微生物的诱变育种
微生物菌种的选育和保藏--诱变育种
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢诱变处理： ➢诱变剂的处理方式： ✔单因子处理：采用单一诱变剂处理出发菌株； ✔复合因子处理：两种以上诱变因子共同诱发菌体突变，包括①两种或多种 诱变剂先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。 ➢诱变剂的处理方法： ✔直接处理方法：将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株； ✔生长过程处理法：适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过 程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、 秋水仙碱等；方法：可将诱变剂 加入培养基后涂平板；或先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平 板； 或摇瓶振荡培养处理；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选： ➢ 筛选方案:
➢ 筛选方法： ✔初筛：a.随机筛选：也称摇瓶筛选；随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选； b.平板菌落预筛：在培养皿上诱变后从试样检出突变体的一种
琼脂平板筛选法,有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等; ✔复筛:对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作，代表方法：琼脂
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢ 诱变剂种类的选择：物理诱变剂和化学诱变剂 ✔物理诱变剂：紫外线、χ射线、γ射线、等离子、快中子、ɑ射线、β射线、 超声波等； ✔化学诱变剂: 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等； ➢ 最适诱变剂量选择： ✔诱变剂剂量表示方式：a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积； b.化学诱变剂剂量：诱变剂的浓度和作用 时间的乘 积来表示； c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂 的相对剂量； ✔最适诱变剂量确定：a.依据：最适剂量应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例； b.方法：通过比较剂量--存活率曲线和剂量-
第五章 工业微生物诱变育种
株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
微生物诱变育种的基本过程
微生物诱变育种的基本过程
一、筛选目的菌株
在开始微生物诱变育种之前，首先要确定育种的目标，并从中筛选出具有潜在优良性状的目的菌株。
这一步通常需要利用各种生理生化实验和分子生物学技术，对大量菌株进行初步的筛选和鉴定。
二、诱变处理
在确定了目的菌株之后，接下来需要进行诱变处理。
诱变处理通常包括化学诱变和物理诱变两种方式。
化学诱变使用化学诱变剂处理菌株，而物理诱变则利用物理因素（如紫外线、X射线、中子等）处理菌株。
这些诱变因素可以引起菌株基因的突变，进而产生新的性状。
三、突变体的筛选
经过诱变处理后，大量菌株中会存在各种突变体。
为了获得具有优良性状的目标突变体，需要进行筛选。
这一步通常采用各种筛选方法，如单菌落挑取法、稀释涂布平板法等，将突变体从大量菌株中分离出来。
同时，需要通过各种生理生化实验和分子生物学技术，对突变体的性状进行鉴定和筛选。
四、遗传稳定性检测
在筛选出目标突变体后，需要对其遗传稳定性进行检测。
遗传稳定性是指突变体在繁殖过程中，是否能够保持其优良性状的稳定性。
这一步通常采用连续繁殖法和稳定性测定法等方法进行检测，以保证突变体的优良性状能够在后代中得到保留。
五、生产能力测定
最后一步是测定突变体的生产能力。
生产能力是指突变体在实际生产过程中，能否产生足够的产物并保持稳定的产量。
这一步通常采用发酵实验和产物分离纯化等方法进行测定，以保证突变体在实际生产中具有实用价值。
微生物的诱变育种
2个主要环节：
诱变（随机）
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀 、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞 致死的同时，使存活个体中的突变频率大大 提高。 设计有效的筛选方法，将少量正变株中的 优良菌株挑选出来。
筛选（定向）
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。 出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）； • 对诱变剂敏感 出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
三种遗传型： 野生型（wild type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。 [A+B+], 可在[-]生长。 营养缺陷型（auxotroph） 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能 力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的 突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。 [A+B-]：能在[+]、[B]生长 [A-B+]：能在[+]、[A]生长 [A-B-]：能在[+]生长 原养型（prototroph） 营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求 [A+B+], 可在[-]生长
如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物 ，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株， 可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。 加入不含异烟肼的底层 敏感
菌苔
为什么在筛选突变株时 ,不能直接用代谢产物, 抗性 菌落 而必须用其结构类似物 ? 加入含异烟肼的上层
2. 营养缺陷型突变株的筛选
（1）几个概念： 三类培养基： 基本培养基（MM, minimal medium）[-]： 某野生型能生长的最低成分的组合培养基。 完全培养基（CM,complete medium）[+]： 各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基 补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B 相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
食品微生物诱变育种的步骤
食品微生物诱变育种的步骤引言：食品微生物诱变育种是一种利用诱变技术改良食品微生物的方法，通过诱发微生物的遗传变异，以获得具有理想特性的菌株。
本文将介绍食品微生物诱变育种的步骤，包括诱变剂的选择、诱变条件的优化、筛选和鉴定等。
一、诱变剂的选择诱变剂是诱发微生物遗传变异的关键因素，不同的诱变剂对微生物的诱变效果有所差异。
在选择诱变剂时，需要考虑到其毒性、稳定性和诱变效果等因素。
常用的诱变剂包括化学诱变剂（如亚硝酸盐、亚硝酸钠）、物理诱变剂（如紫外线、γ射线）和基因工程诱变剂（如转座子）等。
根据具体的需求和实验条件，选择适合的诱变剂进行实验。
二、诱变条件的优化诱变条件的优化对于提高诱变效果至关重要。
诱变条件包括诱变剂的浓度、处理时间和处理温度等。
在进行诱变实验时，需要通过一系列的试验确定最佳的诱变条件。
例如，可以通过改变诱变剂的浓度和处理时间，观察微生物的生长情况和遗传变异率，以确定最佳的诱变条件。
三、诱变实验的进行在确定了诱变剂和诱变条件后，可以进行诱变实验。
诱变实验的步骤包括：将待诱变的微生物培养物接种到含有诱变剂的培养基中，经过一定的处理时间后，将处理后的培养物进行稀释和分装，接种到含有适宜营养物和选择压力的培养基中，培养一定时间后进行筛选。
四、筛选和鉴定筛选是诱变育种中非常重要的一步，通过筛选可以从大量的诱变菌株中筛选出具有理想特性的菌株。
筛选的方法多种多样，可以根据具体的需求选择合适的筛选方法。
常用的筛选方法包括抗性筛选、代谢产物筛选和遗传标记筛选等。
通过筛选后，还需要对筛选出的菌株进行鉴定，确认其遗传变异的性质和稳定性。
结论：食品微生物诱变育种是一种有效的改良微生物的方法，通过诱发微生物的遗传变异，可以获得具有理想特性的菌株。
在进行食品微生物诱变育种时，需要选择适合的诱变剂，优化诱变条件，进行诱变实验，并通过筛选和鉴定确认诱变菌株的特性。
这些步骤的合理操作和科学设计，将为食品微生物的改良和应用提供有力支持。
第七章工业微生物诱变育种
丝状菌孢子壁较厚，表面蜡质也会阻碍诱变剂渗入。 或需用洗衣粉、脂肪酶、表面活性剂等处理去除蜡质。
（三）环境条件的影响
1、诱变前预培养和诱变后培养
预培养：培养基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、
吖啶黄、b－重氮尿嘧啶、嘌呤等物质能提高突变率。
后培养：诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是
立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。作用是 让突变体重新调节代谢平衡，避免突变体表型延迟 现象。
五、快速准确的检测方法
建立一个适应于大规模筛选的有效检测方法是减少 诱变选育工作量的关键。
分光光度法 液相色谱法 气相色谱法
化学滴定法 薄层层析法
六、最佳的菌种保藏方法
事先要建立一个最佳的培养基、培养条件和适 宜的保藏方法，否则将前功尽弃。
第二节 诱变育种的步骤与方法
诱变育种的优缺点 优点：方法简单、投资少、收获大； 缺点：缺乏定向性。
4、浓度梯度法
合成抗生素的水平与其耐自身产物能力相关。
5、应用复印技术快速筛选变株
产脂野生株、具有高脂含量的突变株。 方法：筛选培养基→ 复印→ 苏丹黑染色→洗去 多余染料→酒精脱色→干燥显色→选择深蓝色或紫 色的菌落。
6、琼脂块大通量筛选变株
适用对象：抗生素、酶类产物。 优点：效率提高15-20倍。 缺点：产物浓度高时易漏筛，培养条件与发酵条件
细菌：生长指数期，最好在诱变处理前进行摇瓶 振荡预培养，尽可能获得同步培养物。
某些不产孢子的真菌：菌丝体，最好采用年幼的 菌丝体进行诱变处理。获得的方法：菌丝尖端法、 处理单菌落周围尖端菌丝法和混合处理法。
菌丝尖端法
枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液：试验菌液用2%蛋 白胨配成3-4×105个/mL浓度共50ml。
第七章微生物的遗传变异和育种2
10-6~10-9
若干细菌某一性状的突变率
菌名
突变性状
突变率
Escherichia coil （大肠杆菌）
抗T1噬菌体
3×10-8
E．coil
抗T3噬菌体
1×10-7
E．coil
不发酵乳糖
1×10-10
E．coil
Staphylococcus aureus（金黄色葡 萄球菌）
S．aureus
抗紫外线 抗青霉素 抗链霉素
间接引起置换的诱变剂：
引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧 啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤 （8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP） 等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA 分子中后而引起的，故是间接的。
（2）移码突变（frame-shift mutation 或phase-shift mutation）
（四） 基因突变的自发性和不对应性的证明
一种观点：突变是“定向变异”，是“驯化”，是由环 境因子诱发出来的；
另一种观点；基因突变是自发的，且与环境因素是不对 应的，后者只不过是选择因素；
1、 变量试验（fluctuation test） 又称波动试验或彷徨试 验。
2、涂布试验（Newcombe experiment） 3、平板影印培养试验（replica plating） 1952年，J．Lederberg夫妇
2、定向培育优良品种：指用某一特定因素长期处理某微生 物的群体，同时不断的对它们进行移种传代，以达到积 累并选择相应的自发突变株的目的。由于自发突变 的 频 率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程十分缓 慢。与诱变育种、杂交育种和基因 工程技术相比，定向 培育法带有“守株待兔”的性质，除某些抗性突变外， 一般要相当长的时间
微生物的化学诱变技术
微生物的化学诱变化学诱变：利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变或真核生物染色体的畸变称为化学诱变。
化学诱变的物质很多，但只有少数几种效果明显，如烷化剂、吖啶类化合物等。
复合处理及其协同效应：诱变剂的复合处理常有一定的协同效应，增强诱变效果，其突变率普遍比单独处理的高，这对育种很有意义。
复合处理有几类：同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂先后使用，两种或多种诱变剂同时使用。
定向培育和驯化：定向培育是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将他们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。
由于自发突变的变异频率较低，变异程度较轻，故变异过程均比诱变育种和杂交育种慢得多。
微生物化学诱变的操作过程化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。
化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，移取液体时绝对禁止直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防止污染环境，造成公害。
一、碱基类似物用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5-IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的结构类似物。
最常用是5-BU和AP。
当将这类物质加入到培养基中，在繁殖过程中可以掺入到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。
它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，困此，也叫掺入诱变剂。
显然这一类诱变剂要求微生物细胞必顿处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。
（一）碱基类似物的诱变机制正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。
5-BU导致A:T碱基对转换为G:C碱基。
2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中A:T－G:C或G:C－A:T的转换。
（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）1．单独处理将微生物液体培养到对数期，离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8~10 h，消耗其体内的贮存物质、将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25~40 μg/mL，温合均匀，取0.1~0.2 mL菌悬液加入到琼脂培养基上涂布培养。
微生物育种学的主要原理和技术
微生物育种学的主要原理和技术摘要微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。
微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等，育种技术的不断成熟，大大提高了微生物的育种效果。
本文将讲述微生物育种学的主要原理和技术。
关键词：微生物育种原理方法技术1.微生物育种学的主要原理微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。
其原理如下：生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制→不会有代谢产物的积累→解除或突破微生物的代谢调节控制→目的产物积累→微生物育种的目的2.微生物育种学的主要技术2.1 自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。
所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。
互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。
自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。
为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。
自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。
但是自然选育的效率低，因此经常要与诱变育种交替使用，以提高育种效率。
由于DNA的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除修复、重组修复、诱导修复等作用，使得自发突变几率极低，一般为10-6～10–10。
所以常规育种时间较长，工作量较大。
通过常规育种提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不明显。
微生物 诱变育种
紫外损伤的光复活作用
DNA损伤的修复
切补修复 切补修复是在内切核酸酶、
外切核酸酶、DNA聚合酶以及 连接酶的协同作用下将嘧啶 二聚体酶切除去，继而重新 合成一段正常的DNA链以填补 酶切所留下的缺口，使损伤 的DNA分子恢复正常的修复方 式。由于整个过程不依赖于 可见光，所以切补修复也称 暗修复。切补修复几乎存在 于所有的微生物中。
也可用长了菌落的平板直接照射。 一般照射剂量4~10万伦琴。
此外还能引起染色体畸变，即因 染色体断裂引起染色体的倒位、 缺损和重组等。但发生了染色体
断裂的细胞常常不稳定。
化学诱变因素
化学诱变剂用量很少，诱变时设
备简单，只要一般实验室的玻璃 器皿就行，所以其应用发展较快。
碱基类似物
碱基类似物是指与DNA结构中的四种碱基 A、T、G、C在化学结构上相似的一类物 质。如5-溴尿嘧啶（BU）和5-溴脱氧尿
紫外损伤的切补修复
紫外线照射的操作方法
在暗室中安装的15瓦紫外线灯管最 好装有稳压装置，以求剂量稳定。
处理时，可将5毫升菌悬液放在直径 5厘米的培养皿中，置磁力搅拌器上， 使培养皿底部离灯管30厘米左右， 培养皿底要放平，处理前应先开灯 20~30分钟预热稳定。照射时启动磁 力搅拌器，以求照射均匀。
诱变育种
第一节基因突变
突变泛指细胞内（或病毒颗粒 内）的遗传物质的分子结构或 数量突然发生的可遗传的变化。
突变往往导致产生新的等位基 因及新的表现型。狭义的突变 专指基因突变，也称点突变， 而广义的突变则包括基因突变 和染色体畸变。
突变的几率一般很低，约为106~10-9。
突变是工业微生物产生变种 的根源，是育种的基础，但 也是菌种发生退化的主要原 因。
第二章微生物育种的原理和方法
第二章 微生物育种的原理和方法微生物育种原理和方法微生物育种筛选方法微生物育种原理和方法一、微生物育种原理方法：突变、体内重组体外重组（基因工程）1、从自然界中获得新菌种微生物资源分布：土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所2、分离微生物新种的步骤 采样、增殖、纯化和性能测定等步骤3、典型的微生物采样和筛选方法生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制不会有代谢产物的积累解除或突破微生物的代谢调节控制目的产物积累微生物育种的目的直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。
往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产二、诱变育种方法1、物理诱变：紫外线2、化学诱变：5-溴尿密啶1）紫外线诱变机理：造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应2）诱变过程中需要注意光复活作用：微生物等生物的细胞内存在光复活酶，光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物（此时的光复活酶没有活性），可见光光能（300-500nm）激活光复活打开二聚体，将DNA复原。
暗修复：细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。
暗修复体系有四种酶参与反应。
紫外诱变的特点：方便、诱变效果很好的常用诱变剂由此说明紫外线照射引起微生物突体形成是一个复杂的生物学过程。
紫外线引起DNA结构的改变仅仅使微生物，于亚稳定状态，点亚稳定到稳定的突变体的形成需要“定时间和过程，所以在实际诱变工作中要采取某些措施避免以上的修复作用，要注意避光或加入某些物质，提高突变的频率。
因此，用紫外线进行诱变时，照射或分离均应在红光下进行。
3）化学诱变剂诱变机理：5-溴尿嘧啶诱变——碱基类似物机理：与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应注意的参数：参数：浓度、时间、缓冲液三、诱变育种的基本过程诱变育种的基本过程如下：1）出发菌株的选择A、一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。
第六章微生物诱变育种
土曲霉
土曲霉
链霉菌
不明显 4.7
31.0 35.0 6.06 1.78 12.5
氮芥+紫外线
紫外线+γ射线
11.0
43.6
金色链霉菌 (2U-84)
二乙烯 三胺 硫酸二 乙酯 紫外线
紫外线
二乙稀三胺+紫外线 硫酸二乙酯+紫外线
26.6 35.86
灰色链霉菌 (JIC-1)
9.8
紫外线+可见光照射1次 紫外线+可见光照射6次
微生物特异性平板检测方法
制作：王洪刚 李斯深
31
饱浸含某种指示 剂的固体培养基 的滤纸片变色圈
固体培养基中渗入溶解性 差、可被特定菌利用的营 养成分，造成不透明的培 养基背景。菌落利用此物 质形成透明圈。
指示剂直接掺入或喷洒固 体培养基，菌落周围形成 变色圈。如淀粉的平皿上 喷上稀碘液
待筛选的菌株能 分泌产生某些能 利用一些有特别营养要 抑制工具菌生长 求的微生物作为工具菌， 的物质 如待筛选菌具有该营养 物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕 该菌生长
32
突变株的筛选：
（1）产量突变株的筛选：琼脂块培养法 （2）抗药性突变株的筛选：梯度平板法 （3）营养缺陷型突变株的筛选：影印平板 法等 （4）形态、色素、酶活性和拮抗性等变异 菌株的筛选
现代工业微生物育种
现代工业微生物育种一、诱变育种诱变育种是通过使用物理或化学方法，如紫外线、X射线、化学诱变剂等，诱导微生物发生基因突变，从而产生具有新性状的菌株。
这种方法可以大幅度提高微生物的变异频率，为育种工作提供了丰富的材料。
二、基因工程育种基因工程育种是通过人工构建基因表达载体，将其导入到微生物中，从而实现基因的转移和表达。
这种方法可以定向地改造微生物的遗传物质，使其表达出所需的性状。
基因工程育种具有高度定向性和可预测性，是现代工业微生物育种的重要手段之一。
三、代谢工程育种代谢工程育种是通过改变微生物的代谢途径，提高其代谢产物的产量或改变代谢产物的性质，从而获得所需的菌株。
这种方法需要对微生物的代谢过程有深入的了解，并能够精确地调控其代谢网络。
代谢工程育种在现代工业微生物育种中具有重要的应用价值。
四、组合生物合成育种组合生物合成育种是通过构建多个基因的组合文库，并筛选出具有所需性状的菌株。
这种方法类似于基因工程育种，但具有更高的遗传复杂性，可以创造出更丰富的变异类型。
组合生物合成育种在现代工业微生物育种中已经成为一种重要的策略。
五、定向进化育种定向进化育种是一种模拟自然进化过程的育种方法。
它通过对大量随机突变体进行筛选和选择，以实现所需性状的定向进化和优化。
定向进化育种可以在短时间内获得高度适应特定条件的优良菌株，具有很高的应用价值。
六、菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮是工业微生物育种的重要环节。
通过科学的保藏方法，可以保持菌种的活力和遗传稳定性；而复壮则是通过一定的手段使保藏的菌种恢复活力，以保证其用于生产的性能。
七、基因组编辑育种基因组编辑育种是利用基因编辑技术对微生物基因组进行精确的编辑和改造，以实现定向改良和创造新品种的目的。
目前常用的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、ZFNs和TALENs等。
基因组编辑育种具有高度精确性和可控性，为现代工业微生物育种提供了强有力的工具。
请说明微生物诱变育种的一般流程
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诱变育种
4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释 分离，计数活菌细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装 30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。 6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛选。
化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物、吖啶化 合物、脱氨剂等。
1.提高有效产物的产量
包括提高野生菌种和改变菌种的代谢产物和中间 产物的产量。 2.改善菌种特性、提高产品质量 通过诱变育种，除了可以获得高产突变株之外， 还可以选育到一些具有良好性质的变株，包括改 善产品的质量、提高有效组分比例、缩短周期以 及适合发酵工艺要求的变株
3.简化工艺条件
选育出更适合工业化发酵的要求的突变株。(例如选育 孢子生产能力强的变株；泡沫产生少的变株；发酵液黏 度小的变株；抗噬菌体变株；无油的变株；发酵低热变 株；低空气量要求的变株等)。
一、诱变前对出发菌株的了解
1、区分不同菌落类型
一般情况下，在同一种培养基和培养条件下往往会出现 多种形态类型的菌落(2～5种)，从中找出正常性菌落。
2、出现不同菌落类型的原因
①遗传因素决定的 是出现不同菌落类型的主要原因(如自 发突变、回复突变、异核体分离等）。
②非遗传因素引起的（因培养条件的变动，菌种会产生一 些类似遗传的现象，一旦恢复原来的条件，其就会恢复到原 有性状）。
1.培养基是影响孢子形成的重要因素之一，其中碳氮的 种类及浓度对其影响很大。
2.斜面制备技术（培养基的灭菌条件的控制，平板的制 取，琼脂的加入量选择等).
3.移种的密度。
4.温度 温度对菌种影响很大，一般情况下温度高则生 长快，但超过一定范围，则会使生产能力显著下降， 甚至引起变异。
微生物诱变育种
灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系
菌号 诱变代数
菌落大小 /cm
4541 1
1.3
71046 10
0.8
B-53 11
第四章 微生物诱变育种
诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传 结构和功能，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性状优 良的突变株， 并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件， 使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。
分三个阶段：菌种基因型改变， 突变体筛选，产量评估
基因突变是微生物变异的主要源泉，人工诱变是加速基因突 变的重要手段。诱变育种有以下几个优点：速度快、收效大、 方法简单。
一、出发菌株
对出发菌株的要求： 1. 对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高 2. 具有一定生产能力 3. 具有有利性状，如生长速度快、营养要求低以及产孢子
早而多的菌株
4. 有时可考虑选择已发生其他异的菌株作为出发菌株。
5. 采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变 剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。
1. 抗生素法 常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青
霉素法，后者用制霉菌素法。
青霉素法的原理为：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类， 而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完 整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感， 因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细 菌。 制霉菌素法原理：制霉菌素作用于真菌细胞膜上的甾醇， 引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集 营养缺陷型菌株的作用。
微生物诱变育种
微生物诱变育种：生命的奇妙微生物是我们身边最小的生命体，很多时候我们并不能直接感知它们的存在。
然而，它们却能通过一种特殊的方式——诱变（Mutation）——影响着我们生活中的各种生物群体，包括人类、动植物等等。
今天，我们就来谈谈这个新颖而神秘的话题。
什么是？简单来说，指的就是利用微生物对某种生物进行诱变，从而改变它的基因表达，产生新品种、新性状的一种育种方法。
这个方法的基本原理是：用化学或其他手段让微生物基因发生突变，再通过微生物对某种有用的基因进行筛选，最终通过繁殖来获得新生物种。
诱变是什么？这里我们需要先了解诱变的概念。
诱变是指基因发生变异，导致基因型和表型的改变，是一种与遗传和进化有关的生物现象。
地球上存在着各种各样的微生物，它们在不同的环境和生长条件下会产生大量的基因突变。
这些基因突变可能是随机的或者是特定的，在这个过程中，新的基因型可能获得某些新的性状，这样的性状可能比它们的亲代更有生存优势。
为什么是一种前景广阔的育种方法？之所以前途广阔，是因为它具有以下几个优点：首先，基因突变是自然而然的，而方法则是针对性地诱导微生物进行突变。
这一方法大大缩短了新品种的选育时间和成本。
其次，这种方法不涉及基因编辑技术和转基因技术。
这一点非常重要，因为基因编辑技术和转基因技术可能会对人类和环境造成潜在的风险。
最后，方法具有高效、广泛适用性等诸多优点。
由于微生物的数量庞大，不同的微生物可以用于诱变不同的生物，且微生物在实验中具有高容错性。
在实践中有哪些成功案例？在实践中已经有了很多成功案例。
比如，在植物育种方面，通过微生物诱变，我们可以获得既耐旱又耐病的新品种；在饲料育种方面，我们可以获得既营养丰富又易于消化的新饲料等等。
的应用还不止于此，例如医疗领域，我们可以通过微生物诱变来研制更加安全、有效的药物；在水产养殖中，通过微生物诱变可以获得更加健康和肥壮的水生动物。
结语是生命科学领域的一种创新、前沿的研究方向。
工业微生物诱变育种
四．摇瓶液体培养
常规随机筛选的全过程，都要通过摇瓶培养，而 平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后，弃去大量 低产菌株，被挑选的菌落移入试管斜面，然后再 迸行摇瓶液体培养；才艳逐步地筛选出高产菌株。
产物活性测 定
一．琼脂平板活性圈法
二．滤纸片法
三．琼脂薄层纸片法
○ 筛选菌种为一种重复性和计量性的工作，所 以必须应用统什方法。区别并肯定其产量上 的差异。以便迸行下轮育种的评估。
处理具体方法
一．直接处理方式，将菌悬液用物理、化学因子处 理，然后分离，直接处理是最常用的方式。
二．生长过程处理，适用于诱变作用强的而杀菌率 较低的诱变剂，或在分裂过程中只对DNA起作 用的诱变剂，如NTG、秋本仙碱等。
六．影响突变体的因素
七．菌种遗传特性不同
八．菌体细胞壁结构
○ 丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗人细胞，减弱与 DNA的作用。一般加大诱变剂量，效果会好一些。有的微生物细胞壁 含有蜡质，常用一定浓度的洗衣粉、脂肪酶处理，除去蜡质，提高诱变 效果。
解除反馈抑制筛选模型 一二．初筛来用大通量的琼脂块法 一三．结合饰变育种
原生质体作为诱变材料
制备原生质体，用0.6％纤维素酶+0.6%蜗牛酶处理 3h， 0.6％ NaCI＋0.3%CaCl2作稳定剂，可获得 原生质体。采用麸皮＋琼脂粉作为再生培养基。
将菌体制备成原生质体后，用UV、和He-Ne，激光 进行诱变。经筛选发现，原生质体对诱变剂的敏感 性要比孢子大得多。
实践证明并非所有的诱变剂对某个出发菌株都是有效的。一种 诱变剂对A菌株有较高的诱变效应；对B菌株则可能相反。不 同微生物对同一种诱变剂敏感性有很大区别。
01
选择诱变剂
选择诱变剂时要注意选择专一性比较强的诱变剂。
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微生物的诱变育种
作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18
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一、实验目的和内容
目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。
内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。
2．用紫外线进行诱变处理。
3．用平板透明圈法进行两次初筛。
4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。
二、实验材料和用具
米曲霉斜面菌种；
豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白；
三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。
三、操作步骤
(一)出发菌株的选择及菌悬液制备
1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。
2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。
然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。
(二)诱变处理
用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。
本实验学习用紫外线照射的诱变方法。
1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。
取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。
逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。
照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。
2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。
(三)优良菌株的筛选
1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。
2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。
培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。
3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，
豆饼粉(或面粉)15g，加水95～110mL(称为润水)，水含量以手捏后指缝有水而不
下滴为宜，于500mL 三角瓶中装入15～20g(料厚为1～1.5cm)，121℃湿热灭菌30min，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h 后摇瓶一次并均匀铺开，再培养24～48h，共培养3～5d 后检测蛋白酶活性。
4．蛋白酶的测定方法
(1)取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加蒸馏水100mL，(或200mL),40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液测定酶活性。
另取lg 培养物于105℃烘干测定含水量。
(2)酶活性测定：30℃pH7.5 条件下水解酪蛋白(底物为0.5%酪蛋白)，每分钟产酪氨酸1μg 为一个酶活力单位。
计算公式为：
(A样品OD680nm 值-A对照OD680nm 值)×K×V/t×N
K：标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数；
V：酶促反应的总体积；
t：酶促反应时间(min)；
N：酶的稀释倍数。
5．谷氨酸的检测此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。
检测培养基：豆饼粉：麸夫=6：4，润水75%，121℃湿热灭菌30min。
谷氨酸测定：于以上培养基中加入7%盐水(W/V)，40～45℃水浴，水解9d 后过滤，以滤液检测谷氨酸含量(测压法)。
四、注意事项
1. 紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。
2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。
五、实验报告
1. 试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。
2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？
六、问题和思考
1．试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。
2．为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？
注：筛选菌株数的计算若按突变率为0.01 计算，则一次筛选可取250—300 个菌落，
第一次筛选后可多选几株高产株，而二级筛选为重点阶段，其最适量可参考以下计算方法：如初筛菌株数为200 株，二次筛选欲选株数为2 株，则二级应选(200×2)1/2，为20 株，这样的数量选择，使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。
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