反义核酸与核酶
核酶和核酸酶的区别
核酶和核酸酶的区别关于《核酶和核酸酶的区别》，是我们特意为大家整理的，希望对大家有所帮助。
在生活起居之中，经常会出现很是相近的东西，外形看起来类似，但确是迥然不同的东西，这一在中草药材中非常的显著，有很多的绿色植物看起来就很是相近，但有一些能看病而有的确是反过来，拥有一定的毒副作用，而这一状况也是适用我们今日说起的核酶和核酸酶，这二者的区别表层上来看仅仅多了一个字，但实际上这在其中的区别变大来到，下边就而言说核酶和核酸酶的差别。
核酶是有催化剂的活性的RNA, 即有机化学实质是RNA,却具备酶的催化反应作用。
核酶的功能很包含激光切割RNA、激光切割DNA,、联接RNA、磷酸酶特异性等。
与蛋白酶对比，核酶的催化反应高效率较低，是一种比较初始的催化反应酶。
核酶生物降解特异的mRNA编码序列。
核酶别称核苷酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。
它的发觉摆脱了酶是蛋白的旧思想。
有一些RNA分子结构一样具备催化反应作用。
核酶的实际功效关键有：1. 多肽链迁移功效。
2. 水解反应，即磷酸二酯酶功效。
3. 硫酸铵迁移反映，相近硫酸铵转移酶功效。
4. 脱硫酸铵功效，即酸性磷酸酶功效。
5. RNA内切反映，即RNA约束性内切酶功效。
而核酸酶包含核酸外切酶和核苷酸内切酶、核苷酸连接酶，不一样来源于的核酸酶，其专一性、功效方法都各有不同。
一些核酸酶只有功效于RNA，称之为核糖核酸酶(RNase)，一些核酸酶只有功效于DNA，称之为Dna酶(DNase)，一些核酸酶专一性较低，既能功效于RNA也可以功效于DNA，因而通称为核酸酶(nuclease)。
依据核酸酶功效的部位不一样，又可将核酸酶分成核酸外切酶(exonuclease)和核苷酸内切酶(endonuclease)。
关键功效于DNA 和RNA，具有联接、激光切割DNA或RNA中碱基序列的功效，其实质一般为蛋白。
因而，核酶和核酸酶的关键差别便是核酸酶为蛋白成份，可降解性核苷酸，而核酶成份为RNA，具有很弱的核酸酶特异性。
生物化学与分子生物学重点
生物化学与分子生物学重点一、名词解释基因：基因是基因组中的一个功能性遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或rna序列信息及表达这些信息所需的全部核苷酸序列。
基因组：基因组是一个细胞或一种生物体的整套遗传信息。
质粒：是指细菌细胞染色体意外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。
蛋白质组：是指一种基因所表达的全套蛋白，既包括一个细胞或一个组织或一个机体的基因所表达的全部蛋白质。
DNA重组：是指不同来源的DNA通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程。
限制性内切酶：是指能识别和水解双链DNA分子的内特异序列的核酸水解酶。
载体：是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩曾和表达的运载工具，常用的载体有:质粒载体、噬菌体载体，病毒载体和人工染色体等。
核酸分子杂交：单链的核酸分子在适合的条件下，与具有碱基互补序列的异核酸形成双链杂交的过程。
杂交：将一种核酸单链标记成探针，再与另一核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构的过程，PCR：是一个在体外特异的复制一段已知序列的DNA片段的过程，这项技术使人们能够人们很快的从试管中获得大量拷贝的特异核酸片段。
分子生物学检验：从基因水平上解释疾病发生机制，明确疾病诊断，跟踪疾病过程，指导个体化治疗的先进技术手段。
反义核酸：是用人工合成的15-25个核苷酸片段，通过碱基互补配对选择与特定的RNA或DNA互补结合，从而能专一性的抑制基因的转录与翻译。
核酶：是一类具有酶的特异性催化功能的RNA分子，能序列特异性地剪切底物RNA或修复突变的RNA。
致病基因：能导致遗传病或遗传病发生相关的基因。
地中海贫血：也称球蛋白生成障碍性贫血。
是由于球蛋合成速率降低，引起a链和非a链缺乏称为球蛋白生成障碍性贫血。
血友病：由于基因缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或确实造成的一种疾病。
转座因子：一类在细菌染色体，质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立DNA序列。
核酶的发现与应用
姓名：乔艳红学号：**********年级：2010级班级：一班学院：生命科学学院时间：2011年11月9日核酶的发现与应用一、核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同的功能。
核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应用前景。
二、核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
U pA G pU 5'3'5'外显子3'外显子内含子三、核酶的分类剪接型（ splicing ）核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
生物化学简答题必背分享-8
⽣物化学简答题必背分享-81、细胞内的核酸酶有哪⼏种?各有何特点?2、反义核酸是什么，反义核酸的特点，反义核酸的优点。
3、如何看待RNA功能的多样性?其核⼼作⽤是什么?4、酶作为⽣物催化剂与⼀般催化剂的共性及特性。
5、为什么酶在疏⽔环境中有利于催化作⽤。
6、抑制剂的类型图⽚答案解析1、细胞内的核酸酶有哪⼏种?各有何特点?【答案解析】：核酸酶是指所有可以⽔解核酸的酶，在细胞内催化核酸的降解，以维持核酸(尤其是RNA)的⽔平与细胞功能相适应。
按照底物不同，核酸酶可以分为DNA酶和RNA酶。
脱氧核酶是具有催化功能的DNA分⼦，⼀般通过体外筛选得到。
核酶是有催化功能的RNA分⼦，可催化RNA的切割和剪接。
作⽤特点是切割效率低，易被RNase破坏﹔催化的反应包括RNA的转核苷酸反应、⽔解反应和连接反应（聚合酶活性）依据对底物的作⽤⽅式可分为核酸外切酶和核酸内切酶。
核酸外切酶仅⽔解位于核酸分⼦链末端的磷酸⼆酯键，根据其作⽤的⽅向⼜有5'→3'核酸外切酶和3'-→5'核酸外切酶;核酸内切酶作⽤于链的内部。
其中:部分具有严格的序列依赖性，被称为限制性内切酶。
核酸酶在DNA重组技术中是不可缺少的重要⼯具，尤其是限制性核酸内切酶的应⽤更是所有基因⼈⼯改造的基础。
2、反义核酸是什么，反义核酸的特点，反义核酸的优点。
【答案解析】：反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分⼦。
利⽤反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术反义RNA是指能和mRNA完全互补的⼀段⼩分⼦RNA或寡聚核苷酸⽚段，反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短⼩DNA分⼦。
反义RNA和反义DNA主要是通过mRNA的翻译和基因DNA的转录⽽发挥作⽤:1）抑制翻译。
反义核酸⼀⽅⾯通过与靶mRNA结合形成空间位阻效应，阻⽌核糖体与mRNA结合，另⼀⽅⾯其与mRNA结合后激活内源性RNase或核酶，降解mRNA;2）抑制转录。
艾滋病最新治疗研究论文
专业：************ 姓名：****学号：**********艾滋病最新治疗研究2012年5月2日艾滋病治疗研究自1970年人类出现首例爱滋病感染以来，艾滋病以惊人的速度在全球蔓延传播，人类正受到艾滋病病毒的严峻挑战，对人类构成了严重的威胁。
但是，科学家自始至终从没有放弃对艾滋病治疗的研究，并通过各种方法和手段找出治疗爱滋病的有效途径，我相信在不久的将来，人类必将战胜这个“世纪之病”。
一、基因治疗基因治疗是将抗病毒基因导入患者的细胞内，赋予患者新的抗病机能，它包括目的基因的选择与克隆、载体的构建与包装及受体的选择与转入等。
（1）抗HIV基因现研究最多的抗-HIV基因是反义核酸和核酶，其中反义核酸反义核酸是互补于mRNA的RNA或DNA，在细胞内形成部分双链，阻碍mRNA的剪接、运送和翻译，降低mRNA的稳定性，从而影响基因的构成。
有一些科学家做了相关抑制HIV实验，但由于受调控水平的限制或者由于反义RNA量的不足，而导致失败，但现最需解决的问题是反义核酸的专一性和进入靶细胞之前的降解。
核酶是一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列。
它最初由Haseloff在研究烟草病毒时发现的，迄今，人们发现的核酶有六种类型，但从结构上看主要分为" 两大类：锤头状核酶和发夹状核酶。
核酶的优点是序列特异性；不编码蛋白质，无免疫原性；可以重复使用。
使其在基因治疗领域中倍受青睐，其研究进展也相当迅速。
但核酶的稳定性较低，生理条件下反应速度缓慢是其用于抗-HIV的不足之处，同时对它在机体内是怎样被转录的和转录后抗RNase的能力还需做进一步的探索。
（2）基因疫苗与传统疫苗相比，DNA疫苗具有制备简单、可塑性大、生产工艺简单、成本低等优点。
但其最大的优点在于疫苗抗原可以在人体靶细胞内天然表达。
科学家曾经用人猿做过试验，方法是肌内接种100μg质粒pm160,产生了高滴度的抗体，该抗体在体外能中和HIV-1的感染。
第16章 反义核酸类药物
第一个反义药物——福米韦生
5 适应证和禁忌证
福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效 果或有禁忌的病人；禁用于2～4周内使用西多福韦（cidofovir）治疗 的病人，以免增加发生眼内炎的危险性 6 与治疗CMV视网膜炎的其他药物比较
更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是CMV抑制剂，而非杀死剂；具有交 叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术 以及视网膜剥脱发生率高（28%）使应用受限 福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而 轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法
硫代磷酸化修饰
主要用于治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎
第一个反义药物——福米韦生
1 药ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ学
1.1 抗病毒作用机制
主要依赖于反义作用，福米韦生与CMV mRNA特异序列互补结合， 被RNA酶H识别，并使mRNA水解失活
抑制CMV进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用
反义核酸技术（antisense nucleic acids technology) 是根据
核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的
一类核酸研究新技术 包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA) 、核酶(Rz)
反义核酸的基本原理
绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构
ASGP-PL-反义RNA复合物 → 肝细胞表面ASGP受体识别→ 吞噬 → 释放 → 发挥作用
优点：专一性强，抗降解能力强
核酶的种类
核酶的种类核酶是一类具有催化作用的酶，催化核酸的降解、合成和修复等生物学过程。
核酶根据其功能和参与的生物学过程可以分为多个不同的类别。
1. 核酸酶：催化核酸的降解过程。
核酸酶根据降解的对象可以分为核糖核酸酶（RNA酶）和脱氧核糖核酸酶（DNA酶）。
其中，核糖核酸酶包括核糖核酸内切酶、外切酶（例如RNase A、RNase H等），核糖核酸外切酶（例如RNase III）等。
DNA酶包括脱氧核糖核酸内切酶、外切酶（例如DNase I、DNase II等）等。
2.核酸合成酶：催化核酸的合成过程。
核酸合成酶包括核糖核酸合成酶和脱氧核糖核酸合成酶。
核糖核酸合成酶包括RNA聚合酶（例如RNA聚合酶I、II、III等），它们分别负责合成rRNA、mRNA和tRNA。
脱氧核糖核酸合成酶包括DNA聚合酶和逆转录酶。
DNA聚合酶负责DNA的复制，逆转录酶参与病毒的复制过程。
3.核酸修复酶：修复DNA的损伤。
核酸修复酶可以修复DNA中的碱基损伤、单链断裂和双链断裂等各种损伤类型。
例如，碱基切除修复酶（例如DNA鸟嘌呤二聚物酶，DNA链切修复酶等）能够修复DNA中的氧化损伤和损害碱基。
4.核酸修饰酶：对DNA和RNA进行化学修饰。
核酸修饰酶能够通过对DNA和RNA特定位点的甲基化、磷酸化等修饰，调控基因的表达，维持细胞的正常功能。
例如，DNA甲基转移酶能够将甲基基团添加到DNA分子上，从而调控DNA的螺旋结构和转录过程。
5.核酸结合酶：结合到DNA或RNA分子上发挥功能。
核酸结合酶能够与DNA或RNA特定序列相结合，参与调控转录、翻译等生物学过程。
例如，转录因子是一类能够结合到DNA上特定顺反相序列的蛋白质，调控基因的转录过程。
总的来说，核酶是一类功能丰富的酶，根据其功能和参与的生物学过程的不同，可以分为核酸酶、核酸合成酶、核酸修复酶、核酸修饰酶、核酸结合酶以及其他特殊功能的核酶等多个不同的类别。
这些核酶在维持细胞正常功能和基因表达调控中发挥着关键作用。
Morpholino反义核酸合成服务
Morpholino 反義核酸合成服務Morpholino 的應用與特點過去在使用反義 (antisense) 抑制實驗來探討基因功能時，常因為反義核酸的不穩定、專一性差或效率低等問題，而造成實驗的限制。
美國 Gene Tools 公司獨家推出的 Morpholino Oligo，將可解決這些困擾研究人員以久的缺陷，讓您的實驗更加簡便而精確。
Morpholino oligo 是將 6 碳環之 Morpholine 接上鹼基後，以非離子性的 phosphorodiamidate 連接而成(如下圖所示)。
相較於過去在反義抑制實驗中常用的 Phosphorothioate 及 PNA，Morpholino 能有更好之效率及專一性；較簡便的使用方式而且較為便宜。
Morpholino Oligos 特點可穩定存留於細胞內較長的時間可避免產生出具毒性的裂解物質。
穩定性高(具核酸水解酵素 (nuclease) 抵抗性)效率高即使作用濃度僅有 nanoMolar，也能有優越的抑制效果。
不須 RNase H可避免 RNase H 對與目標 RNA 相似的非目標 RNA 產生裂解作用。
序列專一性高其專一性為 Phosphorothioate 的 100 倍，即使在高濃度狀況下使用也不會降低其專一性。
對目標 RNA 結合能力好可侵入目標 RNA 的二級結構，達到穩定結合的目的。
在細胞質及細胞核內皆有活性可增加 Morpholino oligo 作用的機會。
在無細胞系統及細胞內皆適用Morpholino oligo 在有、無細胞之系統下，皆有良好之反義活性。
不受血清影響不會與血清中之白蛋白 (albumin) 結合而降低其活性。
溶解度好溶解度可高達100 mg/mL，且在保存過程中不易有沉澱發生。
Oligo 長度最長最長可提供至 25 mer 的Morpholino oligo (為目前市售最長的)。
即使長度增加至 25 mer，仍能保有高專一性。
反义核酸技术研究的进展
第24卷 第2期 中 国 预 防 兽 医 学 报 Vol.24, No.2 2002年3月 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Mar. 2002反义核酸技术的研究进展张德勇,周继勇,陈吉刚(浙江大学动物预防医学研究所,浙江杭州310029)摘要:反义核酸技术具有高特异性、无毒性等特有的优点,近年来一直是抗肿瘤、抗病毒领域研究的热点。
本文综述了反义核酸技术的基本原理及其在抗病毒、抗肿瘤、细胞凋亡、信号机制等方面的研究进展。
关键词:反义核酸; 抗病毒; 抗肿瘤中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1008-0589(2002)02-0158-04 反义核酸是指与靶DNA或RNA碱基互补,并能与之结合的一段DNA或RNA。
反义核酸技术是指利用反义核酸特异地抑制某些基因的表达。
1967年,Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来特异性地抑制基因表达的设想。
1978年,Paul等利用一段反义DNA寡聚核苷酸链成功地抑制了劳斯(R ous)肉瘤病毒的复制,引起人们极大的关注。
20世纪80年代,寡核苷酸人工合成技术的成功,反义核酸的研究快速发展起来,使反义技术在抗肿瘤、抗病毒以及细胞凋亡机理、信号传递机制等方面取得了一定的进展。
反义核酸技术在发展过程还存在种种困难,但可以相信反义技术必将成为人类研究和治疗病毒病、肿瘤乃至各生物医学领域的一项不可或缺的手段。
1 反义核酸的作用机理111 反义抑制机理 目前普遍认为反义核酸可以在复制、转录、表达3个水平上发挥作用。
其机制为:(1)在细胞核内以碱基配对原理与基因组DNA结合,从复制与转录水平发挥反义阻止作用,这种反义技术称为“反基因治疗”(Anti-gene therapy);(2)与mRNA的5’末端的S D(Shine-Dalgarno)序列或核糖体结合位点结合,阻碍核糖体的结合,从而阻碍翻译,或使反义RNA与mRNA形成双链,以被水解酶水解;(3)与mR2 NA的S D序列上游的非编码区结合,改变mRNA的二级结构,从而阻碍核糖体的结合;(4)与mRNA的5’末端编码区(主要是起始密码AUG)结合,阻止RNA的翻译;(5)与引物结合,从而在复制水平上阻止基因表达;(6)结合到前体RNA 的外显子和内含子的连接区,阻止其剪切成熟;(7)作用于mRNA的poly A形成位点,阻止成熟和转运;(8)作用于mRNAR的5’末端,阻止帽子结构的形成;(9)由于带电性等 作者简介:张德勇(1978～),男,山东省聊城市人,浙江大学动物预防兽医在读硕士研究生,主要从事动物病毒学方面研究. 收稿日期:2001-03-28影响,非特异性地与某些蛋白结合,这往往是某些非特异性副作用的原因所在。
反义核酸药物剖析
二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄 - 环结构，
空间构象障碍迫使 RNA 聚合酶脱离 DNA 模板，停止转录。
3、在翻译水平上（主要调控形式）：
主要表现在三个方面： 1、一是与mRNA5’-端非编码区（包括Shine—Dalgarno， SD序列）序列结合，直接抑制翻译； 2、二是与mRNA 5’-端编码区，主要是起始密码AUG 结合，抑制翻译起始； 3、三是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构 象改变，影响它与核糖体的结合，间接抑制了mRNA的
导入方法
1、RNA病毒感染;
2、脂质体包裹反义寡核苷酸； 3、显微注射; 4、逆转录病毒; 5、腺病毒介导等方法。
此外 ,利用抗体、阳离子多肽、维生素等也可增加 as
ＯＮ到达靶细胞的能力。
四、 反义核酸类药物必需符合的条件
1、选择性(ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ)
目前,许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此, 只对其ｍＲＮＡ序列选择一个区段，设计所要合成的反
第2条途径------糖环修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′
连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别
磷酸二酯键。 α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。
1’位取代、2’位取代:
指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。
（2）骨架修饰
第1条途径-------磷的修饰:
磷原子是核酸酶的主要攻击位点 ,修饰后效果明显。 磷的修饰包括硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代 磷酸寡核苷酸 (phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN) 最为常用,称为“第一代反义药物”。
反义核酸技术
反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达,用来快速、有效地测定基因功能。
RNA 干扰技术天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内, 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋, 对基因功能起重要的调节作用。
RNA 干扰技术(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义RNA 与正链RNA 形成双链RNA ,特异性抑制靶基因轉录後表达这一原理,成为研究轉录後调控的有效工具, 广泛用于功能基因组学、基因治疗和轉录调控机制研究。
在这一技术中,早期使用双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂,核心技术是小分子干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成(哺乳动物通常选择21～23 bp dsRNA ,其他生物选择更长的片段) ,另外,还包括siRNA 的标记、轉染和RNAi 的检测。
然而,基因敲除实验显示RNAi 存在一定程度的非特异性。
分析认为,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功,部分是由于所使用的短链dsRNA 激活了胞内dsRNA 依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积。
新近两方面技术的发展使得RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 稳定表达的新的载体系统[21 ] ; (2) 利用人U6核内小RNA ( snRNA) 启动子进行单一RNA 轉录单位的核内表达[22 ] 。
即通过轉染dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约20 bp 的dsRNA ,後者通过RNA依赖的RNA 合成酶复制,并结合到核酸酶复合物上,形成RNA 诱导的轉录沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA。
反义核酸技术
反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达,用来快速、有效地测定基因功能。
RNA 干扰技术天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内, 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋, 对基因功能起重要的调节作用。
RNA 干扰技术(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义RNA 与正链RNA 形成双链RNA ,特异性抑制靶基因轉录後表达这一原理,成为研究轉录後调控的有效工具, 广泛用于功能基因组学、基因治疗和轉录调控机制研究。
在这一技术中,早期使用双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂,核心技术是小分子干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成(哺乳动物通常选择21～23 bp dsRNA ,其他生物选择更长的片段) ,另外,还包括siRNA 的标记、轉染和RNAi 的检测。
然而,基因敲除实验显示RNAi 存在一定程度的非特异性。
分析认为,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功,部分是由于所使用的短链dsRNA 激活了胞内dsRNA 依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积。
新近两方面技术的发展使得RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 稳定表达的新的载体系统[21 ] ; (2) 利用人U6核内小RNA ( snRNA) 启动子进行单一RNA 轉录单位的核内表达[22 ] 。
即通过轉染dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约20 bp 的dsRNA ,後者通过RNA依赖的RNA 合成酶复制,并结合到核酸酶复合物上,形成RNA 诱导的轉录沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
DNA
preRNA
AA…AA
RNA
Protein
反义RNA的获得途径
化学会成法：利用核酸合成仪直接合成反义RNA 体外转录法：利用带有噬菌体SP6或T7等启动子序列的质粒，
将特异基因的DNA片段反向插入其多克隆位点中，在RNA聚 合酶的作用下体外合成特异性反义RNA 细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止 子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病 毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在细胞中 稳定表达反义RNA
理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻 断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达
反义RNA的最初发现
反义RNA最先发现于原核细胞，是由Tomizarna在 1981年对质粒ColE1复制的研究过程中发现的
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同 源序列，与多种肿瘤发生发展有关
Saito等研究发现，c-myc基因有3个外显子，第一个外显子不 编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNA 与第二个外显子mRNA的碱基配对而抑制基因表达
在人Burkitt淋巴瘤中发现c-myc基因失去了第一个外显子， 从而使c-myc基因表达失控
由此可见，反义RNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因 之一
反义基因治疗
利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞 的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA 或阻断 翻译相应蛋白
DNA
DNA
RNA
RNA
反义RNA
阻断表达
反义技术的两种技术路线
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞 表达与目标基因互补的mRNA，从而阻断目标基因的表达
GENOMICS BASED DRUG DISCOVERY
ANTISENSE TECHNOLOGIES
MOLECULAR DIAGNOSTICS
DRUG DELIVERY SYSTEMS
GENE THERAPY
反义RNA的应用（一）
利用反义RNA的原癌基因失活疗法：
在DNA双链上被转录为RNA的链为正义链，与其相对应的链为 反义链
精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般7到30个核苷酸组 成，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内， 干扰特定基因表达
利用这一原理可以在基因位点、前体mRNA、 mRNA及蛋白水 平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡
某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA 以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的
反义DNA与靶基因结合形式
寡核苷酸与双股DNA结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活 转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性
寡核苷酸与mRNA杂交形成了核糖核苷酸酶H(RNase H)底物， 激活RNase H识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的mRNA
c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节
互补 RNA
c-myc
C-MYC
反义RNA的作用机制
作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接 反义RNA与DNA结合时能阻止转录因子与DNA的结合，从而阻
止特定基因的转录 互补于特定mRNA的非编码区，如SD序列或核糖体结合位点及
反义药物
主要内容
一、反义核酸与反义技术
反义核酸和反义技术概念 反义核酸的基本原理 反义核酸的种类
二、核酶技术及其应用 反义核酸与反义技术的应用
核酶概述 核酶与RNA修复 核酶技术在临床上的应用 核酶技术面临的问题
反义核酸和反义技术
反义核酸(antisense nucleic acid) 是一段与靶基因的某段序列 互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列 它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而 在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设 计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点
RNase H ASODN mRNA
TFO
反义寡聚核苷酸与 mRNA特异性结合， 阻断翻译过程
反义技术与反义核酸的应用
Relation of antisense technologies to other segments of biopharmaceutical industry
PHARMACEUTICALS
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进 入细胞，特异性地与目标mRNA作用
以第二种为主来介绍
反义核酸的种类
反义RNA：一类能与特异mRNA互补的小分子质量的、可扩散 的DNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异 地抑制靶基因表达
反义DNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNA或mRNA序 列互补结合，封闭靶基因表达（ASODN）
反义RNA的临床作用
抗病毒： 将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义RNA
表达载体 再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义
RNA 从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流
感病毒、人类免疫缺陷病毒） 抗肿瘤： 设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及
其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译 互补于特定mRNA的编码区，抑制翻译或激活RNase H使
mRNA易被核酸酶降解 作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子结构形成，影响mRNA的成
熟 作用于PoIy A形成位点，阻止靶mRNA成熟及向胞浆内的转运
反义RNA的作用机制
m7G5'ppp rRNA
反义核酸技术（antisense nucleic acids technology) 是根据 核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的 一类核酸研究新技术 包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA) 、核酶(Rz)
反义核酸的基本原理
绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构