04生物工艺学第四章生物工艺过程中的无菌技术

共39页 第7页
目录
4.2.3 射线灭菌
• 射线灭菌是利用紫外线、高能电磁波或放射性
物质产生的高能粒子进行灭菌的方法，其中以 紫外线最常用。其杀菌作用主要是因为导致 DNA 胸腺嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧 啶水合物，抑制 DNA 正常复制。此外，空气
在紫外线辐射下产生的臭氧有一定杀菌作用。
共39页 第8页
共39页 第9页
目录
4.2.5 过滤除菌
过滤除菌是利用过滤法阻留微生物以达到 除菌的目的。此法仅适用于不耐高温的液体培养
基组分和空气的过滤除菌。工业上常用过滤法大
量制备无菌空气，供好氧微生物的液体深层发酵 使用。
共39页 第10页
目录
4.3培养基灭菌
4.3.1 湿热灭菌原理 4.3.2 分批灭菌 4.3.3 连续灭菌
培养基成分
共39页 第17页
目录
4.3.2 分批灭菌
分批灭菌在所用的发酵罐中进行。将培养基在配制罐中配 培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵 好以后，用泵通过专用管道输入发酵罐中，然后用直接蒸汽或 间接蒸汽加热到灭菌温度 (一般121℃)在此温度维持一定时间， 罐或生物反应器中，通入蒸汽将培养基和所用设备仪器 再冷却到发酵所需温度，完成灭菌过程。 进行灭菌的操作过程，也称为实罐灭菌，而若反应中没 有物料，则称为空消，空消是对发酵罐设备及其周边连 分批灭菌过程包括升温、维持和冷却三个阶段，通常 接管道进行灭菌处理。 100 ℃以下的温度对灭菌没有太多贡献，在实际过程中是忽略 的，升温是指从 100℃升到 121℃的情况，而冷却是指 121℃冷 优点：培养基的分批灭菌不需要专门的灭菌设备，对蒸 却到 100℃时的情况，在这两个温度段，加热升温和冷却对灭 汽要求低，投资少，设备简单，灭菌效果可靠。 菌是有贡献的。 缺点：蒸汽消耗量大，造成锅炉负荷波动大；灭菌温度 为了使灭菌处理得到期望的结果，Deindoerfer引入了▽来 低时间长以及升降温时间长，对培养基破坏大。 N0 测定灭菌度(N0/N) 。▽＝ln N 应用：分批灭菌是中、小型发酵罐经常采用的一种培养 Deindoerfer 还假设各阶段灭菌效果可以叠加，即 N 基灭菌方法。 ▽总＝▽加热＋▽维持＋▽冷却＝ln N
共39页 第15页
k A exp(2
2
RT
E ) RT E 1 1
目录
4.3.1.4 灭菌温度和时间的选择
灭菌温度和完全灭菌时间对维生素B1破坏量的比较 由于灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分破坏 灭菌温度 /℃ 完全灭菌时间/min 维生素B1破坏量/% 的活化能△ 100 E’，因此随着温度的上升，微生物比死亡速率 400 99.3 常数增加倍数要大于培养基成分破坏分解速率常数的增加 110 36 67 倍数。也就是说，当灭菌温度升高时，微生物死亡速率大 于培养基成分破坏的速率。根据这一理论，培养基灭菌一 115 15 50 般选择高温快速灭菌法，换言之，为达到目的相同的灭菌 120 4 27 效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培 130 0.5 8 养基因受热时间长而遭到破坏的损失。 145 0.08 2
维持2小时。经过烘箱热空气法可以达到彻底灭菌的目的。
该法适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌。其优点是灭菌 后物品干燥，缺点是操作所需时间长，易损坏物品，对液 体样品不适用。
共39页 第6页
目录
4.2.2 湿热灭菌
• 利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热 灭菌。通常湿热灭菌条件为121℃，维持 30 min。 • 高压蒸汽灭菌是实验室、发酵工业生产 中最常用的灭菌方法。一般培养基、玻 璃器皿、无菌水、缓冲液、金属用具等 都可以采用此法灭菌。
• 4.4 空气除菌
• 4.5 设备及管道灭菌
共39页 第3页
目录
4.1 生物反应过程中无菌的要求
采取措施对生产过程涉及到的原料、设备等进行 灭菌处理，达到严格的纯种培养条件。通常工业上采取 的主要措施是： (1)对培养基进行灭菌处理； (2)对好氧过程的空气进行灭菌处理； (3)对生物反应器(发酵罐)及其连接管道进行灭菌处理； (4)菌种为无污染的纯粹种子； (5)使生物反应器处于正压环境； (6)对培养过程中补料进行灭菌处理等。
共39页 第11页
目录
4.3.1 湿热灭菌原理
4.3.1.1 微生物热阻
☆ 每种微生物都有一定的生长温度范围。当微生物处于 ☆致死温度：杀死微生物的极限温度。 生长温度的下限时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。 ☆致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要 当温度超过生长温度的上限时，微生物细胞中的蛋白质 的时间。 等大分子物质会发生不可逆变性，使微生物在很短的时 在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。由 间内死亡，加热灭菌就是根据微生物的这一特性进行的。 于不同种类微生物细胞及微生物细胞和微生物孢子对 热的抵抗力不同，它们的致死温度和致死时间也有很 ☆ 一般微生物的营养细胞在60℃加热10min全部死亡， 大的差别。 ☆热阻：微生物对热的抵抗力，即指微生 但细菌芽孢能耐受较高的温度，在 100℃需要数分钟甚至 物在某一特定条件下 (主要是温度)的致死时间。 数小时才能被杀灭。某些嗜热菌的芽孢在 120℃下需 ☆相对热阻：指某一条件下的致死时间与另一微生物 30min甚至更长时间才能杀灭。所以，一般衡量灭菌彻底 在相同条件下的致死时间之比。 与否，是以能否杀灭芽孢细菌为标准。
共39页 第13页
目录
4.3.1.3 湿热灭菌的非对数残留定律
在实际过程中某些微生物受热死亡的速率是不符合对数 根据对数残留定律，联立微分方程可得 残留规律的。将其 N0/Nt对灭菌时间t在半对数坐标中标绘得到 的残留曲线不是直线。呈现这种热死亡非对数动力学行为的 Nt kS kR 主要是一些微生物芽孢。有关这一类热死亡动力学的行为， exp(k S t ) exp(k R t ) N0 kR kS kR Hunphey所提 虽然可用多种模型来描述，但其中以 Prokop 和 式中：Nt—任一时刻具有活力的芽孢数，即Nt = NS + NR； 出的“菌体循序死亡模型”最有代表性，其假设耐热性微生 N0—初始的活芽孢数； 物芽孢的死亡不是突然的，而是渐变的，即耐热性芽孢 (R型) 先转变为对热敏感的中间态芽孢 (S型)，然后转变成死亡的芽 kR—耐热性芽孢的比死亡速率， s-1； 孢(D型 k)，这一过程可用下式表示 —敏感性芽孢的比死亡速率，s-1。
k1 A exp( RT1 )
将上述两式相除并取对数后可得 ln k2 ( ) 式中：A—阿伦尼乌斯常数，s-1； k1 R T1 T 2 R—气体常数，8.314J/(mol· K)； T—热力学温度，K； k E 1 1 ☆ 培养基成分的破坏，同样也可得 ln 2 ( ) k1。 R T1 T 2 △E—微生物死亡活化能， J/mol k2 ln ( ) 大部分培养基的破坏也可认为是一级分解反应，若其他 k E 两式相除得 1 k E 条件不变，培养基成分分解速率常数和温度的关系也可用阿 ln ( 2 ) 伦尼乌斯方程表示。 k1
目录
4.2.4 化学药剂灭菌
某些化学试剂能与微生物发生反应而具有杀 菌作用。常用的化学药剂有酒精、甲醛、漂白粉 (或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐等。 由于化学药剂也会与培养基中的一些成分作用， 且加入培养基后易残留在培养基内，所以，化学 药剂不能用于培养基的灭菌，一般应用于发酵工 厂环境的消毒。
国家十一五规划教材《生物工艺学》（邱树毅主编）配套课件
目
• • • • • • • • • • 第一章 第二章 第三章 第四章 第五章 第六章 第七章 第八章 第九章 第十章工业培养基及其设计 生物工艺过程中的无菌技术 生物反应动力学 发酵过程原理 生物反应器及生物工艺过程的放大 生物反应过程参数检测与控制 生物产品分离及纯化技术 生物产品工艺学及应用
150
0.01
共39页 第16页
＜1
目录
4.3.1.5 影响培养基灭菌的其他因素
油脂、糖类及一定浓度的蛋白 不同成分的培养基其含菌量 pH对微生物的耐热性 固体培养基的灭菌时间要比液体培 质增加了微生物的耐热性，高浓度 是不同的。培养基中微生物数量 影响很大，pH为6.0～8.0 养基的灭菌时间长，假如 100℃时液体培 培养基pH 有机物会在细胞的周围形成一层薄 越多，达到无菌要求所需的灭菌 泡沫中的空气形成隔 时微生物耐热能力最强， 养基的灭菌时间为 1h，而固体培养基则 膜，从而影响热的传入。所以灭菌 时间也越长。天然基质培养基， pH 6.0时，H+易渗入微 需要 2～小于 3h才能达到同样的灭菌效果。 热层，使传热困难，对灭 培养基物理状态 温度应高些。 特别是营养丰富或变质的原料中 其原因在于液体培养基灭菌时，热的传 生物细胞内，改变细胞的 菌极为不利。因此对易产 含菌量远比化工原料的含菌量多， 递除了传导作用外还有对流作用，而固 生理反应促使其死亡。所 例如，大肠杆菌在水中加热到 生泡沫的培养基进行灭菌 泡沫 体培养基则只有传导作用而没有对流作 因此，灭菌时间要适当延长。含 以培养基 pH愈低，灭菌所 60 ～ 65 ℃便死亡，在 10%的糖液中， 时，可加入少量消泡剂。 用，另外液体培养基中水的传热系数要 芽孢杆菌多的培养基，要适当提 需时间愈短。 需 70 ℃处理4～6min，而在30%的 比有机固体物质大得多。 微生物数量 高灭菌温度并延长灭菌时间。 糖液中则需70℃处理30min。
式中：N0—开始灭菌时原有的活菌数，个； dt
NtN — 经过 t时间灭菌后的残留菌数，个。 式中： — 残留活菌数，个； 此式是计算灭菌的基本公式，从式中可知灭菌时间取决 t—受热时间，min； 于污染程度(N0)、灭菌程度(残留菌数 Nt)和k值。 -1 k—比死亡速率常数，s 。k也称灭菌速率常数， 亦可看出，如果要求完全彻底灭菌，即残留菌数Nt=0时， 此常数大小与微生物种类及灭菌温度有关； 需要的灭菌时间为无穷大， 此式即无意义，事实上是不可能 dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。 的。因此，工程上进行灭菌设计时，一般采用 Nt=0.001，即 在1000次灭菌中允许有一次染菌机会。