微生物的诱变育种
微生物菌种的选育和保藏--诱变育种
微生物菌种的选育和保藏
项目一 微生物菌种的选育
四、诱变育种
１
诱变育种概述
➢ 诱变育种概念：✔利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率
大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方法，从中
挑选少
数符合目的的突变株，以供生产科研之用；
✔诱变：随机的；筛选：定向的（更重要）；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子或活化的孢子; ✔菌悬液浓度:一般真菌孢子或酵母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢以紫外线诱变处理为例： ✔紫外灯应先预热20~30min； ✔将10ml菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm,启动磁力 搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间几秒至数十分 钟为宜，具芽孢的菌株需处理10min左右； ✔实验中避免光复活现象:处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将 盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选；
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
微生物的遗传育种-诱变育种
b方法
稀释后的菌悬液取0.1m1 加入到基本培养中
2
1
4
3
圆滤纸分别浸湿沾取 以上四类代表物质
缺陷型所需生长因子的测定
以氨基酸缺陷为例进行说 明,将18种氨基酸按右表 分为6组 特点：每2组只有一种共同 物质
1 2 3 4 6
组 别 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 7 8 9 10 11 化合物代号 8 12 12 13 14 15 9 13 16 16 17 18 10 14 17 19 19 20 11 15 18 20 21 21
5
7.缺陷型菌的应用
作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变
育种、
研究代谢过程时用作亲本标记；
作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；
作为aa、维生素、碱基的测定菌株。
氨基酸合成代谢的人工控制
赖氨酸高产菌
天冬氨酸
人工诱变的 菌种不能产生
天冬氨酸激酶
高丝氨酸 脱氢酶
中间产物Ⅰ
高丝氨酸
中间产物Ⅱ
⑵营养缺陷型鉴定步骤
测定缺陷型菌株所需生长因子的类别
具体测定缺陷该类别物质中的哪种生长因子
用单一生长因子进行复证试验
缺陷型类别的测定
a.先选择缺陷型菌株所需用的类别代表物质。
①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白陈，代表 氨基酸类。 ②酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、 嘧啶均具有。
微生物诱变育种的基本过程
微生物诱变育种的基本过程
一、筛选目的菌株
在开始微生物诱变育种之前，首先要确定育种的目标，并从中筛选出具有潜在优良性状的目的菌株。这一步通常需要利用各种生理生化实验和分子生物学技术，对大量菌株进行初步的筛选和鉴定。
二、诱变处理
在确定了目的菌株之后，接下来需要进行诱变处理。诱变处理通常包括化学诱变和物理诱变两种方式。化学诱变使用化学诱变剂处理菌株，而物理诱变则利用物理因素（如紫外线、X射线、中子等）处理菌株。这些诱变因素可以引起菌株基因的突变，进而产生新的性状。
三、突变体的筛选
经过诱变处理后，大量菌株中会存在各种突变体。为了获得具有优良性状的目标突变体，需要进行筛选。这一步通常采用各种筛选方法，如单菌落挑取法、稀释涂布平板法等，将突变体从大量菌株中分离出来。同时，需要通过各种生理生化实验和分子生物学技术，对突变体的性状进行鉴定和筛选。
四、遗传稳定性检测
在筛选出目标突变体后，需要对其遗传稳定性进行检测。遗传稳定性是指突变体在繁殖过程中，是否能够保持其优良性状的稳定性。这一步通常采用连续繁殖法和稳定性测定法等方法进行检测，以保证突变体的优良性状能够在后代中得到保留。
五、生产能力测定
最后一步是测定突变体的生产能力。生产能力是指突变体在实际生产过程中，能否产生足够的产物并保持稳定的产量。这一步通常采用发酵实验和产物分离纯化等方法进行测定，以保证突变体在实际生产中具有实用价值。
诱变育种——精选推荐
诱变育种
菌种选育(selection strain)的目的是改良或改变菌种的特性，使其符合工业生产或科研的要求。菌种选育过程由三个环节组成：一是使菌种产生变异；二是筛选出变异的菌株；三是使变异菌株的特性得到表达。根据使菌种产生变异的方式的不同，菌种选育可分为自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程这四种方法。自然选育、诱变育种是利用基因突变来获得优良菌种，具有改良菌种特性的性质。杂交育种、基因工程是通过DNA重组来获得优良菌种，具有改变菌种特性的性质。
菌种选育是一门应用科学技术。是以微生物学、微生物遗传学、生物化学、分子生物学、基因工程等学科为理论基础。菌种选育目的，从生产方面来说，为了提高产量，产生新的生物活性物质，改变产品质量和组分，简化工艺，缩短周期，抵抗不良环境，适应新的原材料。从科研方面来说，是为了提供分子遗传研究材料，研究生物合成调控机理，分析生物合成途径，获得带遗传标记的菌株，了解菌种遗传背景。
诱变育种
诱变育种是通过诱变剂处理提高菌种的突变几率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株。诱变育种和其他育种方法比较，具有速度快、收效大、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种重要方法。在生产中应用得十分普遍。但是诱发突变缺乏定向性，因此诱发突变必须与大规模的筛选工作相配后才能收到良好的效果。
以下分别叙述诱变育种工作流程和诱变育种工作中的三个重要环节：突变的诱发、突变株的筛选突变基因的表达。
1、诱变育种的工作流程
诱变育种的工作流程：①出发菌种（沙土管或冷冻管），②斜面（或肉汤培养24小时），③单孢子悬液（或细菌悬液），④诱变处理（处理前后的孢子液或细菌悬液活菌计数），⑤涂布平板，⑥挑取单菌落传种斜面，⑦摇瓶初筛®挑出高产斜面，⑧留种保藏菌种®传种斜面，⑨摇瓶复筛®挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察，⑩放大试验罐中试考察大型投产实验。整个流程按诱变过程和筛选过程两部分说明如下：
微生物的诱变育种
二、几种重要突变株的筛选方法
1. 抗性突变株的筛选
– (1) 抗终代谢物结构类似物突变株的筛选 – (2) 抗药性突变株筛选
2. 营养缺陷型的筛选
1. 抗性突变株的筛选
（1）抗终代谢物结构类似物的突变株 ） 用途： 用途：筛选相应代谢物的高产菌株 （2）抗药性突变株 ） 所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结 用途：筛选相应药物(抗生素 抗生素) 用途：筛选相应药物 抗生素 的高产菌株或遗传标记制作 构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相 筛选的方法: 筛选的方法 似的物质。 a. 高于临界浓度的平板进行分离； b. 梯度平板法
③ 营养缺陷型的检出
逐个检出法 夹层培养法 限量补充培养法 影印平板法
方法
④ 营养缺陷型的鉴定
生长谱法： 生长谱法： 分两步： 分两步：
快速， 快速，直观
a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸） a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定 三大类营养要求 b.具体到某一种营养要求的鉴定 哪一种氨基酸, 具体到某一种营养要求的鉴定( b.具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸,哪一种 维生素,或哪一种碱基) 维生素,或哪一种碱基)
诱变育种的基本原则： 诱变育种的基本原则：
选择简便有效的诱变剂； 选择简便有效的诱变剂； 挑选优良的出发菌株； 挑选优良的出发菌株； 处理单细胞或单孢子悬液； 处理单细胞或单孢子悬液； 选用最适的诱变剂量； 选用最适的诱变剂量； 充分利用复合处理的协同效应； 充分利用复合处理的协同效应； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 设计高效筛选方案； 设计高效筛选方案； 创造新型筛选方法。 创造新型筛选方法。
2.3 诱变育种
诱变育种
l按照生产的要求，根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、而达到菌种诱变选育的目的。
诱变育种
一般采用物理、化学诱变剂使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误的DNA模板形成异常的遗传信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。
l诱变育种包括：
出发菌种选择诱变处理筛选突变株
原种（出发菌株）→ 纯化 → 斜面培养 → 完
全培养基同步培养 → 离心洗涤 → 玻璃珠震
荡分散 → 过滤 → 单细胞或孢子悬浮液
诱
变育种诱变处理 ← 诱变处理预备实验
平板分离
斜面培养
保藏及扩大试验
← 活菌计数
← 处理液活菌计数
← 形态变异并计算其变异率
← 初筛、复筛
← 自然分离和再复筛
出发菌株来源
野生菌株
金融保险
l特点：
酶系完整、DNA未损伤、生产能力差、正突变可能性大生产中正在使用的菌株
金融保险
l特点：
对生产环境适应，正突变可能性较大
菌种保藏机构购买
金融保险
l或未诱变、或经诱变
出发菌株选择应考虑的问题
•出发菌株的稳定性；
•选用具备优良特性的菌株；
•挑选对诱变剂敏感的菌株；
•注意菌株的生理状态及生长发育时间。
菌悬液的制备
待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件；菌体对数生长期，尽可能选择孢子或单倍体细胞作为诱变对象，避免表型延迟，造成不纯的菌落。
菌悬液的浓度一般为
•真菌孢子或酵母菌为106~107个/mL；
•放线菌或细菌为：108个/mL
诱变剂
l物理诱变剂
（如紫外线、X射线、γ射线、快中子）l化学诱变剂
（如亚硝酸、硫酸二乙酯、氮芥）
在选用哪种诱变剂、剂量大小、处理时间时，考虑试验菌株的遗传背景：各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在DNA的某些特异部位上，多次反复用一种诱变因子易出现 “饱和”或恢复突变现象，因此诱变时常采用多种不同的诱变因子或复合诱变因子。
实验九 微生物的诱变
3.2.2 倒平板。制作淀粉培养基平板9套/组。
3.2.3 标记。将平板按稀释度和处理时间作好标记。
紫外线诱变的操作步骤
3.2.4 紫外线处理。在黑暗下，开启紫外灯预热20 min,取无菌 平皿2套,各放入大头针一枚,置磁力搅拌器上找开皿盖,在距离 30cm下分别照射1 min和3 min 。
实验九 微生物的诱变育种
1 实验目的
1.1 掌握紫外线诱变育种的原理和方法。 1.2 掌握用平皿法测定淀粉酶活力方法 。
2 实验原理(通过了解下列问题来掌握 98实验原理)
2.1 紫外线是一种常用的物理诱变剂，其作用机理是什么? 2.2 平皿法为什么能测定淀粉酶活力?
紫外线诱变的分子基础
UVL
VL
Photolyase
3
材料与方法 实验器材
3.1
3.1.1 培养基：淀粉培养基（固体）、LB液体培养基。
3.1.2 仪器：恒温培养箱、超净工作台、紫外灯（15W）。 3.1.3 菌种： Bacillus subtilis 3.1.4 其它物品：碘液、无菌生理盐水，盛4.5mL 无菌水试管。
3.2 方法
(2) 分析实验操作中存在什么问题，应如何改进？
第二章微生物育种的原理和方法
第二章 微生物育种的原理和方法
微生物育种原理和方法
微生物育种筛选方法
微生物育种原理和方法
一、微生物育种原理
方法：突变、体内重组
体外重组（基因工程）
1、从自然界中获得新菌种
微生物资源分布：土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所
2、分离微生物新种的步骤 采样、增殖、纯化和性能测定等步骤
3、典型的微生物采样和筛选方法
生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制
不会有代谢产物的积累
解除或突破微生物的代谢调节控制
目的产物积累
微生物育种的目的
直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产
二、诱变育种方法
1、物理诱变：紫外线
2、化学诱变：5-溴尿密啶
1）紫外线诱变机理：造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应
2）诱变过程中需要注意
光复活作用：
微生物等生物的细胞内存在光复活酶，光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物（此时的光复活酶没有活性），可见光光能（300-500nm）激活光复活打开二聚体，将DNA复原。
暗修复：
细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，可修复由紫外线、γ射
线和烷化剂等对DNA造成的损伤。暗修复体系有四种酶参与反应。
紫外诱变的特点：方便、诱变效果很好的常用诱变剂
由此说明紫外线照射引起微生物突体形成是一个复杂的生物学过程。紫外线引起DNA结构的改变仅仅使微生物，于亚稳定状态，点亚稳定到稳定的突变体的形成需要“定时间和过程，所以在实际诱变工作中要采取某些措施避免以上的修复作用，要注意避光或加入某些物质，提高突变的频率。因此，用紫外线进行诱变时，照射或分离均应在红光下进行。
现代工业微生物育种
现代工业微生物育种
一、诱变育种
诱变育种是通过使用物理或化学方法，如紫外线、X射线、化学诱变剂等，诱导微生物发生基因突变，从而产生具有新性状的菌株。这种方法可以大幅度提高微生物的变异频率，为育种工作提供了丰富的材料。
二、基因工程育种
基因工程育种是通过人工构建基因表达载体，将其导入到微生物中，从而实现基因的转移和表达。这种方法可以定向地改造微生物的遗传物质，使其表达出所需的性状。基因工程育种具有高度定向性和可预测性，是现代工业微生物育种的重要手段之一。
三、代谢工程育种
代谢工程育种是通过改变微生物的代谢途径，提高其代谢产物的产量或改变代谢产物的性质，从而获得所需的菌株。这种方法需要对微生物的代谢过程有深入的了解，并能够精确地调控其代谢网络。代谢工程育种在现代工业微生物育种中具有重要的应用价值。
四、组合生物合成育种
组合生物合成育种是通过构建多个基因的组合文库，并筛选出具有所需性状的菌株。这种方法类似于基因工程育种，但具有更高的遗传复杂性，可以创造出更丰富的变异类型。组合生物合成育种在现代工业微生物育种中已经成为一种重要的策略。
五、定向进化育种
定向进化育种是一种模拟自然进化过程的育种方法。它通过对大量随机突变体进行筛选和选择，以实现所需性状的定向进化和优化。定向进化育种可以在短时间内获得高度适应特定条件的优良菌株，具有很高的应用价值。
六、菌种保藏与复壮
菌种保藏与复壮是工业微生物育种的重要环节。通过科学的保藏方法，可以保持菌种的活力和遗传稳定性；而复壮则是通过一定的手段使保藏的菌种恢复活力，以保证其用于生产的性能。
请说明微生物诱变育种的一般流程
请说明微生物诱变育种的一般流程
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诱变育种
三、浓度梯度法筛选法
加入抗生素
不加抗生素
四、复印技术快速筛选变株
苏丹黑染色
测定不同酵母菌胞内脂肪含量的简单定量法
五、琼脂大通量筛选变株
1
摇瓶液体培养
200
正交实验设计
产物活性鉴定
寥寥无几
琼脂平板活性圈法 往孔中加发酵液
产物活性鉴定还有
纸片法
琼脂薄层纸片法
培养基
一:培养基是加有油脂乳化液的培养基 二:菌是脂肪酶产生菌
二、诱变育种的概念
微生物的诱变育种是以人工诱变手段诱发微生 物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选， 从多种多样的变异体中筛选出产量高和性状优良 的突变株，并且找出这个突变株的最佳培养基和 培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产 物。
基本环节有菌种基因型改变，筛选菌种和产量 评估等。
三、诱变育种的主要目的
2.单孢子(或单细胞)悬液的制备
作诱变的菌株必须以均匀而分散的单细胞悬液存在。 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长。
菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制，如果是 用化学诱变剂处理，因处理时pH值会变化，必须要用 缓冲溶液。除此之外，还应先用玻璃珠振荡分散，再用 脱脂棉或滤纸过滤，这样，可以保证菌悬液均匀地接触 诱变剂 ，获得较好诱变效果。
是采用一定方式使菌种生理状态进入休眠。
第二节 诱变育种的步骤与方法
第六章微生物诱变育种
微生物菌种选育： 应用微生物遗传和变异理论，用 人工方法(或自然)造成变异，再经过 筛选以得到人们所需菌种的过程 。
诱变育种：
是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分 散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅 度提高，然后设法采用简便、快速和高效 的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的 的突变株，以供生产实践或科学实验之用。
优点：在此条件下，各琼脂块所 含养料和接触空气面积基本相同， 且产生的抗生素等代谢产物不致 扩散到琼脂块外，因此测得的结 果与摇瓶实验结果十分相似，而 工作效率却大为提高。
·
含供试菌种 （拮抗对象） 的琼脂平板 红点为抑菌圈
（2）抗药性突变株的筛选方法——梯度培养皿法
是定向筛选抗药 含异烟肼 性突变株的一种有 效方法。（用此法 筛选抗异烟肼的吡 接敏感菌 哆醇高产菌株）
含突变株
强抗性 弱抗性 中抗性 利用梯度平板法筛选抗代谢类似物突变株，可达到定向培育的目的
（3）营养缺陷型突变株的筛选
筛选方法: 诱变→淘汰野生型→检出→鉴定营养缺陷型 • ①诱变 • ②淘汰野生型: 抗生素法、菌丝过滤法 • ③检出缺陷型： 同一平板——夹层培养、限量补充 不同平板——逐个检出、影印接种 • ④鉴定营养缺陷型：生长谱法
• 在选用理化因素作诱变剂时 ，在同样效果 下，应选用最简便的因素；而在同样简便
的条件下，应选用最高效的因素。
初中生物诱变育种实验教案
初中生物诱变育种实验教案
实验目的：通过使用诱变剂引起植物基因变异，从而产生新的基因型和表型，探讨基因变
异对植物遗传性状的影响。
实验材料：
1. 快生长小麦种子
2. 乙烯基脲（诱变剂）
3. 培养皿和培养土
4. 水壶和喷壶
5. 光照灯
6. 实验记录表格
实验步骤：
1. 将快生长小麦种子分成两组，每组数量相等。
2. 将其中一组小麦种子浸泡在0.1%浓度的乙烯基脲溶液中，静置12小时，然后取出晾干。
3. 将两组小麦种子分别播种在培养土里，保持湿润。
4. 每天给小麦种子喷水，确保土壤保持湿润。
5. 将小麦种子放置在光照灯下，保持适宜的光照条件。
6. 每周记录小麦种子的生长情况，包括生长高度、叶片颜色等，并填写实验记录表格。
7. 持续观察小麦种子的表型变化，并比较实验组和对照组的差异。
实验注意事项：
1. 实验中使用的乙烯基脲为有害物质，操作时需戴好手套，并避免接触皮肤和口鼻。
2. 实验过程中保持实验环境的干净整洁，避免杂物干扰实验结果。
3. 实验结束后，将实验材料和废弃物妥善处理，不得随意丢弃。
4. 实验过程中如有不适或意外发生，应立即向老师或实验室管理员求助。
实验预期结果：
经过一段时间的观察和比较，预计诱变组的小麦种子将出现一些表型变异，如植株高度、叶片颜色等方面与对照组有所差异。通过比较实验组和对照组的结果，学生将能够了解基因突变对植物遗传性状的影响。
实验总结：
通过这个实验，学生们将学会如何使用诱变剂引起基因变异，了解基因突变对植物遗传性状的影响。同时，实验也将培养学生的观察力和实验操作能力，提高他们的科学素养。
实验二 微生物的诱变育种
四、实验内容
紫外线对枯草芽孢杆菌存活率的影响
照射时 间 15s 稀释 度 ① ② ③ ① ② ③ 平板菌落(个/ml) 平板1 平板2 平板3 细胞浓度平均 存活率(%) 值N1 (个/ml) (N1/N0)
30s
45s / 90s
0s(对照) ① ② ③ 100
五、结果与讨论
• 实验选择诱变时间时，全班共同绘制一条致死 曲线，每个组或几个组选择一个诱变处理时间， 最后统一进行绘制。
对组
不加硫酸铵的基本培养基340mL（液体,用烧杯） （2） 无N 20mL/△100 加0.4% 硫酸铵,0.08g 2N 10mL/△100, 2个 标记，包扎灭菌 （3）
（1） 无N 10mL/△100, 2个 标记，包扎灭菌
剩余无N 300mL 加0.2% 硫酸铵,0.6g
基本 3wk.baidu.com0mL 剩余200mL 加0.3%完全
四、实验内容
• 3. 活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度 取1ml细胞悬浮 液，逐步稀释为10-1、10-2、10-3……。取最后3个稀释 度的菌液各1ml，置于无菌空平皿中，然后倾注15ml融 化并冷却至45~50℃的肉汤固体培养基，轻轻充分混匀， 凝固后于37℃倒置培养1~2天，计数每皿的菌落数（每 个稀释度作三个平行）。按下式计算每毫升细胞悬浮 液菌体的浓度（N0）。 • 菌体浓度(个/ml) = 菌落数(按杂菌总数计数原则)×稀 释倍数
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微生物的诱变育种
作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18
实验仪器大全实验试剂大全
一、实验目的和内容
目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。
内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。
2．用紫外线进行诱变处理。
3．用平板透明圈法进行两次初筛。
4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。
二、实验材料和用具
米曲霉斜面菌种；
豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白；
三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。
三、操作步骤
(一)出发菌株的选择及菌悬液制备
1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。
(二)诱变处理
用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。
1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。
2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。
(三)优良菌株的筛选
1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。
2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，
豆饼粉(或面粉)15g，加水95～110mL(称为润水)，水含量以手捏后指缝有水而不
下滴为宜，于500mL 三角瓶中装入15～20g(料厚为1～1.5cm)，121℃湿热灭菌30min，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h 后摇瓶一次并均匀铺开，再培养24～48h，共培养3～5d 后检测蛋白酶活性。
4．蛋白酶的测定方法
(1)取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加蒸馏水100mL，(或200mL),40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液测定酶活性。另取lg 培养物于105℃烘干测定含水量。
(2)酶活性测定：30℃pH7.5 条件下水解酪蛋白(底物为0.5%酪蛋白)，每分钟产酪氨酸1μg 为一个酶活力单位。计算公式为：
(A样品OD680nm 值-A对照OD680nm 值)×K×V/t×N
K：标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数；
V：酶促反应的总体积；
t：酶促反应时间(min)；
N：酶的稀释倍数。
5．谷氨酸的检测此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。
检测培养基：豆饼粉：麸夫=6：4，润水75%，121℃湿热灭菌30min。
谷氨酸测定：于以上培养基中加入7%盐水(W/V)，40～45℃水浴，水解9d 后过滤，以滤液检测谷氨酸含量(测压法)。
四、注意事项
1. 紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。
2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。
五、实验报告
1. 试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。
2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？
六、问题和思考
1．试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。
2．为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？
注：筛选菌株数的计算若按突变率为0.01 计算，则一次筛选可取250—300 个菌落，
第一次筛选后可多选几株高产株，而二级筛选为重点阶段，其最适量可参考以下计算方法：如初筛菌株数为200 株，二次筛选欲选株数为2 株，则二级应选(200×2)1/2，为20 株，这样的数量选择，使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。购买仪器、试剂和耗材——就在易生物！