产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析

产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和

耐药性分析1

李咏梅，李凡

吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011

E-mail：mayflower380@

摘 要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO 推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13株（56.9%）hlyA基因阳性。全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。非O157型 STEC耐药菌次为122， 而O157 型为63。实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。非O157型STEC对抗生素较易形成耐药性。

关键词：STEC；鉴定; 耐药性

1．引言

STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌[1]。STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome, HUC)。但是，近年来非O157H7 STEC引起的HC、HUC在逐年增加。由于E.coli O157H7不发酵山梨醇而比非O157H7STEC容易鉴定，所以非O157H7STEC 常被人们所忽视。而STEC致病的特征性毒力因子是1型志贺毒素（Shiga toxin type1, stx1）和2型志贺毒素（Shiga toxin type2, stx2）,分别由stx1基因编码和stx2基因编码。然而，其他毒力因子如由eaeA基因编码的紧密素（intimin）也称黏附抹平因子（attachment and effacement factor）；由hlyA基因编码的溶血素（hemolysin）等也是重要的毒力因素[2]。因此，用多重PCR技术对标本进行STEC毒力基因的鉴定，不仅可作特征性鉴定，而且还可对其潜在的致病性能作出前瞻性判定。

1本课题为高等学校博士学科点专项科研基金资助课题，编号为30271251

-1-

尽管STEC所引起的腹泻多数是自限性的，但是早期应用抗生素进行治疗，可以减少发展成HUC的病历。但是不良后果则是EHEC多药耐药菌株的增加[3]。为了了解STEC在各种来源标本中的分布及毒力基因存在情况，及分离株对临床常用抗生素的敏感性，本文作如下报告：

2．材料和方法

1.1材料

1.1.1试验标本取自于长春市、吉林市儿童医院住院腹泻患儿粪便，长春市、吉林市防疫站提供的食品、水源、动物粪便中初分离出的大肠埃希菌。

1.1.2 质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853，吉林大学基础医学院病原生物学教研室提供。

1.1.3试剂 PCR用试剂均购于北京鼎国生物技术发展中心，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司，批号200208。

1.1.4仪器 PCR扩增仪（新加坡）；UV WHITE-2020D凝胶成像系统；DY-WI恒压恒流水平电泳仪（北京）。

1.2方法

1.2.1标本分离和处理 对临床采集的腹泻患者粪便标本，动物粪便标本1g用Cary-Blair 培养基运送，实验室初步分离出可疑为大肠埃希菌；环境和食品标本1g先行肉汤增菌，后接种麦康凯培养基。上述菌株均经37℃培养18h-20h，用接种环取2-3个可疑菌落，置500μl灭菌双蒸水或生理盐水中，混匀，100℃煮沸10-15min，振荡混匀，13 000g离心1min，上清液即可用于PCR模板。

1.2.2 mPCR鉴定 STEC的四种毒力基因的引物序列及扩增片段的大小见表1[1]

mPCR的反应总体积为50ul，在0.5ml反应管中依次加入10×buffer ，0.2mmol/l 的dNTPs，10pmol的引物每条1.5ul,TaqDNA酶1U,模板2ul，双蒸水补至50ul。设阳、阴性对

-2-

照。反应程序为94℃7min变性模板DNA，94℃1min,56℃1min,72℃1min，30个循环，最后

72℃延伸5min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，分子量100-1200bp的Marker作参照，EB

染色后用琼脂糖凝胶成像软件分析系统检测和分析结果。（见图1）

对鉴定为STEC的菌株进行血清型分型，大致分成Ｏ157和非Ｏ157两群。

1.2.3 STEC的耐药性监测 采用WHO推荐的K-B法对分离鉴定的全部STEC菌株，进行18种常

用抗生素的药物敏感试验，结果依照NCCLS判定[3][7]。

3.结果

3.1 STEC的分子生物学鉴定

从各种标本中分离出可疑大肠埃希菌112株，经mPCR鉴定出能产生志贺毒素的菌株46

株，来源遍布人、动物粪便，污水，食品，数量上无显著性差异。其中两种毒素均产生的有

22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因

菌存在的有19株（41.3%）。46株STEC中有23株为O157H7，23株非O157H7 。23株O157型STEC

中，有19株（82.6%）stx1、stx2、eaeA、hlyA基因均阳性；而非O157中仅有3株（6.6%）

stx1、stx2均阳性，eaeA基因阳性1株（2.2%），hlyA基因阳性13株（56.9%）。即非O157菌

株中hlyA基因的携带率要高于eaeA基因。见表2

表2 46株STEC四种毒力基因的分布情况

基因型菌株数(n) 血清型构成比（%）

O157:H7 41.3

stx1＋stx2＋eaeA＋hlyA 19

2.2

non-O157

stx1＋stx2＋hlyA 1

stx1＋stx2 2 non-O157 4.3

stx1 5 non-O157 10.9

stx2 2 non-O157 4.3

23.9 stx1＋hlyA 11

non-O157

8.8

stx2＋eaeA＋hlyA 4

O157:H7

stx2＋hlyA 1

non-O157

2.2

non-O157

2.2 stx2＋eaeA 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

图1 STEC毒力基因的分布1和9为Marker，

2为阳性对照，10为阴性对照，3-8为待测菌株。

-3-