来确定核酸的浓度。
实验结果显示，所提取的核酸样品的浓度为Xμg/μl。
3. 碱基组成分析核酸的碱基组成是指核酸中腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）的相对含量。
碱基组成分析可以通过核酸测序技术来完成。
本实验中使用了Sanger测序技术，通过测序结果可以确定所提取核酸的碱基组成。
4. 凝胶电泳分析凝胶电泳是一种常用的核酸分析方法，可以根据核酸的大小和电荷来分离核酸。
本实验中使用琼脂糖凝胶电泳，将提取的核酸样品与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶槽中，通电分离。
通过观察凝胶上的DNA条带，可以初步判断核酸的大小和纯度。
结论：通过本实验，我们成功提取了核酸样品，并进行了一系列的鉴定实验。
通过纯度检测、浓度测定、碱基组成分析和凝胶电泳分析，我们确定了所提取核酸的质量和纯度。
四、核酸提取及鉴定
倾去上清液，即得到核酸钠的白色沉淀
3.核酸水解
含有核酸离心管
加入5%H2SO4溶液3ml
用玻棒搅匀，在沸水中加热8-10分钟
核酸水解液
4.RNA和DNA成分鉴定
1）磷酸的鉴定：
水解 液 5％硫 钼酸铵试 氨基萘酚 酸 剂 磺酸
试剂（滴）
观察变化
测定管 对照管
10 —
在沸水浴中加热至沸2分钟
取出流水冷却后离心（3000转/分，3分钟）
倾去上层酒精液，离心管倒置于滤纸上，倒干乙醇
沉淀物中再加入 10%NaCl溶液4ml搅匀
再置于沸水浴中加热5分钟，用玻棒不断搅拌
取出流水冷却后再离心（3000转 /分，3分钟）
将上清液倒入小烧杯内
取等量95%乙醇，逐滴加入小烧杯
白色沉淀物，静置2分钟，转入离心管
【实验原理】
一、动物细胞中核酸的存在形式 二、核酸分离 肝匀浆
三氯醋酸沉淀出核蛋白 95%乙醇加核蛋白中分离出核酸(钠盐形式)
乙醇沉淀核酸钠
三、核酸水解
核酸（DNA+RNA）
硫酸
碱基（嘌呤、嘧啶）+戊糖（核糖、脱氧核糖） +磷酸
【实验原理】
— 10
10 10
20 20
沸水浴加 热至变色
2.核糖的鉴定
试剂（滴） 水解液 5％硫酸 3、5— 观察变化 二羟甲苯
6
测定管
10
—
对照管
—
10
6
沸水浴加 热至变色
离心机使用注意事项：
1.记住离心管编号；
2.离心管必须先平衡后才对称放入离心
机； 3.避免液体洒在离心机上面或钻头中；
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告
实验报告：核酸的提取与鉴定
I. 实验目的：
通过实验学习核酸提取和鉴定的步骤，掌握核酸提取实验技能，初步了解PCR技术及其在分子生物学中的应用。
II. 实验原理：
DNA分子在水性条件下具有极强的极性，由此，在化学性质上只要是极性且亲水性的溶剂都能迅速膨胀和破裂DNA分子的双链
结构，并溶解其中的碱基、核苷酸、脱氧糖等。
利用这一原理，
我们可以用溶液来提取含有核酸的样品，然后通过紫外吸光度计
检测该提取物中核酸的含量。
此外，PCR技术是一种被广泛运用
于DNA扩增的技术，其主要原理是通过DNA聚合酶扩增DNA
的特定片段。
III. 实验步骤及结果：
1. 核酸提取：将实验样品加入细胞破解液并混匀，离心后取上
清液，加入等体积的异丙醇，轻轻振荡混合并离心15分钟，然后
弃上清液，加入70%无水乙醇并离心，倒掉液体后用氧气吹干。
最终的核酸提取物的溶解液浑浊且无法肉眼辨认样品。
2. 核酸鉴定：将已经提取的样品分别用紫外吸光度计测量其光密度，结果表明与对照的D.W相比，样品中的核酸具有极高的光密度值，证明核酸提取步骤成功，核酸鉴定实验成功。
IV. 结论：
通过本次实验，我们成功地提取了样品中的核酸，并对提取后的核酸进行了鉴定，证明提取物中含有大量的核酸，表明核酸提取和鉴定实验成功，也为分子生物学的研究提供了基础。
动物组织核酸的提取与鉴定
动物组织核酸的提取与鉴定一.目的要求（1）了解生物大分子制备的基本技术。
（2）学习和掌握用盐溶法从动物组织提取分离DNA的原理和操作技术。
（3）学习和掌握鉴定核酸的方法。
二. 材料与用品材料与试剂实验对象动物肝脏仪器：匀浆器（研钵）、冰盒、离心机、电磁炉、玻棒、冰箱。
试剂：0.9%生理盐水、20%三氯醋酸、95%乙醇、10%NaCL溶液。
三. 原理动物含有丰富的DNA，可作为提取DNA的良好材料，在细胞核内，核酸通常与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白的形式存在。
在不同浓度的盐溶液中，脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白的溶解度有很大差别。
当NaCl浓度为0.14mol/L时，脱氧核糖核蛋白的溶解度极低，仅为其在纯水中溶解度的1%，而核糖核蛋白的溶解度相当大，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白以及其他杂质分开。
提取出来的脱氧核糖核蛋白须除去蛋白质。
当脱氧核糖核蛋白与氯仿-异戊醇混合液一起振荡时，蛋白质变性而与核酸分开，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间，DNA溶于在水相中。
经过分离后，再用乙醇将水相中的DNA沉淀出来。
为了防止脱氧核糖核酸酶（DNase）的作用而引起DNA降解损失，在用于提取的缓冲液中均含有0.001mol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）螯合剂，以除去保持DNase活性所必须的Mg2+。
为了防止DNA的变性，操作尽可能在低温下进行。
四. 内容与方法1. 提取DNA（1）取动物肝脏在冰浴上去除脂肪和结缔组织，切成小块，称取20g，加入60mL预冷的0.14mol/L NaCl – 0.01 mol/L EDTA溶液，在组织捣碎机中高速匀浆5~10min。
（2）匀浆后的组织糜于4℃、10000r/min离心10min，弃去上清液。
在玻璃匀浆器中，用4倍体积的低温0.14mol/L NaCl – 0.01 mol/L EDTA溶液洗涤沉淀，然后按上述操作进行离心，弃去上清液。
核酸的提取与鉴定
3．核糖的鉴定 取试管2支，按表操作 将2支试管放入沸水浴内加热10min
管号
测定 对照
水解液
4滴 —
5%硫酸
— 4滴
3，5二羟甲苯试剂
6滴 6滴
4．脱氧核糖的测定 取试管2支，按表操作 将两管同时放人沸水浴l0min
管号
测定 对照
水解液
20滴 —
5%硫酸
— 20滴
二苯胺试剂
40滴 40滴
析出的核酸(DNA与RNA)均由单核苷酸组成，在单 核苷酸中含有磷酸、有机碱(嘌呤与嘧啶)或戊糖(核糖、脱 氧核糖)。核酸用硫酸水解后，即可游离出这三类物质。 用下述方法可分别鉴定出这三类物质：
1．磷酸：用钼酸铵与之作用可生成磷钼酸，磷钼酸可被氨 基奈酚磺酸还原形成蓝色钼蓝。
2．嘌呤碱：用硝酸银与之反应生成灰褐色的絮状嘌呤银化 合物。
纯冰乙酸)，加入2.75ml浓硫酸，摇匀。放在棕色瓶中保 存。此试剂需临用时配制。 5． 0.9%Nacl。 6． 20%三氯醋酸。 7． 95%乙醇。
实验步骤
(一)匀浆制备
称取新鲜猪肝(或大白鼠肝脏)5克，加入等量冰冷的 0.9%NaCl溶液（可先放少量，待研磨成匀浆后加入剩余 部分），及时剪碎。放人研钵中加入少量石英砂，研磨成 匀浆。研磨过程中，要随时将研钵置于冰中冷却。（匀浆 制备一定要在低温条件下制作，操作要迅速，以避免核酸 分解。）
（四）DNA与RNA成分的鉴定
1．磷酸的鉴定 取试管2支，按表操作
管号
测定 对照
水解液
5%硫酸
钼酸铵试剂
氨基奈酚磺 酸
10滴
—
5滴
20滴
—
10滴
5滴
20滴
2．嘌呤碱的鉴定:取试管2艾，按表操作
核酸化学—核酸的提取、分离和含量测定
5’
4’
1’
3’ 2’
(OH)
5’
4’
1’
3’ 2’
(OH)
核苷
H N
N
H
H N
9
N
H
腺嘌呤
HOH2C5′ O OH
4′
1′
3′ 2′
OH OH 核腺糖苷
A
G
C
U
dA
dG
dCLeabharlann dT核酸长链记录方式之演进
A T CGA TCG
5’
3’
P
OH
B 1’ R 2’ 3’
N
N H
N
A
7
6
5
1
8
9
4
2
3
鸟嘌呤guanine
O
N NH
N H
N
NH 2
G
嘧啶（Pyrimidine）
尿嘧啶 uracil
O
NH
胞嘧啶 cytosine
NH 2
N
4
5
3
6
2
1
胸腺嘧啶 thymine
O
NH
N
O
H
U
N
O
H
C
N
O
H
T
DNA中的四种碱基及它们间的氢键
胸腺嘧啶 T
胞嘧啶 C
腺嘌呤 A
DNA的粗提取与鉴定
1. NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L 时,DNA的溶解度最低。
2.DNA不溶于酒精溶液。 3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色。
实验步骤 1、胀破细胞，得DNA溶液
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告1. 引言核酸（DNA和RNA）是生物体内存储遗传信息和调控基因表达的重要分子。
对于研究生物的遗传特征和进化过程，核酸的提取与鉴定是必不可少的实验步骤。
本实验旨在通过提取动物组织中的核酸，使用常用的鉴定方法分析核酸的质量和纯度。
2. 实验原理核酸提取与鉴定的基本原理是将动物组织中的核酸从其他的细胞组分（如蛋白质、唾液等）中分离出来，并通过吸光度测定和凝胶电泳等方法进行核酸的定性和定量。
2.1 核酸提取核酸提取的步骤包括细胞破碎、蛋白质的去除和核酸的沉淀。
常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、柱式提取法和商业试剂盒法等。
2.2 核酸定性和定量核酸的定性主要通过凝胶电泳进行，通过核酸带的迁移速度和分子量，可以初步判断核酸的纯度和是否受到降解。
核酸的定量则是通过吸光度测定，利用核酸特征的吸收峰波长（260 nm）测定核酸的浓度。
3. 实验材料与方法3.1 实验材料•动物组织样品•细胞破碎缓冲液•蛋白酶•酚-氯仿提取液•乙醇•TE缓冲液•焦亚硫酸铵•乙酸•0.8%琼脂糖凝胶3.2 实验步骤1.将动物组织样品切碎并加入细胞破碎缓冲液，用超声波破碎细胞壁。
2.加入蛋白酶进行蛋白质的消化。
3.加入酚-氯仿提取液，离心分离上层的核酸。
4.将上层的核酸转移到新离心管中，加入等体积的冷乙醇沉淀核酸。
5.离心沉淀的核酸，去除上层的乙醇并用TE缓冲液重悬核酸。
6.使用吸光度计测定核酸的纯度和浓度。
7.进行凝胶电泳，观察核酸的迁移带和分子量。
4. 结果与分析4.1 核酸提取结果通过核酸提取实验，成功从动物组织中提取到了核酸。
提取的核酸样品呈现无色透明的状态，说明核酸净化得较好。
4.2 核酸定性和定量结果将提取得到的核酸样品进行凝胶电泳，观察到了明显的核酸带。
通过与分子量标准品的比较，可以初步判断核酸的分子量范围是否正常。
通过吸光度测定，确定了核酸的浓度。
5. 结论通过本实验，成功提取到了动物组织中的核酸，并通过凝胶电泳和吸光度测定等方法对核酸进行了定性和定量分析。
06核酸的提取及其组分的鉴定
测定管
20
对照管
-
核酸水解液
5%硫酸 5％AgNO3 浓氨水
20 10 10 5 5 不可震摇！静置数分钟，观察结果。
测定管 对照管
③核糖的鉴定：
试剂（滴）
管别
核酸水解液 5%硫酸 3，5-二羟甲苯
5 5 5 5 摇匀，沸水浴10min
[注意]
苯酚、钼酸试剂及3，5-二羟甲苯等均有强烈的腐蚀 性，操作时务必小心！若接触到苯酚，立即用95％ 酒精清洗。 实验中用到的第一支试管（含苯酚），不要清洗， 请直接放在走廊的红色小桶内。 提取核酸时，应选用短粗试管（15×100mm）；鉴 定时则可以选用长试管（15×150mm）。
PO43-+12MoO32-+3NH4+ +24H+=（NH4）3 PO4•12MoO3•6H2O↓+6H2O
2．嘌呤：嘌呤碱可与硝酸银作用生成白色的絮状嘌呤 银沉淀。 3．核糖：与浓硫酸共热得到糠醛，后者与3，5-二羟 甲苯缩合而成绿色化合物。
[步骤] 1．核酸的提取：
①取兔肝1克，剪碎置于研钵中，加2ml蒸馏水研匀，再 加2ml蒸馏水混匀。 ②取15×100mm短试管1支，滴加匀浆液40滴（约2ml）。 ③向试管中加入90％苯酚溶液2ml，充分振摇5min（注意 手法，防止溶液溅出），3000rpm离心5min。 ④用滴管小心吸取上层水相至另一试管中（贴壁吸取， 为避免吸到下层液，可留一些上层液在原试管内）。 ⑤加入3 ml 95%乙醇，充分摇匀，直至絮状沉淀析出。 ⑥ 3000rpm离心5min，弃去液体，沉淀部分即为核酸。
2．核酸的水解： 向核酸沉淀中加2ml蒸馏水，震荡摇匀使沉淀溶 解。加入10％硫酸2ml，摇匀，于沸水浴中加热7分钟， 冷却后备用。 3．核酸的鉴定：
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定【目的】验证核酸的三大组成成分。
熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。
【原理】动物组织细胞中的核糖核酸（RNA ）与脱氧核糖核酸（DNA ）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。
被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl 溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。
RNA 与DNA 均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖（RNA 为核糖，DNA 为脱氧核糖）。
此三类物质分别可按照下述原理鉴定。
1.磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（硫酸亚铁）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。
根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。
2.嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。
3.戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。
CHOC H C H C H CH 2OHOH OH OH OCHOOH CH 3COCH 3OCH 3OH-H 2O核糖3，5-二羟甲苯糠醛绿色化合物脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。
CHO C H C H C CH 2OHH H O -H 2O脱氧核糖蓝色化合物CHO C H C H C H CH 2OHH OH OH ω-羟基-γ-酮基戊醛【器材】剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。
【试剂 1.生理盐水。
2. 0.12 mol/L三氯醋酸溶液。
3. 95% 乙醇。
4. 10% NaCl溶液NaCl 10g溶于蒸馏水中，加至100ml。
5. 0.92 mol/L H2SO4取浓H2SO4（比重1.84，含量98%）5ml加入蒸馏水中，加水至100ml 。
6. 钼酸铵试剂钼酸铵3g，溶于70ml蒸馏水中，逐渐加入浓 H2SO4 14ml ，冷却后再加至100ml，混匀备用。
实验九 动物组织中核酸的提取和鉴定
实验七动物组织中核酸的提取和鉴定【原理】动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。
核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。
先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。
核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。
有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。
此三类化合物可用下列方法鉴定之。
1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。
还原成兰色的钼兰。
常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。
H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2OH3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O52、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针状结晶3、戊糖：(1)核糖：经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛，后者可与3;5二羟甲基苯缩合成绿色化合物。
(2)脱氧核糖：在强酸中加热，可生成ω—羟基γ—酮基戊醛，后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。
上述二反应如下【操作】(一)核酸提取l、用酚提取法：（1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。
（2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。
（3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。
（4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。
2、用三氯醋酸提取法（1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。
核酸提取原理及方法
核酸提取原理及方法
“哎呀，这核酸检测到底是咋回事呢？”我和小伙伴们在课间的时候讨论起来。
你知道吗？核酸提取可神奇啦！就好像在大海里捞宝贝一样。
先来说说核酸提取的步骤吧。
第一步呢，就像是准备好工具去探险，要把需要检测的样本准备好。
比如说从我们的喉咙里或者鼻子里取出来的那些东西。
第二步，就像魔法师施展魔法，要把样本里的其他杂质去掉，只留下核酸这个“宝贝”。
第三步呀，就像是把找到的宝贝小心地装起来，把核酸保存好。
在做这些的时候，可有好多注意事项呢！要是不小心把样本弄洒了，那可就糟糕啦！就像你好不容易搭好的积木城堡被碰倒了一样。
而且，操作的时候一定要小心，不能马虎，不然就找不到核酸这个“宝贝”啦。
那核酸提取有啥用呢？它的应用场景可多啦！比如说在医院里，可以用来检测我们有没有生病。
这就像一个超级侦探，能找出我们身体里的小坏蛋。
它的优势也很明显呀！可以快速地知道我们的身体情况，让医生能赶紧想办法帮我们治病。
这不是比大海捞针容易多了吗？
我记得有一次，我们学校组织做核酸检测。
大家都排着队，心里有点
紧张又有点好奇。
医生们穿着白色的衣服，就像天使一样。
他们熟练地进行着核酸提取的操作。
不一会儿，就检测完了。
后来，我们知道了大家都很健康，心里别提多高兴啦！这就是核酸提取的实际应用效果呀，能让我们安心。
所以说呀，核酸提取真的很重要呢！它能帮我们守护健康，就像一个勇敢的卫士。
我们也要好好配合做核酸检测，让这个“卫士”更好地保护我们。
核酸提取与鉴定
• 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，
乙醇干燥，再用3％H2O2室温浸泡10min，然后用0.1％
DEPC水冲洗，晾干。
第24页，共53页。
• 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专
用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把 溶液装入无RNase的玻璃器皿。
（3）培养细胞： 离心，弃细胞培养液；
用缓冲液多次漂洗；
第6页，共53页。
3、微生物培养物样品
离心获取菌体细胞，
加缓冲液洗涤，
加缓冲液悬浮菌体细胞。
4、微生物混合样品
用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。
高速离心获取菌体细胞。
用缓冲液洗涤菌体细胞。 加缓冲液悬浮菌体细胞。
第7页，共53页。
（二）提取用具预处理
品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在于水相 中）
6）取上清0. 5ml（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也不要吸
到中间层的物质）放入另一个1.5ml的EP管中；
7）加入等体积的异丙醇（0.5ml），涡旋混匀；
第33页，共53页。
8）室温，静置10分钟（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的条件用-
DNA提取的一般流程
第15页，共53页。
三、质粒DNA的提取
质粒DNA特点： （1）细菌基因组DNA以外的小型闭合环状双链DNA分子。
（2）大都含有抗生素抗性基因。 （3）可自我复制或表达。（重组DNA技术中构建载体） （4）大小1-300 kb。
第16页，共53页。
1、培养细菌和扩增质粒
大学生物实验——核酸提取与检测
一、实验目的与要求
1、学习并掌握细菌基因组DNA的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析。
二、实验原理
细菌（bacteria）为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行 繁殖的原核生物。
根据革兰氏染色法，可将细菌两大类：革兰氏阳性菌和阴性菌。两者主要是细胞壁的结构不 同。
5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去
6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！) 贴容器内壁，将液体匀速打 出，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内.
二、离心机的使用注意事项 1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。 3、样品配平, 对称放入离心机(管的连接处朝外). 4、设定离心时间(如设定2分钟，可定时多点时间， 再用手表记时)。 5、统一离心，逐渐升到要求转速。
6. 如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤9所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤9； 若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
7. 因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱 并于-20℃保存。
1. 仪器及器材 恒温水浴锅、台式离心机、移液器、电泳槽、电泳仪；离心管（灭菌）、吸头（灭菌）
2.试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）、蛋白酶K、无水乙醇、琼脂 糖、核酸电泳缓冲液、DNA分子量标准、核酸凝胶上样缓冲液
四、实验步骤 (一)试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA
有关核酸提取与鉴定的最基本实验
6、 小心弃去上清液，然后室温干燥5-10分钟， 注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；
7、 将RNA溶于Rnase-free water中,紫外定量。
附：磁珠分离mRNA试剂盒
1、1.5mlEP管中加入500µL待提取样品，加入 400µL核酸提取液，震荡10秒；
溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2
（6.895×104Pa） 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于
4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微
量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
2）加200µL新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀
micelle（微囊）结构的相变化所导致。
SDS:结合蛋白质
溶液Ⅲ：沉淀
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸
11.5ml
水
28.5ml
溶液Ⅲ加入后，钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不 溶性的PDS，而SDS由于与蛋白质结合，钾钠离子置换 所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆 菌的基因组DNA因为与蛋白质结合也一起被共沉淀了。
释）、1%SDS
盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应
确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将
离心管放置于冰上。
3）加150µL用冰预冷的溶液Ⅲ
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
盖紧管口，将EP管倒置后振荡10秒钟，溶液Ⅲ在粘稠的细 菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3－5分钟。
5. 弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75%乙醇 进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心 5分钟，弃上清；
核酸提取与鉴定
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2．RNA提取中RNase污染的控制
• 在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。 第10页/共61页
第二节 DNA的提取
• 玻璃用品： 使用前于180℃的高温下干烤6h以上，或在220℃下干烤 3h以上。
• 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再 用3％H2O2室温浸泡10min，然后用0.1％DEPC水冲洗，晾干。
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• 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA 提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
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2、盐酸胍-有机溶剂法
• 盐酸胍变性蛋白质，抑制RNA酶，有机溶剂 抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子 而去除DNA。此法适用于没有超速离心设施 的情况下提取细胞总RNA，提取的RNA质量 较好，但整个操作过程繁杂费时。
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3、氯化锂-尿素法
• 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶， 氯化锂选择性沉淀RNA。
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三、核酸完整性检测
• 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常 采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。
• 凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应 该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带，其中 28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。
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核酸的提纯与质量鉴定1
RNA in H2O: 分装成小份 （75%酒精）
几年
பைடு நூலகம்
Agilent 2100 bioanalyzer 毛细管电泳分析RNA 完整性
1%变性琼脂糖凝胶电泳分析纯化的mRNA
microRNA的提取
1. 成熟miRNA的长度大多为19-24nt 2. 目前在总RNA基础上富集miRNA实际上是分离 <200nt的RNA 3. 目前常用的试剂盒为Qiagen的miRNeasy mini kit 和Ambion的miRNA isolation kit
RNA 完整性分析
DNA 28S 18S
100 50 25 ng Genomic DNA markers
Degraded RNA
5S rRNA, tRNA, and other small RNA molecules
mRNA = background smear high low MW
毛细管电泳法
DNA干燥时要干但不能干过, 火候很重要
RNA的提取
• RNA组成： • rRNA: 80-90% • mRNA: 2.5-5%(including precursors of regulatory RNA) • tRNA: 10-15%
总RNA
提取示例
mRNA microRNA
样品保存
RNase的性质及对策
室温5min使核酸蛋白质 复合物解离 室温静置5min 取上清加入0.5ml异丙醇
200ul氯仿剧烈震荡15s
4℃ ,12,000g离心15min 12,000g离心10min
沉淀中加入1ml 75%的乙醇洗涤 ，7500g离心5min 室温干燥,溶解
亲和柱纯化