_酶与细胞的固定化
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
第五章 固定化酶和细胞
制备固定化酶的依据
1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化 固定化酶必须能保持酶原有的专一性 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 固定化酶应能回收 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作 固定化酶应用于机械化和自动化操作， 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体 常有一定的机械强度。 常有一定的机械强度。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性 固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即 要保护活性中心基团。 要保护活性中心基团。 5.固定化酶应能最大程度与底物接近 固定化酶应能最大程度与底物接近， 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产 具有最小的空间位阻。 量。具有最小的空间位阻。 6.固定化酶应有最大的稳定性 固定化酶应有最大的稳定性。 6.固定化酶应有最大的稳定性。 7.固定化酶应易与产物分离 固定化酶应易与产物分离。 7.固定化酶应易与产物分离。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 1973年 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L 天门冬氨酸。 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 固定化细胞技术 技术。 1976年 固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年 日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 固定化原生质体生产谷氨酸 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 更有利于胞内物质的分泌， 更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的 变革提供了新的方向。 变革提供了新的方向。
酶和细胞的固定化
交联法
交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶 分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化 方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添 加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定 化酶。
交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定 酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较 难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法 的辅助手段。常用的双功能试剂有戊二醛、己 二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用 最广泛的是戊二醛。
共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定 化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载 体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先 用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某 些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价 键。
共价结合法的优缺点
共价结合法所得的固定化酶与载体结合比较牢 固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前 研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较 其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更 加严重。
缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度、 离子强度等条件的变化都易使酶从载体脱落， 并且污染催化反应产物。
离子结合法
离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交 换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载 体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换 树脂，如DEAE-纤维素 、AmberliteCG-50 、 XE-97和Dowex-50等。
物理吸附法：是利用酶和载体间的非特异性物 理吸附作用将酶固定在载体表面，这些物理吸 附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电 作用等。
物理吸附法的优缺点
优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很 大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯 化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不 变，因此对酶的催化活性影响小。
如光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化 酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于 条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。
固定化技术应用-酶和细胞的固定化
固定化技术应用－酶和细胞的固定化试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。
选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。
也就是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。
问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固定化细胞？011.固定化酶技术固定化酶技术是用物理或化学手段。
将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
2.固定化酶技术的发展以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。
科学家们就开始了同定化酶的研究工作。
1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。
我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。
当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。
邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。
Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。
固定化酶与固定化细胞
(2) 共价结合法
此法得到的固定化 酶结合牢固、稳定 性好、利于连续使 用，因此它是目前 应用最多的一类固 定化酶的方法。
借助共价键将酶的活性非 必须侧链基团或细胞表面 基团（如氨基、羧基、羟 基、巯基、咪唑基等）和 载体的功能基团进行偶联 以达到固定化目的方法。
共价偶联法的优点、缺点
共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性 好、利于连续使用。 共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激 烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。 同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化 活性产生影响。
ro
rb
NaCS
ri
NaCS
ra
固定化酶的制法及其特性比较
特性
共价键 结合法
制备方法
离子 结合法
交联法
物理 包埋法 吸附法
制法 酶活力 底物特异性
难 高 易变
结合能力 再生
强 不可
易 高 不变
难 中 易变
中 可能
强 不可
易 低 不变
弱 可能
难 高 不变
弱
不可
固定化酶的保存方法
一．真空冷冻干燥保存（长期保存） 二．低温保存 三．多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体
含羟基的载体可用三氯 三嗪等多卤代物进行活 化，形成含有卤素基团 的活化载体。
D．硅烷化法
多孔玻璃特点： 机械强度好，表面积大。 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿
命长等。
D．硅烷化 法
一般常用的载体：多 孔玻璃，多孔陶瓷。
D
． 硅 烷 化 法
D
． 硅 烷 化 法
D．硅烷化 法
E ．溴化氰法
大小 和总吸附面积的大小。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶作为生物体内的催化剂，具有高效性和高特异性的特点。
但在工业生产中，酶稳定性差、易流失，造成成本过高，限制其广泛应用。
因此将酶采用固定化技术，使酶在发挥其高效、专一性同时，还能增强酶的贮存稳定性，提高了生产效率，节约了成本。
本文对酶和细胞的固定化技术进行综述。
【关键词】酶细胞固定化载体应用酶及细胞固定化技术是生物技术的重要组成部分。
20世纪60年代出现了固定化酶技术，60年代末固定化酶技术用于工业生产，70年代出现了固定化细胞技术，80年代又发展了固定化增殖细胞技术以及包括辅助因子在内的固定化多酶反应体系技术。
工程技术日益成熟，成为近代工业生产中不可缺少的组成部分。
所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶或细胞（微生物），定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。
固定化细胞的制备方法是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。
一般来说，固定化技术大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等4大类，其中以包埋法使用最为普遍。
一、固定化技术分类1.吸附法很多细胞都有吸附到固体物质表面的能力，这种吸附能力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。
吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，是一种最古老的方法，操作简单、反应条件温和、载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。
后者根据细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素等。
2.共價结合法共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。
第二章 4 固定化酶与固定化细胞
一． 影响固定化酶性质的因素
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
一． 影响固定化酶性质的因素
2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3.
固定化方法的影响
二．固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降， 反应速度下降，专一性 原因：酶结构的变化
1973年，出现固定化菌体，日本首次在工 业上应用固定化大肠杆菌菌体。 70年代出现了固定化细胞技术。1976年， 法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒 精，1978年，日本用固定化枯草杆菌生产 淀粉酶。 1982年，日本首次研究用固定化原生质体 生产谷氨酸。
第二节 固定化酶的制备
一．选择方法依据：
第四节 固定化原生质体和辅酶
一 原生质体的制备 二原生质体的固定化 三 辅酶固定化
二 原生质体固定化的方法
将原生质替制备好后，把离心收集到的原生
质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液 中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后 采用包埋法制成固定化原生质体。
三. 辅酶固定化
1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团， 参与酶的催化反应
4． 新能源开发中的应用
H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生 H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌 连续产氢，稳定性比天然细胞好。
将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶
原膜包被，可用于水的光介产生氢气和氧气
5． 固定化酶在基础理论研究中应用
研究蛋白质-核酸分子结构
酶和细胞固定化方法
酶和细胞固定化方法
作用力载体
物理吸附法物理吸附石英砂，多孔玻璃，淀粉，硅胶，活性碳
载体结合法离子结合法离子键离子交换树脂
共价结合法共价键纤维素，尼龙
交联法：利用双功能试剂，在酶分子间发生交联，凝胶形成网状结构。
包埋法：将酶包埋在凝胶的微细格子里，或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子只能从凝胶的网络中漏出，而小分子的底物和产物可自由通过。
格子型常用凝胶：角叉菜胶，明胶，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶
微胶囊。
固定化酶与固定化细胞
世界上第一种工业化生产的固定化
酶 乙酰 -DL — Ala
L — Ala +乙酸
乙酰 -D — Ala
.
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化 酶柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
.
2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模
最大, 应用最为成功 的一种固定化酶。
.
固定化方法
吸附法
包埋法 共价结 交联法
物理吸附法 离子吸附法
合法
制备难易 易
易
较难 难
较难
结合程度 活力回收
弱
中等
高，酶易流失 高
强
强
强
高
低
中等
再生
可能
可能
不能 不能 不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
不变
.
不变 可变 可变
三 细胞的固定化方法
• 1.固定化细胞的分类 • 2.固定化方法
.
1.固定化细胞的分类
.
3.固定化原生质体
意义:
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩
散障碍，有利于氧的传递，营养成分
的吸收和胞内产物的分泌。
(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定
化后，由于载体的保护作用，稳定性
提高。
.
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 (二) 蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法 .
酶与细胞的固定化
酶与细胞的固定化
一、为什么要进行酶的固定化？
（1）游离酶的稳定性较差：在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。
(2)游离酶难于连续化生产：酶与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用。
这种一次性使用酶的方式，不仅使成本较高，而且难于连续化生产。
(3)游离酶给下游的纯化工作带来了难度：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难。
二、固定化酶的概念：是指固定在载体上或被限制在一定的空间范围内，能连续进行催化反应，且反应后能回收并重复利用的酶。
三、固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。
也称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。
四、与游离酶相比，固定化酶优缺点各在哪里？
固定化酶优点：
五、固定化方法有哪几类？各类的优缺点及适合范围是什么？
酶固定化的方法很多，主要可分为载体结合法、交联法、包埋法和热处理法等。
现分述如下；。
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
酶与细胞的固定化
（二）包埋法
原理
– 将酶包埋于格子(Lattice)内，格子的结构可以防止蛋白质 渗出于周围基质中，但是底物仍能渗入格子内与酶相接 触
优缺点
– 优点：酶分子本身不参加水不溶性格子的形成、方法较 为简便、酶分子未受到化学作用、活力较高
– 缺点：不适用于大分子底物
根据使用包埋剂分类
– 聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法、 大豆蛋白质包埋法、微囊法等
– 利用聚丙烯酰胺凝胶或胶原膜包埋谷氨酸棒杆菌，用分批法或装柱 法连续由葡萄糖合成
L-苹果酸
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌
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（五）生产 a-淀粉酶
方法
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋枯草杆菌
特点
– 凝胶中的细菌在保温过程中仍在生长
36
二、固定化技术需要考虑的重要因素
本征速率和动力学参数
– 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂凝胶、骨胶原、海藻酸钙 凝胶，K-角叉菜聚糖等
26
常用包埋剂的优缺点
K-角叉菜聚糖
– 制法简单，机械强度好，稳定性高，不影响细胞的代谢 活力
– 国内来源困难
海藻酸钙
– 钙离子容易被培养基中的磷酸根离子夺走而使凝胶解体
聚丙烯酰胺凝胶
– 孔径控制容易，机械强度好，富有弹性，细胞的活性高
抗生素
– 利用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽， 比传统发酵法（用淀粉-肉汤培养基）优越
33
（三）生产酒精和啤酒
酒精
– 传统酒精发酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂， 操作困难，而且耗费一部分糖以供酵母生长之用 – 应用固定化细胞进行连续发酵后，酒精发酵时间 由传统方法的36h缩短至3h以下，乙醇生产能力 每小时为20～50g/L，而传统方法仅为2g/L – 细菌固定化的研究也颇为活跃
生化工程固定化酶和细胞
底物从反应液传递到载体表面 （外扩散）
↓
底物从载体表面移向酶活性中心 （内扩散）
↓
底物与酶反应
↓
产物由反应位点移向载体表面 （内扩散）
↓
产物传递到反应液中（外扩散）
¾ 总的反应速度取决于最慢的步 骤
就是说固定化酶反应过程是由底物及产物的外 扩散、内扩散及反应等一系列分过程组成的。 传质过程必然影响到总体过程的速率。
④选择率Ssp (selectivity)
当反应过程中有副反应发生，除生成目的产物 外，还生成其它产物时，通常使用选择率这个概 念。
Ssp是指实际转化成目的产物量与全部底物可生
成产物S的sp 理= 论as量p (之sp0 比− 。s)
式 中 asp代表1摩尔底物能生成目的产物P的理论量 （摩尔），其数值取决于反应的计量式。
这种由物质扩散引起的固定化酶反应动力学与 游离酶间的差异称为扩散效应。
一般规律为： ①这种效应对反应速度的影响程度既取决于该效
应本身的大小，也取决于它和酶反应固有速度的 相对大小。这就是说，如果酶反应本身的速度很
小，扩散限制产生的影响也就小一些；反之，扩 散限制就将在整个过程起律速作用。
将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床， 然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现 酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液 (含产物)。在柱床中，液体流动状态接近于平推 流(又称活塞流)型，因此，填充床反应器可以近 似地看成是一种平推流型反应器。
填充床反应器
带循环的填充 床反应器
由于它且有高效率、易操作、结构简单等优点， 因而是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反 应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体 颗粒、强度不大的底物溶液，以及有产物抑制的 转化反应。
酶工程 第六章酶与细胞固定化 第四节 原生质体固定化
第四节 原生质体固定化
3.生物碱的生产 1985年，Kome等人进行固定化麦角菌原生质体生产麦 角碱的研究，虽然产率不高，但显示出较好的操作稳定性， 可连续使用15天。 4.甾体转化 1985年，Linsefors等人用固定化胡萝卜原生质体进 行甾体转化的研究，可以催化毛地黄毒苦进行5β-羟基化 反应，生成杠柳毒苷。 5.木质素降解 1988年，Boettcher等人用固定化白腐真菌原生质体 进行降解木质素的研究，其降解能力比游离细胞显著提高。 从上述例子可见，固定化原生质体技术虽然研究历史 不长，但已在多个领域的研究中显示出其优越性，具有广 阔的应用前景。
第四节 原生质体固定化
2.胞内酶的生产
1986年，华南理工大学生物工程研究所用固定化枯草 杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞间质中 的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36％，可 连续使用37天；用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化 酶，使细胞内的葡萄糖氧化酶，90％以上分泌到发酵液中； 用固定化谷氨酸棒杆菌原生质体生产谷氨酸脱氢酶，分泌 到发酵液中的谷氨酸脱氢酶占该酶总量的62％。
第四节 原生质体固定化
三、固定化原生质体的应用
固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特 性，可以照常产生原来在细胞内生产的各种代谢产物，另 一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不 断地分泌到胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺 而在发酵液中获得所需的发解产物，为胞内物质的工业化 生产开辟了新途径。
固定化原生质体的制备主要包括原生质体的制备和原 生质体固定化两个阶段。
一、原生质体的制备
第三章 酶和细胞的固定化技术及其应用
固定化酶的活性 固定化酶的活性较水溶性酶有所下降 原因： 原因： 酶分子空间结构的变化，影响活性中心氨基酸。 空间位阻影响底物与酶的定位作用。 外扩散和内扩散阻力影响底物与酶的接触。 个别固定化酶活力增强可能是酶得到化学修饰或稳定性增 加。
共价结合法由于反应剧烈，最容易改变酶蛋白构象，对酶 活性影响很大。 载体材料可通过影响反应组分的分配效果而改变固定化酶 的反应活性。 提高搅拌速度、加快流体流动可以改善外扩散限制。
常用固定化材料
无机材料 碳酸钙 氧化铝 活性炭
有机材料 聚乙烯醇 聚乙烯 尼龙
生物材料 纤维素 葡聚糖 海藻酸盐
新型固定化载体
纳米材料
磁性微球
等离子体材料
固定化方法
酶的固定化方法主要可分为五类：吸附法、包埋法、 微囊法、共价键结合法和交联法等。吸附法和共价键结合 法又可统称为载体结合法。
吸附法
细胞固定化
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化 技术。 被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。 一般采用对细胞伤害较小的吸附法和包埋法。 特点： 特点： 密度大、可增殖。 提高生产能力，缩短发酵周期。 稳定性高，可反复利用。 有利于产品分离纯化。
吸附法固定细胞
采用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定 化的方法称为吸附法。 吸附法是细胞固定化中使用最广泛的方法。
载体和固定化方法
Байду номын сангаас
固定化酶性质
目标要求、反应器特点、 目标要求、反应器特点、各部分特性
载体选择的原则
必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催 化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性 中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状 态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构 成活性中心的氨基酸残基不发生变化。这就要求酶与载体
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种将酶或细胞固定在某种材料上，以便进行特定反应的技术。
这种技术可以有效地提高反应速率、稳定性和重复使用性，广泛应用于生物技术、食品工业、环境保护和医药领域。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的原理、应用和未来发展方向。
酶及细胞固定化技术的关键在于将酶或细胞固定在一种载体上，以便进行特定反应。
常用的载体材料包括天然材料如海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇等，以及合成材料如聚丙烯酸酯、氧化硅、氨基硅烷等。
通过交联、吸附、包埋等方法，将酶或细胞与载体结合在一起，形成固定化的酶或细胞系统。
固定化技术的主要优点在于可以提高酶或细胞的稳定性和重复使用性。
通过固定在载体上，酶或细胞可以更好地抵抗外界因素的影响，如温度、pH值、离子强度等。
固定化的酶或细胞可以通过简单的分离和回收，实现反应产物的纯化和酶的再利用。
二、酶及细胞固定化技术的应用酶及细胞固定化技术在生物技术、食品工业、环境保护和医药领域有着广泛的应用。
1. 生物技术领域在生物技术领域，酶及细胞固定化技术被用于生产化学品、药物和生物燃料。
以葡萄糖氧化酶为例，固定化的葡萄糖氧化酶可以用于葡萄糖检测、生物传感器以及生物燃料电池中。
固定化的工程酶也被用于合成生物材料、精细化学品和医药中间体，以实现高效、环保的生产过程。
2. 食品工业领域在食品工业领域，酶及细胞固定化技术被用于食品加工、酿造和酶制剂制备。
在酿造过程中，固定化的酵母细胞可以实现连续发酵，提高酒精产率和控制发酵过程。
而在食品加工中，固定化的酶可以用于降解醣类、蛋白质和脂肪，改善食品的口感和营养价值。
3. 环境保护领域在环境保护领域，酶及细胞固定化技术被用于废水处理、土壤修复和污染物降解。
固定化的微生物可以被用于处理含有重金属、有机物和氮、磷等污染物的废水，减少对环境的影响。
固定化的酶也可以用于土壤修复，去除油污和有机污染，改善土壤的质量。
4. 医药领域在医药领域，酶及细胞固定化技术被用于药物的制备、生物传感器和组织工程。
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二、酶的固定化方法
?酶的固定化方法有： ?1.吸附法 ?2.共价键结合法 ?3.交联法 ?4.包埋法 （图5-1）。
1. 吸附法
?吸附法分为 物理吸附法 和离于交换吸附法 ?（1）物理吸附法 通过氢键、疏水作用和 π电子亲
和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。从而 制成固定化酶。 常用的载体有： ? （1 ）有机载体
用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了 产物抑制和消耗。 ? (4) 保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定，特别 是对污染因子的抵抗力增加。
? 4.固定化细胞的缺点：
? （1）必须保持菌体的完整，防止菌体自溶， 否则，将影响产品纯度。
? （2）必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解， 同时，需抑制胞内其他酶的活性，以阻止副产 物的形成。
?微胶囊的制备方法：
?（1）界面沉淀法 ?（2）界面聚合法 ?（3）液体干燥法 ?（4）红血球包埋法 ?（5）脂质体包埋法
五、共价键结台法
? 共价键结合法 是酶蛋白的侧链基团和 载体表面上的功能基团之间形成共价键 而固定的方法。
?优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落， 但反应条件较激烈，酶易失活，同时， 制作手续亦较繁琐。
? 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等
? （2 ）无机载体
? 氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。
Байду номын сангаас
? 2 ．离子交换吸附法 这是将酶与含有离子交换基 的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶 吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体 有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基（ DEAE）-纤 维素、混合胺类（ECTEDLA）-纤维素、四乙氨基 乙基（TEAE）-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 Amberlite IRA-93、410、900等。阳离子交换剂 基，如羧甲基（CM）-纤维素、纤维素柠檬酸盐、 Amberlite CG50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。
? （3）载体必须带有在温和条件与酶共价结 合的功能基团。
? （4）载体没有或很少有非专一性吸附。
? （5）载体来源容易，便宜，并能反复使用。
第二节 微生物，植物和动物细胞的固定化
? 菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有 包埋 法、吸附法和不用载体法等。
? 一、包理法
? 包埋法 是制备固定化细胞最常用的方法。将产酶菌株用包 埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、卡 拉胶、二和三醋酸纤维、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来， 发挥酶或酶系的作用。 1977年我国投人生产的固定化青霉 素酰胺酶，是使用明胶、戊二醛包埋大肠杆菌而成。美国、 欧洲和日本等大规模生产高果糖浆的工艺多数采用固定化 菌体的酶柱工艺。包埋法制备固定化细胞与其制备固定化 酶大体相似 。
? 2.固定化酶的缺点 : ? （1 ）酶固定化时酶的活力有所损失。同时也
增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 ? （2 ）比较适应水溶性底物和小分子底物。 ? （3 ）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特
别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分 离后，才能固定化。
3．固定化细胞的优点 ? (1) 省去了酶的分离手续，为多酶系统，无须辅因子再生。 ? (2) 细胞生长快、而且多、反应快。 ? (3) 可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不
四、包埋法
? 包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚 合助进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在 聚合物中以达到固定化 。包埋法操作简单，由于酶分子 只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定 化酶，对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都 是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶 网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质 扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。
? （5）Phe和Tyr残基的苯环。
? （6）His残基的咪唑基。
? （7）Trp残基的吲哚基。
? （二）载体的选择 载体直接关系到固定化酶 的性质和形成。对载体的一般要求是：
? （l）一般亲水载体在蛋白质结合量和固定 化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体。
? （2）载体结构疏松，表面积大，有一定的 机械强度。
? 从60 年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注 意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化 方法和载体开发有了长足发展，而且已转向它在工业、医 学、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论 研究等方面的应用研究。
第一节 酶和菌体固定化
? 一、固定化酶与固定化细胞的优缺点 ? 1.固定化酶的优点： ? （1）极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液
? （一）酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶 蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：
? （1）酶蛋白N-端的a-氨基或赖氨酸残基的 -Ｅ氨基。
? （2）酶蛋白C-端的羧基以及 Asp残基的?羧基和Glu残基γ-羧基。
? （3）Cys残基的巯基。
? （4）Ser、Tyr、Thr残基的羟基。
?1.凝胶包埋法 凝胶包埋法 是将酶分子包
埋在凝胶格子中。
? （1）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 ? （2）辐射包埋法 ? （3）其他凝胶包埋法
2．微囊化法
? 此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微
囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可 以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触， 从而增加了酶的稳定性，同时，小分子底物能 通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。 微胶囊 的制备方法有 5种。
中没有酶的残留，简化了提纯工艺。 ? (2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连
续化、管道化。 ? （3）酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化
和微电脑化。 ? （4）在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 ? （5）较能适应于多酶反应。 ? （6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量
有保障，成本低。
第五章 酶与细胞定化
? 固定化酶（ Immobilized Enzyme ）是20 世纪60 年代 发展起来的一项新技术。以往使用的酶绝大多数是水溶性 的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了 酶工业的进一步发展。 60 年代后，在酶学研究领域内涌现 出固定化酶。它是 通过物理的或化学的手段，将酶束缚于 水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分 子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用 。过去曾称其 为水不溶酶或固相酶。 1971 年第二届国际酶工程会上正式 建议采用固定化酶的名称。