乙肝表面抗原检测操作规程
HBsAg基本操作规程
离石区人民医院检验科作业指导书
主题内容
HBsAg标准操作规程
文件编号：my-sop-O01
版本：B/1
生效日期：2011-10-01
页码：第1页，共2页HBsAg标准操作规程
1.目的规定HBsAg酶联免疫吸附试验的程序和相应的操作
2.范围适用于HBsAg检测
3.责任实验室操作人员严格按要求执行
4.方法原理
4.1方法：双抗体夹心法
4.2原理：采用单克隆抗-HBS包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBS-HRP，当标本中存在HBSAg，该HBSAg与包被抗-HBS结合并与抗-HBS-HRP 结合形成抗-HBS- HBSAg-抗-HBS-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
5．标本
5.1种类：新抽取的血清、血浆；
5.2保存：标本应无微生物，在2-8℃可保存一周，新鲜标本可长期保存在-20℃（或以下），但避免反复冻融。。
6.仪器与试剂
6.1仪器：洗板机 RT-3100 型酶标仪 DNM-9600型
6.2试剂: 北京万泰生物药业股份有限公司无需预处理，置于2-8℃中避光保存，有效期一年；
6.2.1包被反应条；酶结合物；HBSAg阳性对照；HBSAg阴性对照；
6.2.2浓缩洗涤液（用前以蒸馏水作20倍稀释）；
6.2.3底物缓冲液；底物液；
6.2.4终止液；封口胶纸；
6.2.5样本稀释液。
7.检测程序：
检测步骤：冷藏中取出试剂，室温平衡30分钟, 设阴性对照3孔，阳性对照2孔，加样本稀释液，加待测标本,37℃水浴60min,加酶结合物，37℃水浴30min，洗板5次，加显色剂、加终止液，用酶标仪测各孔OD值
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)
乙型肝炎表面抗原（HBsAg）
1、原理：采用抗-HBs包被反应板，加入待测样本，经孵育后，加入抗-HBs-HRP,当样本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗- HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
2、标本采集与处理?
2.1 受检者准备：对于体检对象抽血前保持平时的饮食习惯，采血前应禁食4-6小时。
2.2静脉采血：除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响测定水平。故在采血前至少应静坐５分钟。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过１分钟，穿刺成功后立即松开止血带。
2.3采血管：一般采用血清做检验，可以用一般洁净的塑料管或玻璃试管作为容器。
2.4标本处理：血清：采血后，室温下自然放置1-2小时，待血液凝固、血块收缩后，在于3000转每分钟离心15分钟，吸出血清待用。血浆：采血后，样本和抗凝剂轻轻颠倒混匀6-8次后，充分离心，将血浆与血细胞分离后，吸出血浆待用。
2.5标本接收：接收标本时应检查标本是否符合要求(要求密封、无溶血、无杂物)、所用试管是否正确、试管是否填写完整、并问讯采血日期，对不合格标本应退回重采，并填写记录。
2.6标本储存：一般该标本应随到随做，血清和血浆标本在2-8o c 保存。如需长期保存，可在-20℃保存，并避免反复冻融。
3、试剂与仪器：
3.1测定试剂：
3.1.1生产厂商：英科新创（厦门）科技有限公司
3.1.2批准文号：国药准字S1*******
乙肝病毒表面抗原诊断操作规程
乙肝病毒表面抗原诊断操作规程
一、操作步骤：
1、将试剂盒从冰箱中取出至室温中平衡30分钟后使用。
2、将标本对应微孔按顺序编号。
3、每孔加入待测标本50微升，设阴、阳性对照
各两孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各1滴，并设空白对照1孔。
4、每孔加入酶结合物1滴，（空白对照孔除外）
充分混匀，封板，置37度孵育30分钟。
5、手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，
静置5秒，甩干，重复5次后拍干。
洗板机洗板：选择洗涤5次程序后拍干。6、每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，
封板，置37度孵育15分钟。
7、每孔加终止液1滴，混匀。
8、用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双
波长的酶标仪比色，参考波长630nm），先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。
二、结果判断：
样品OD值/阴性对照平均OD值大于等于2.1判断为阳性，否则为阴性。
阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。
三、注意事项：
1、使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。
2、封片不能重复使用。
3、结果判断须在反映终止后10分钟内完成。
4、不同批号的试剂不可混用。
5、待测标本不可用NaN3防腐，如需稀释标本，请用小牛血清稀释。
6、试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。
乙肝表面抗原检测流程
乙肝表面抗原检测流程
1. 采集样本，通常使用静脉血作为检测的样本。医务人员会使用消毒的针头抽取一定量的血液。
2. 样本处理，采集到的血液样本会被送往实验室进行处理。在实验室中，血清会被分离出来，以便进行后续的检测。
3. 酶免疫法检测，乙肝表面抗原通常使用酶免疫法（ELISA）进行检测。ELISA是一种常用的免疫学检测方法，通过检测血清中特定抗原或抗体的存在来进行诊断。
4. 结果分析，实验室技术人员会分析样本中乙肝表面抗原的检测结果。阳性结果表明患者体内存在乙肝病毒，阴性结果则表明患者体内暂时没有乙肝病毒的感染。
5. 结果报告，最终的检测结果会被记录在报告中，并由医生进行解读和诊断。如果检测结果呈阳性，医生可能会建议进行进一步的检测以确认诊断，并制定相应的治疗方案。
需要注意的是，以上流程仅为一般的乙肝表面抗原检测流程，
具体的操作步骤可能会因医疗机构和实验室的不同而略有差异。在进行乙肝表面抗原检测前，建议咨询专业医生以获取详细的检测流程和注意事项。
1乙肝表面抗原检测操作规程
1.1乙肝表面抗原检测操作规
程
-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
乙型肝炎病毒表面抗原检测（ELISA）
1原理：
在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HbsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。
2试剂：
试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）
试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司
包装规格：96Test/Kit
试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被HbsAb），HbsAg酶标抗体（含HRP标记HbsAb）, HbsAg阳性对照（含基因工程HbsAg），HbsAg阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含BSA缓冲液），浓缩洗涤液（PBS-T 缓冲液），底物A（含H2O2），底物B（含TMB），终止液（含H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。
试剂储存条件及有效期：2~8℃避光保存，有效12个月。3样本采集：
取静脉血3-4ml于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于4℃冰箱保存，如长期保存需置于-15至-20℃冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。
4所需仪器
全自动酶免分析仪
新鲜蒸馏水或去离子水
酶标仪（单波长450nm或双波长450nm/630nm）
微量移液器
37℃恒温箱或水浴箱
洗板机或洗瓶
5检验方法
平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温
（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。
乙肝表面抗原ELISA检测程序
乙肝表面抗原ELISA检测程序
第一篇：乙肝表面抗原ELISA检测程序
乙型肝炎病毒表面抗原ELISA法检测程序
1检验目的及原理
1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen以及Schuurs进行描述的。在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。HBsAg在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。
本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。方法性能参数
2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验(1)敏感性：
样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。(2)特异性：
使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。
标本
3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。3.2血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。
乙肝表面抗原ELISA检测程序
乙型肝炎病毒表面抗原ELISA法检测程序
1检验目的及原理
1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。
1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验
用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen 以及Schuurs进行描述的。在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。HBsAg 在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。
本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。
2 方法性能参数
2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验
(1)敏感性：
样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。
(2)特异性：
使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。
3 标本
3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。
乙肝六项操作及检验结果的解释
•
样品OD值S/C.O<1者为HBsAg阴性
乙肝六项操作
HBeAb检测（ELISA)竞争法
一.试剂准备同上
二.HBeAb操作 加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各50l于相应孔中。 加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50l，轻轻混匀。 温育：置37℃温育30分钟，室温平衡5分钟。 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。 显色：每孔加入底物A、B各50l，轻拍混匀，置37℃暗处15分钟。 终止：每孔加终止液50l，混匀。
乙肝六项操作
HBCAb-lgM(捕获法）
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操作步骤 1.待测样品用生理盐水作1:1000稀释，每孔加人稀释样品100微升，设阴、阳性 对照各2孔，每孔加人阴性对照(或阳性对照) 各100微升(或2滴)，并设空白对照1 孔，封板，置37 ℃孵育20分钟。 2..手工洗板:弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复3次后拍 干。 洗板机洗板：选择洗涤3次程序洗板后拍干。 3.每孔加入HBcAg30微升(或1滴)，酶结合物50微升(或1滴)(空白对照孔除外)， 充分混匀，封板，置37℃孵育20分钟 4..手工洗板:弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍 干。 洗板机洗板:选择洗涤5次程序洗板后拍干。 5..每孔加显色剂A液，显色剂B液各50微升(或l滴) 充分混匀，封板，置37 `℃孵 育10分钟。 6.每孔加人终止液50微升(或1滴)，混匀。 7.用酶标仪读数，取波长450nm(建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长 630nm )，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。 记录结果）。
乙肝表面抗原检测
乙肝表面抗原检测
1、定性检测---酶联免疫法
HBV感染后可出现HBsAg和抗HBs同时阴性，即所谓窗口期，
此时HBsAg已消失，抗HBs仍未产生，少部分病例始终不产生抗HBs。
HBsAg和抗HBs同时阳性可出现在HBV感染
恢复期，此时HBsAg未消失，抗HBs已产生；
另一情形是S基因区发生变异，野生株抗HBs
不能将其清除；或抗HBs阳性者感染了免疫逃避株
窗口期的抗原抗体的量低于ELISA检测下限，无法检测出来。
美国雅培I-2000全自动免疫发光分析仪，取代传统的ELISA法，实现了乙肝病毒血清标志物的定量检测。该仪器采用微粒子化学发光检测技术，以顺磁性微珠作为包被载体，吖啶酯作为发光剂标记抗体，在过氧化阴离子的作用下，吖啶酯由激发态回到基态时发出光子，信号被光量子阅读系统接受并转换为待测抗原的浓度。该技术具有定量跟踪分析、高灵敏度、高特异性及检测快速的优点，可及时准确地提供实时、动态的检测结果，有效地指导药物治疗。
传统的ELISA法只能通过显色得到阴、阳性结果，而乙肝的治疗过程具有复杂的多阶段性和动态性，仅凭阴、阳性来判定结果无法给临床提供丰富有效的信息。微粒子发光技术的引进克服了这个缺点，能对五项检测指标进行定量和动态分析。同时，高灵敏度雅培试剂的采用也大大降低了低水平感染者漏检的可能性。近十几年来，由于抗病毒药物、乙肝免疫球蛋白及乙肝疫苗的使用导致病毒核酸出现突变，产生了HBV突变株，它们可以逃过宿主的免疫防御，导致检测和治疗上的失败。以往国产ELISA试剂采用单一单克隆抗体，缺乏对突变株的检测能力，而雅培HBsAg试剂采用的抗体是针对一些受突变影响最小、又具有恒定高亲和力抗原决定部位的多种单克隆抗体，能有效地识别各种逃逸变异株，也避免了可能出现的漏诊。此外，乙肝表面抗体的定量检测为被乙肝病毒感染后或接种乙肝疫苗后机体的免疫状况评估提供了一个客观标准，>10mIU/ml表明机体对病毒具有免疫力。
乙肝两对半操作规程
免疫室乙肝两对半操作规程
一、试验原理
“乙肝两对半”指乙型肝炎病毒表面抗原（HBSAg）、乙型肝炎病毒表面抗体（HBSAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）此五项指标，目前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测血清标志物，判断是否感染乙肝与粗估病毒复制水平初步检查。两对半中各项试验反应原理如下： 1、乙型肝炎病毒表面抗原检测：
采用ELISA“双抗体夹心法”原理，用抗-HBs包被板条，用HRP 标记抗-HBs为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。当标本中存在HBSAg时，该表面抗原与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBSAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBSAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBSAg。
2、乙型肝炎病毒表面抗体检测：
采用ELISA“双抗原夹心法”检测人血清或血浆中的抗-HBS,采用HBSAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBSAg-HRP进行孵育。当标本中存在抗-HBS时，该抗体与包被的HBSAg结合并与酶结合物形成HBSAg-抗-HBS-HBSAg-HRP复合物，洗去游离反应物，加入显色剂，将有明显颜色变化；当标本中没有抗-HBS时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化。
3、乙型肝炎病毒e抗原检测：
采用ELISA“双抗体夹心法”检测，用单抗-HBe包被板条，用HRP标记抗-HBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。当标本中存在HBeAg时，该HBeAg与包被抗-HBe结合并与抗-HBe-HRP结合形成抗-HBe-HBeAg-抗-HBe-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBeAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBeAg。
乙肝两对半操作规程
免疫室乙肝两对半操作规程
一、试验原理
“乙肝两对半”指乙型肝炎病毒表面抗原（HBSAg）、乙型肝炎病毒表面抗体（HBSAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）此五项指标，目前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测血清标志物，判断是否感染乙肝与粗估病毒复制水平初步检查。两对半中各项试验反应原理如下： 1、乙型肝炎病毒表面抗原检测：
采用ELISA“双抗体夹心法”原理，用抗-HBs包被板条，用HRP 标记抗-HBs为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。当标本中存在HBSAg时，该表面抗原与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBSAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBSAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBSAg。
2、乙型肝炎病毒表面抗体检测：
采用ELISA“双抗原夹心法”检测人血清或血浆中的抗-HBS,采用HBSAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBSAg-HRP进行孵育。当标本中存在抗-HBS时，该抗体与包被的HBSAg结合并与酶结合物形成HBSAg-抗-HBS-HBSAg-HRP复合物，洗去游离反应物，加入显色剂，将有明显颜色变化；当标本中没有抗-HBS时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化。
3、乙型肝炎病毒e抗原检测：
采用ELISA“双抗体夹心法”检测，用单抗-HBe包被板条，用HRP标记抗-HBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底物。当标本中存在HBeAg时，该HBeAg与包被抗-HBe结合并与抗-HBe-HRP结合形成抗-HBe-HBeAg-抗-HBe-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的，提示有HBeAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBeAg。
乙肝抗原筛查操作方法
乙肝抗原筛查操作方法
乙肝抗原筛查是一种常见的临床检测方法，用于检测个体是否感染了乙型肝炎病毒（HBV）。乙肝抗原筛查主要是通过检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的存在与否来确定个体是否感染了乙型肝炎病毒。下面将详细介绍乙肝抗原筛查的操作步骤以及相关注意事项。
1. 样本采集：首先，需要采集被检测者的血液样本。常用的样本采集方法是静脉采血，在采集样本前应先做相关消毒处理，以避免交叉感染。
2. 样本处理：采集到的血液样本需要进行相关处理才能进行乙肝抗原筛查。一般常用的方法是将血液样本离心分离，得到澄清的血清样本。
3. 抗原检测：离心分离得到的澄清血清样本即可进行乙肝抗原的检测。常用的检测方法包括酶免疫分析法（ELISA）和荧光定量PCR法（qPCR）等。ELISA 法是一种广泛应用的方法，可以通过特异性抗体与乙肝抗原结合来进行定性、定量的检测。
4. 结果解读：对于乙肝抗原的检测结果，一般分为阳性和阴性两种。阳性表示被检测者感染了乙型肝炎病毒，阴性表示未感染。需要注意的是，乙肝抗原筛查只能初步判断被检测者是否感染了乙肝病毒，不能确定感染的时间或潜伏期长短。
除了乙肝抗原筛查，还有其他相关的检测方法可供选择。例如，可进行乙肝表面
抗体（HBsAb）的检测，用于判断个体是否处于乙肝病毒感染后的康复期或曾经接种过乙肝疫苗；还可以进行乙肝e抗原（HBeAg）的检测，用于判断被检测者是否为乙肝病毒的携带者，或乙肝病毒感染的活动性程度。
在进行乙肝抗原筛查时，还需注意以下事项：
1. 严格按照操作规范进行操作，避免污染和误差。
实验五：ELISA法检查乙肝表面抗原(HBsAg)
加入酶标抗体， 加入底物，
温育
显色
终止反应，底物显色深浅与待检抗原 量成正比。
利用已知浓度的抗原制成标准品，稀 释为梯度浓度，对其最终OD值与浓 度作标准曲线，那么样品的浓度可以 根据最终的OD值在标准曲线上查出。
实验内容：
双抗体夹心法测定乙肝表面抗原 （HBsAg）——定性定量检测
实验目的
实验五：ELISA法检测乙肝表面 抗原（HBsAg）
主讲人：季煜华 2014年11月
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性 同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过 检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP
• 1、掌握ELISA（双抗体夹心法）的原理 • 2、熟悉ELISA实验操作方法，并了解其应
用
实验材料
HBsAg酶联免疫分析试剂盒 HBsAg阳性品，阴性对照品 移液枪，枪头 湿盒 酶标板，酶标仪 一次性手套 记号笔 计时器
实验步骤
结果判定
•定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用 “阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作 一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。 根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不 稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者 为阳性，N为阴性对照孔。
乙型肝炎病毒表面抗原测定(绝对定量)标准操作规程
乙型肝炎病毒表面抗原测定(绝对定量)标准操作规程1 检验申请
单独检验项目申请：乙型肝炎病毒表面抗原测定(HBsAg II quant)；
组合项目申请：乙肝病毒项目组合。临床医生根据乙肝患者抗病毒疗效监测需要提出检验申请。
2 标本采集与处理
2.1标本采集
2.1.1常规静脉采血约2ml，置含分离胶的真空采血管（黄盖管）。
2.1.2采用电子检验申请单，血标本试管粘贴附患者信息的条形码。
2.1.3标本采集后，通过LIS及标本条形码管理系统记录标本采集时间。
2.1.4标本采集后及时运送至实验诊断中心。由标本处理中心负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。
2.1.5不合格标本
2.1.5.1标本量不足：少于0.3ml的全血标本，或少于0.1ml的血清或血浆。
2.1.5.2无法确认标本与申请单对应关系的。
2.1.5.3其他如标识涂改、标本试管破裂等。
注：严重溶血或脂浊的标本,应在检验报告中标注标本状况，并建议复查；并在工作日志中记录。
2.2标本保存
2.2.1接收标本后在30min内将标本离心分离出血清。
2.2.2标本保存时间：室温（20℃～25℃）下可稳定一周，普通冰箱中（2℃～8℃）7天，-20℃3个月。样本可以冻存5次。为避免标本中水分挥发使血清浓缩，对保存时间超过1d的标本均加塞密闭或覆盖湿巾。
2.2.3已完成测试的标本保持完整的识别号，置2℃～8℃冰箱内保存7d。
2.3标本采集注意事项
2.3.1采血前使受检者保持平静、松弛状态。
2.3.2不建议采集抗凝血标本，如果必须使用血浆，推荐的抗凝剂是肝素。
实验五ELISA法检查乙肝表面抗原
实验五ELISA法检查乙肝表面抗原
一、实验原理
ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种酶联免疫法，它利用可见的酶促
反应（如酶标）来测定或检测特殊的抗原或抗体，也称为酶标免疫分析（ELISA）。它的作用是，通过特定抗原与特殊抗体之间的特异性结合，
使反应剂（受体物质）发生可见的改变，以此来测定定量或定性的被测物
质（抗原或抗体）是否存在。
ELISA法是用来检测乙肝表面抗原（HBsAg）的一种快速简易的方法。首先，将患者血清在微孔板上预先唾液，然后在微孔板上涂上特异性抗原
抗体，抗体和抗原结合形成复合体，最后将这种复合体添加进反应液中，
在其中一种特殊条件下，复合体中的受体物质会发生反应，此时可见的酶
标反应就出现了，检测结果就可以出现了。
二、实验步骤
1、准备实验样本和实验设备：患者血清样本，抗体，反应液，微孔板，洗涤盒，细胞培养室，实验酶标板和其他实验用品等。
2、抗原抗体涂覆：将患者血清在微孔板上唾液，然后用特异性抗体
对抗原抗体进行涂覆，并将抗体抗原复合体形成复合体。
3、反应液加入：将复合体加入反应液中，并在恒温水浴箱中反应，
使受体物质发生反应，产生可见酶标反应。
4、检测并判断结果：检测
乙肝表面抗原试剂条操作说明书
乙肝表面抗原
试剂条操作说明书
Serum one step HBsAg test
! 快速一步法定性检测人体血清或血浆中的HBsAg
! 供专业人员体外诊断检测使用
[用途范围]：
-----乙肝表面抗原（HBsAg）胶体金法检测试剂条应用快速免疫层析技术，以定性的方式测定血清或血浆中的乙肝表面抗原，作为诊断乙肝病毒携带情况的辅助手段。
[总论]：
滤过性病毒引起一系列的肝炎疾病。常见的有甲肝、乙肝和丙肝。在HBV病毒表面发现的复合抗原叫乙肝表面抗原（HBsAg），以前又叫澳大利亚抗原。血清或血浆中的乙肝表抗（HBsAg）存在表明被检测个体感染HB活病毒，表现为急性或慢性病征。典型的HBV感染过程中，在ALT水平异常之前2~3周，或病征、黄疸出现之前的3~5周，都能检测到乙肝表抗（HBsAg）的存在。乙肝表抗目前发现主要有4种亚型：ADW，AYW，ADR和AYR；10种血清型。
——本公司生产的乙肝表面抗原（HBsAg）胶体金法检测试剂条以定性的方法快速检测血清或血浆标本中的乙肝表面抗原，灵敏度为2ng/ml。
[测定原理]：
——HBsAg胶体金法检测试剂条采用两点夹心固相免疫层析法定性检测血清或血浆中的HBsAg。在试剂条的检测区包被有抗HbsAg单克隆或多克隆抗体，质控区包被有抗鼠IgG抗体。
检测时，血清或血浆中的HBsAg与试剂条上事先包被的胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体结合成结合物，该
结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区，与膜上
的抗HBsAg抗体起反应，出现一条红色条带。无论标本
中是否存在HBsAg，当液面继续迁移至固定羊抗鼠IgG
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乙型肝炎病毒表面抗原检测（ELISA）
1原理：
在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HbsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。2试剂：
2.1试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）
2.2试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司
2.3包装规格：96Test/Kit
2.4试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被HbsAb），HbsAg 酶标抗体（含HRP标记HbsAb）, HbsAg阳性对照（含基因工程HbsAg），HbsAg阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含BSA缓冲液），浓缩洗涤液（PBS-T缓冲液），底物A（含H2O2），底物B（含TMB），终止液（含H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。
2.5试剂储存条件及有效期：2~8℃避光保存，有效12个月。
3样本采集：
取静脉血3-4ml于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于4℃冰箱保存，如长期保存需置于-15至-20℃冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。
4所需仪器
4.1全自动酶免分析仪
4.2新鲜蒸馏水或去离子水
4.3酶标仪（单波长450nm或双波长450nm/630nm）
4.4微量移液器
4.5 37℃恒温箱或水浴箱
4.6洗板机或洗瓶
5检验方法
5.1平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。
5.2配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。
5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。
5.4稀释：每孔加入20ul样品稀释液。
5.5加样：分别在相应孔中加入100ul阴、阳性对照血清或待测样本。
5.6温育：置37℃温育60min。
5.7加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul。
5.8温育：置37℃温育30min。
5.9洗涤：用洗涤液充分洗涤5次、洗涤后扣干（每次应保持30~60s的浸泡时间）。
5.10显色：每孔加入底物A、B各50ul，轻拍混匀，37℃暗置30min。
5.11终止：每孔加入终止液50ul，混匀。
5.12测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm
测定各孔OD值（用单波长测定时，需用空白对照调零），并记录结果。
6结果判定与分析
临界值（C.O.）的计算：临界值=阴性对照孔OD平均值*2.1；阴性对照OD均值小于0.05时以0.05计算。
结果判定：样本OD值S/C.O.>=1者为HbsAg阳性
样本OD值S/C.O.<1者为HbsAg阴性
阴性对照均值>0.1或阳性对照均值<0.4时，实验无效，应重新试验。
7质量控制
每次试验用HBsAg的质控血清同步检测，S/CO值应在控制范围内；如失控，检查试剂校期、储藏温度、试验温度是否正常、操作步骤是否正确，直至从新试验使其在控。
8参考范围阴性
9临床意义
在血清或血浆中HbsAg的存在表明有急性乙肝或慢性乙肝或为无症状携带者。
10操作性能灵敏度为ng/ml，特异性高
11方法的局限性
11.1此方法仅适用于个体的血清或血浆样本的检测，不适合与混合血清或血浆样本及其他体液样本。
11.2该方法仅作为定性检测乙型肝炎病毒表面抗原。
11.3试剂盒中的阳性对照不能作为灵敏度的考核指标，阳性对照仅用于按照说明书步骤操作时，验证试剂盒中的组分
是否有效。
11.4由于方法学的局限性，本实验结果仅作为判断疾病的一项依据，如需对患者进行确诊，建议施于其它检验手段予以确认。
12注意事项
12.1试验前请详细阅读试剂说明书，任何违反试剂说明书的使用或操作行为，都可能得到不准确的结果。
12.2所有样本、试剂和各种废弃物应按传染物处理，严格防止交叉感染，严格健全和执行消毒隔离制度。对于含有传染病和怀疑含有传染源的物质，应有合适的生物安全保证制度，下列为有关注意事项，但不仅限于此：
1）戴手套处理样本和试剂；
2）不要用嘴吸样；
3）不可在处理这些物品时吸烟、进食、喝饮料、美容和处理隐形眼镜等；
4）用消毒剂对溅出的样本和试剂进行消毒；
5）按科室有关条列来消毒和处理所有样本、试剂和潜在的污染物。
12.3加试剂前应先将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。建议使用加液器进行加液，并经常对加液器进行校准。加液时注意勿使加液枪头接触孔内液体，避免液体间相互污染。仔细操作，避免加样时在孔中产生气泡。
12.4每板设阴、阳性对照各两孔，设空白对照1孔，空白对照不加样本和酶标抗体、其余各步相同。
12.5避免在孵育和保存过程中试剂被阳光暴晒和接触次氯酸等强氧化性物质。
12.6孵育温度要保持在37℃+-1℃，温度过高或者过低可能会影响检测结果的准确性。
12.7封模板为一次性使用，重复使用可能导致污染。
12.8洗板机在使用结束后要使用新鲜蒸馏水或高品质去离子水冲洗干净，以防止管路堵塞和腐蚀。洗涤时各孔军需加满但不溢出，防止孔内有残留物未能洗净。
12.9每次洗涤结束请尽早进行后续加液操作，避免长时间暴露而引起错误结果。
12.10使用全自动生化仪器时，封板和洗版后扣干步骤可以省略。但需要注意保证洗涤液的加液量，保证洗涤后将微孔板孔中的洗液充分吸干，以免对实验造成错误的结果。
12.11确保反应孔板的底清洁干燥，在读板前要确保孔中液体没有气泡。
12.12终止后尽早用酶标仪进行读数测量（建议在10min 内完成读值），避免放置过长时间而引起的错误结果。
12.13检测结果用酶标仪进行读数测量。样本的检测读数与样本中抗原的浓度不一定呈正相关。
12.14检测结果呈阴性的样本，不能绝对保证样本中没有低浓度抗原的存在，不能完全排除HBV感染的可能。
12.15该免疫测试不能绝对排除非特异性反应的存在，如对检测结果有疑问，用相应的确认试剂或方法对检测样本进行结果确认。