生理指标测定实验方案汇总

1.抗氧化酶系统、MDA
2.可溶蛋白、超氧阴离子自由基
3.叶绿素、类胡萝卜素
4.可溶性糖
5.游离氨基酸
6.过氧化氢
7. 谷胱甘肽、ASA
1. 抗氧化酶系统、MDA
A 酶活测定
试剂：
PBS缓冲液0.05M（pH 7.8）：取0.663g NaH2PO4·2H2O和16.384g Na2HPO4·12H2O，加PVP10g，并加EDTA或者EDTA盐，使其浓度为2mM，加蒸馏水定容至1L。

用前冰箱或冰上预冷。

样品制备
鲜样0.1-0.5g加入1 ml磷酸缓冲液（0.05M，pH 7.8），稍许石英砂，研磨成匀浆；移入10 ml离心管中，再用4ml磷酸缓冲液分两次洗涤研钵并全部转入离心管中；10000×g 4℃下离心20 min；上清夜贮于4℃冰箱中保存备测。

同时称取鲜样一份(0.1g左右)烘干称重。

SOD （λ=560nm）
试剂配制：
实验步骤：
2.725mL反应液＋250uL蒸馏水＋25uL酶液【样品管】
2.75mL反应液＋250uL蒸馏水（光照作为100%CK）【照光对照管】
2.75mL反应液＋250uL蒸馏水（黑暗作为调零）【空白调零管】
4000lx日光灯下反应20分钟，560nm比色。

反应温度25~35℃。

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示按下式计算SOD活性：SOD总活性＝（Ack－AE）*V/（0.5*Ack*w*Vt）
（式中SOD总活性以鲜重酶单位每克表示，Ack为照光对照管的吸光度，AE为样品管的吸光度，V为样品液的总体积ml，Vt为测定时样品用量ml，w为样品鲜重g）
※※※【空白调零管】可在光反应快结束前配制并用黑色纸或铝箔包裹以避光。

【样品管】和【照光对照管】在光反应快结束后至测定前应避光处理。

POD （λ=470nm比色）
试剂配制：1.5%愈创木酚（1.5ml愈创木酚，用蒸馏水定容到100 ml）
300uM的H2O2：取30％的H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到50 ml；
实验步骤：
100ul酶液+2700ulPBS+100ul愈创木酚+100ul H2O2，于普通比色皿，轻轻摇匀2-秒，A470动力学测定1分钟。

选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。

结果计算：POD(mmol/g)=activity×A×V×a/(E×w)
A反应液总体积/ml；V提取液总体积/ml；a测定液体积/ml；w材料鲜重/g；E吸光系数
CAT（240nm比色）
试剂配制： 300uM的H2O2：取30％的H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到50 ml；
实验步骤：
100ul酶液+2800ulPBS+100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒，A240动力学测定1分钟。

选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。

结果计算：CAT (mmol/g)=activity×A×V×a/(E×w)
APX（λ=290nm比色）
试剂配制： 7.5mM的抗坏血酸(AsA)：66mg AsA用蒸馏水定容到50 ml；
300uM的H2O2：取30％的H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到50 ml；
实验步骤：
100ul酶液+2700ulPBS+100ul AsA +100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒，A290动力学测定1分钟。

选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。

结果计算：CAT (mmol/g)=activity×A×V×a/(E×w)
B.丙二醛（MDA）含量的测定（λ=450，532，600nm比色）
试剂配制：
5%三氯乙酸（TCA）：25g三氯乙酸定容到500mL。

MDA反应液：2.5g硫代巴比妥酸，先用少量1M的氢氧化钠溶解，再用5%三氯乙酸定容到500mL。

实验步骤：
0.5mL酶液＋2.5mL反应液，沸水浴反应15分钟，立即冰浴，4800rpm离心10分钟，上清转入新管，波长450,532和600下比色，MDA反应液调零。

结果计算：丙二醛含量（nmol.g-1）＝（D532－D600）*A*V/（a*1.55*10-1*w）
式中A为反应液总量（mL）；V为提取液总量（mL）；a为测量用提取液量（mL）；w为材料鲜重（g）。

1.55×10-1为丙二醛的umol/L消光系数（nmol/mL消光系数）
或者：MDA浓度(umol/L)=6.45(D532－D600) －0.56D450
丙二醛含量（umol.g-1）= MDA浓度×提取液总体积(ml)/组织鲜重(g)/1000----------
植物体可溶性蛋白质含量测定
比色原理：
染料考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【试剂】
1、65mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)；如超氧阴离子自由基含量测定用。

称取K2HPO4·3H2O(MW=228.22)9.1234g和KH2PO4(MW=136.09)3.406g，蒸馏水定容到1L。

或K2HPO4·3H2O 4.562g和KH2PO4 1.703g，蒸馏水定容到0.5L。

2、考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。

滤纸过滤后低温储存。

常温下可放置一个月；
3、磷酸（85%，W/V）：也即商业磷酸(浓度≥85%)。

直接用。

样品蛋白质含量（mg/g 鲜重）=C*V/W 4、0.15M 的NaCl (标准曲线用)：NaCl0.8766g 蒸馏水定容到100ml 。

【方法】
1.标准曲线的绘制
血清白蛋白(BSA)先用0.15M 的NaCl 配制成2mg/ml 的原液。

表1 配制0～1000μg/ml 血清白蛋白液
管 号 1 2 3 4 5 6
牛血清蛋白原液(ml) 磷酸钾缓冲液量(ml) 蛋白质含量(μg/ml) 0 1.0 0 0.1 0.9 200 0.2 0.8 400 0.3 0.7 600 0.4 0.6 800 0.5 0.5 1000 以上各管混匀后，各取0.1ml 于新的10ml 离心管内，各加5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置2min ，在595nm 下比色，绘制标准曲线。

折衷：
表 2 配制0～1000μg/ml 血清白蛋白液
管 号 1 2 3 4 5 6
牛血清蛋白原液(ul) 磷酸钾缓冲液量(ul) 蛋白质含量(μg/ml) 0 100 0 10 90 200 20 80 400 30 70 600 40 60 800 50
50 1000 以上各管混匀后，各加5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置2min ，在595nm 下比色，绘制标准曲线。

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。

取样品上清液0.1ml 于新的10ml 离心管内，各加5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置2min ，在595nm 下比色。

3.结果计算
式中 C －查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg/ml ）；V －提取液总体积（ml ）；此为样品提取液总体积为3ml ；W －取样量（g ）。

※ 测定以上3项目时，同时取部分同批剩余鲜样称重后转入纸袋烘干称重。

2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基
植物材料0.1-0.2g 左右(记录准确称量值)→65 mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.8)1ml →少许石英砂→冰上充分研磨→转入离心管→磷酸钾缓冲液洗涤研钵2次，每次1ml 全部转入离心管(样品提取液总体积为3ml)→4℃10000r/min 离心15min →取上清液转入新管标记低温保存（待测液）。

A. 超氧阴离子自由基（λ=530nm ）
比色原理：
2O 2.-+ 盐酸羟胺→NO 2-+磺胺→重氮化磺胺+α-萘胺→偶氮化合物(粉红色,在波长530nm 处有显著的光吸收)
试剂准备：
1、65mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.8)；【不用磷酸钠】
称取K 2HPO 4·3H 2O(MW=228.22)9.1234g 和KH 2PO4(MW=136.09)3.406g ，蒸馏水定容到1L 。

或K 2HPO 4·3H 2O 4.562g 和KH 2PO 4 1.703g ，蒸馏水定容到0.5L 。

2、10mmol/L 盐酸羟胺；称取盐酸羟胺(MW=69.49)0.06949g 蒸馏水定容到100mL
3、12mol/L 乙酸：称取冰乙酸(MW=60.05)144.1g 蒸馏水定容到200mL
4、58mmol/L 磺胺（12mol/L 乙酸为溶剂配制）；称取磺胺(MW=172.21)0.9988g ，用12mol/L 乙酸溶解并定容到100mL
5、 7mmol/L α-萘胺（12mol/L 乙酸为溶剂配制）；称取α-萘胺(MW=143.19) 0.100233g （0.1g ），用12mol/L 乙酸溶解并定容到100mL
6、三氯甲烷（氯仿）；
7、NaNO2（30umol/LNaNO2）（用65mmol/L磷酸钾缓冲液配制和稀释）：称取NaNO2（MW=69.00）0.207g用65mmol/L磷酸钾缓冲液定容到1L(此时NaNO2浓度3mM)，从中吸取5ul，加65mmol/L磷酸钾缓冲液495ul即可(30uM)。

其它25，20，15，10，5umol/LNaNO2，依此。

测定流程图
空白调零组：磷酸钾缓冲液0.5ml→盐酸羟胺0.1ml→摇匀→25℃水浴10min→冰浴→磷酸钾缓冲液0.5ml→摇匀→25℃水浴20min→冰浴→磺胺1ml→α-萘胺1ml→摇匀→25℃水浴20min→冰浴→三氯甲烷3ml→4℃10000r/min离心3min→上层水相测定A530。

试验组：磷酸钾缓冲液0.5ml→盐酸羟胺0.1ml→摇匀→25℃水浴10min→冰浴→上清液0.5ml→摇匀→25℃水浴20min→冰浴→磺胺1ml→α-萘胺1ml→摇匀→25℃水浴20min→冰浴→三氯甲烷3ml→4℃10000r/min离心3min→粉红色水相(上层)测定A530。

标准曲线：
NaNO2用65 mmol/L磷酸钾缓冲液配置成30umol/L，再稀释成25，20，15，10，5和0umol/L。

磷酸钾缓冲液0.5ml→盐酸羟胺0.1ml→摇匀→25℃水浴10min→冰浴→加各种不同浓度的NaNO2各取0.5ml→摇匀→25℃水浴20min→冰浴→磺胺1ml→α-萘胺1ml→摇匀→25℃水浴20min→冰浴→三氯甲烷3ml→10000r/min离心3min→粉红色水相(上层)测定A530。

结果计算：
通过标准曲线生成的NO2-与A530的方程，求出[NO2-],乘2则得[O2.-]。

O2.- 产生速率=[O2.-]/样品Pr含量/20min；O2.- 产生总量=[O2.-]/样品Pr含量（25℃水浴共培养60min）。

说明：鲜样测定，不能用于干样品，样品也不宜液氮速冻后超低温冰箱储存后测定。

盐酸羟胺与样品上清液的25℃水浴共培养20min用于O2.- 产生速率测定；如果25℃水浴共培养60min则用于O2.-含量测定。

25℃水浴共培养的时间为关键时间，必须掌握好，此步处理前后样品试剂溶液尽量处于冰浴状态。

待测液制备后应尽快测定。

干旱胁迫处理，要同时称量所取用的同一样品烘干至恒重称出烘干重，以便计算单位干重样品的O2.- 产生速率；或者用的同一新鲜样品测定蛋白质含量，以便计算单位蛋白质质量的O2.- 产生速率。

B.可溶性蛋白质含量测定
比色原理：
染料考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【试剂】
1、65mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)；如超氧阴离子自由基含量测定用。

称取K2HPO4·3H2O(MW=228.22)9.1234g和KH2PO4(MW=136.09)3.406g，蒸馏水定容到1L。

或K2HPO4·3H2O 4.562g和KH2PO4 1.703g，蒸馏水定容到0.5L。

2、考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。

滤纸过滤后低温储存。

常温下可放置一个月；
3、磷酸（85%，W/V）：也即商业磷酸(浓度≥85%)。

直接用。

4、0.15M的NaCl (标准曲线用)：NaCl0.8766g蒸馏水定容到100ml。

【方法】
1.标准曲线的绘制
血清白蛋白(BSA)先用0.15M的NaCl配制成2mg/ml的原液。

表1 配制0～1000μg/ml血清白蛋白液
样品蛋白质含量（mg/g 鲜重）=C*V/W 管 号 1 2 3 4 5 6
牛血清蛋白原液(ml) 磷酸钾缓冲液量(ml) 蛋白质含量(μg/ml) 0 1.0 0 0.1 0.9 200 0.2 0.8 400 0.3 0.7 600 0.4 0.6 800 0.5 0.5 1000 以上各管混匀后，各取0.1ml 于新的10ml 离心管内，各加5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置2min ，在595nm 下比色，绘制标准曲线。

折衷：
表 2 配制0～1000μg/ml 血清白蛋白液
管 号 1 2 3 4 5 6
牛血清蛋白原液(ul) 磷酸钾缓冲液量(ul) 蛋白质含量(μg/ml) 0 100 0 10 90 200 20 80 400 30 70 600 40 60 800 50
50 1000 以上各管混匀后，各加5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置2min ，在595nm 下比色，绘制标准曲线。

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。

取样品上清液0.1ml 于新的10ml 离心管内，各加5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置2min ，在595nm 下比色。

3.结果计算
式中 C －查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg/ml ）；V －提取液总体积（ml ）；此为样品提取液总体积为3ml ；W －取样量（g ）。

※ 测定以上3项目时，同时取部分同批剩余鲜样称重后转入纸袋烘干称重。

3.叶绿素、类胡萝卜素
叶绿素、类胡萝卜素测量
实验步骤：
叶片快速剪取并精确称重0.1g 左右，重复3次。

再快速剪成细丝(或用打孔器打成小的叶圆片)转入洁净离心管，管内加提取液10 ml ，于室温下遮光静置至样品完全发白(期间多次摇动提取液)，对提取液比色(以不加叶片的提取液调零)，然后据提取液类型按下面公式计算叶绿素和类胡卜素含量。

剪取叶片同时再精确称取0.1-0.2g 左右叶片，105ºC 杀青10min ，80ºC 烘干恒重后称重。

结果计算：
一、采用丙酮、无水乙醇、蒸馏水混合提取液(三者体积比4.5∶4.5∶1)
Chla(mg/L)= 9.784OD663—0.990OD645, Chlb(mg/L)= 21.426OD645—4.650OD663,
Chl(a+b)(mg/L)=5.134OD663+20.436OD645, Car(mg/L)=4.695OD440—0.268(Chla+Chlb), 采用波长663，645和440nm 。

唐延林,黄敬峰,王人潮.水稻不同发育时期高光谱与叶绿素和类胡萝卜素的变化规律.中国水稻科学2004, 18(1) 59-66
二、采用80%丙酮提取液------采用波长663，646和470nm 。

(Arnon and Lichtenthale) Chla(mg/L) = 12.21D663 – 2.81D646；Chlb(mg/L)= 20.13D646 – 5.03D663； Chl(a+b)(mg/L)= Chla + Chlb =17.32D645 + 7.18D663；
Car(mg/L)=（1000D470 – 3.27 Chla – 104 Chlb ）/ 229
三、采用采用95%乙醇提取液----采用波长665，649和470nm 。

(邹琦 等)
Chla(mg/L)= 13.95D665 – 6.88D649；Chlb(mg/L)= 24.96D649 – 7.32D665；
Chl(a+b)(mg/L)= Chla + Chlb =18.08D645 + 6.63D663；
Car(mg/L)=（1000D470 – 2.05 Chla – 114.8 Chlb ）/ 245
结果：Chl (mg/g)=[浓度(mg/L)×提取液体积(ml)]/[质量(g)×1000]。

4.可溶性糖
蒽酮法测定可溶性糖
样品制备测定：
取新鲜植物叶片（或干材料），擦净表面污物，剪碎混匀，精确称取0.05-0.1g左右，转入研钵，加少许石英砂，1ml蒸馏水充分研磨后转入10ml离心管，4ml蒸馏水分次洗涤研钵后也完全转入离心管内。

离心管沸水浴30min，5000rpm离心5min，上清转入新管，原来离心管残渣再加水5ml，混匀后沸水浴10min，5000rpm离心5min，上清一并转入新管，并蒸馏水定容到10ml混匀备测。

【原理】
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内,颜色深浅与糖含量成正比。

用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

【试剂】
1．蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。

2．浓硫酸（比重1.84）。

标准曲线制备：
100μg/ml蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。

加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水定容。

乙酸乙酯试剂0.1ml并小心加入浓硫酸1ml，加盖后充分震荡，立即沸水浴1min，取出冷却后630nm比色，蒸馏水调零。

上清液0.2ml加蒸馏水0.2ml，加入蒽酮乙酸乙酯试剂0.1ml并小心加入浓硫酸1ml，加盖后充分震荡，立即沸水浴1min，取出冷却后630nm比色，蒸馏水调零。

结果计算：
可溶糖含量（mg/gFW or DW）=C*V/W/1000
C：标曲所得可溶糖含量(ug/ml)；V：样品提取液体积(10ml)；W：样品鲜重或干重(g)。

5.游离氨基酸
游离氨基酸含量测定
样品制备测定：
叶片准确称取0.05-0.1g于研钵，1ml的10%乙酸重复研磨，转入10ml洁净离心管，2ml的10%乙酸分两次洗涤研钵并完全转入离心管内，加无氨蒸馏水(可以超纯水替代)定容到10ml(离心管口位置)，摇匀后5000rpm离心10min，上清液转入新管备测。

同时取部分同批剩余鲜样称重后转入纸袋烘干称重。

试剂配制：
1、醋酸钠-醋酸缓冲液(pH=4.9)：9.679g的醋酸钠(CH3COONa)加4.924g的醋酸(CH3COOH)，蒸馏水定容到100ml。

2、茚三酮缓冲显色液(1%)：1.05g茚三酮＋18ml正丙醇＋25ml正丁醇＋50ml乙二醇＋12ml 醋酸钠-醋酸缓冲液。

3、ASA(抗坏血酸)(0.1%)：50mg的ASA溶于50ml的无氨蒸馏水(可以超纯水替代)。

现用现
配。

4、10%乙酸：10ml冰乙酸加90ml蒸馏水。

5、80%乙醇：850ml的95%的乙醇（可以组培间大桶酒精替代）加150ml蒸馏水。

6、氨基酸标准溶液(5.0ug/ml)：烘干恒重的谷氨酸0.0536g，先用少量的10%的异丙醇(0.5ml 异丙醇加4.5ml蒸馏水混匀)溶解后，转入100ml洁净容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。

从中取5ml用水稀释到50ml即可。

按照上表依次加入各试剂，摇匀后，沸水浴显色20min，取出后迅速冰浴，并不时摇动离心管，当溶液呈蓝紫色时各加80%乙醇2ml和蒸馏水2.08ml，摇匀后，570nm比色绘制标曲。

上清液200ul加入到10ml离心管内→加茚三酮缓冲显色液700ul→0.1%抗坏血酸20ul→沸水浴显色20min→迅速冰浴→溶液呈蓝紫色时→加80%乙醇2ml→蒸馏水2.08ml→570nm比色。

结果计算：
AA含量（mg/gFW or DW）=C*V/W/1000
C：标曲所得AA含量(ug/ml)；V：样品提取液体积(10ml)；W：样品鲜重或干重(g)。

6.过氧化氢
植物组织中过氧化氢含量测定（λ=415nm）
样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织0.2g左右（视H2O2含量多少而定），加入4℃下预冷的丙酮1ml和少许石英砂研磨成匀浆后转入离心管，再用2-3ml冷丙酮分次洗涤研钵并把洗涤液转入离心管，3000 r/min下离心10min（或8000rpm离心5min），同时准备新的离心管并编号标记并称重记录，离心完以后，上清液转入新离心管后，再次称重，两次称重差值除以丙酮密度（0.792g/ml），即为样品提取液总体积。

【原理】
H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm 波长下比色测定。

在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。

【试剂】
1、100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 10.2μl，溶于100ml的丙酮（此时H2O2为1mmol/L），混匀后从中吸取50μl再加丙酮450μl混匀（此时H2O2为100μmol/L）。

2、1mol/L硫酸：浓硫酸56ml，缓慢加蒸馏水944ml，混匀冷却。

3、5%（W/V）硫酸钛：称取5g硫酸钛，加蒸馏水100ml溶解。

4、丙酮(冰浴或冰箱预冷)；
5、浓氨水。

【方法】
1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表1和2加入试剂。

心管，将洗涤液合并后定容至10ml 刻度，415nm 波长下比色。

2. (2)用移液管吸取样品提取液1ml ，按表1或2加入5%硫酸钛0.1ml 和浓氨水0.2ml ，待沉淀形成后3000rpm/min 离心10min （或8000rpm 离心5min ），弃去上清液。

沉淀用冷丙酮反复洗涤3～5次，每次1ml （具体为：沉淀加冷丙酮1ml ，混匀，8000rpm 离心1min ，弃掉丙酮；重复此步骤三次），直到去除植物色素。

(3)向洗涤后的沉淀中加入1mol/L 硫酸5ml ，摇匀，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。

3.结果计算：
植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=C Vt FW V ⨯⨯1
式中 C —标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol ）； Vt —样品提取液总体积（ml ）； V1—测定时用样品提取液体积（ml ）；即1ml 。

FW —植物组织鲜重（g ）。

7. 谷胱甘肽、ASA
A.谷胱甘肽含量的测定
还原型谷胱甘肽(GSH)是植物细胞内另一种重要的抗氧化剂。

它含有活性的巯基，极易被氧化。

本实验利用疏基试剂DTNB 测定GSH 的含量。

试剂药品：
GSH 的提取(下面的ASA 测定也使用该提取液)
精确称0.2g 左右叶片，将样品剪碎加入5mL 10％三氯乙酸，研磨，15000×g 离心10 min ，留取上清液备测。

同时再精确称取0.2g 左右叶片，105ºC 杀青10min ，80ºC 烘干恒重后称重。

1、10％三氯乙酸（TCA ）溶液（W/V ）：10g 三氯乙酸，用蒸馏水配成100mL 溶液；
2、150 mM 磷酸缓冲液(pH7.5;含有5mM EDTA):Na2HPO4·12H2O 38.679g 和NaH2PO4·2H2O
3.952g 溶于约1L 水；加入EDTA 使其浓度为5mM ，搅匀后蒸馏水定容。

3、6mM DTNB(用上面的150 mM NaH2PO4(pH7.5;含有5mM EDTA)来配制)
实验步骤：
1、GSH 标推曲线的制作
配制浓度分别为0mM 、0.02 mM 、0.04mM 、0.06 mM 、0.08 mM 、0.10mM 、0.12 mM 的标淮GSH 溶液，吸取上述标准液各0.25mL 。

分别加入150 mM NaH2PO4 (pH7.4)2.60mL ，混合均勾后，往各管中加人DTNB 试剂0.15mL ，摇匀厉，30℃保温反应5min ，测A412nm(以加磷酸缓冲液代替DTNB 试剂作空白对照)。

将测定结果以GSH 浓度为横坐标、光密度值为纵坐标制作标淮曲线。

2、GSH 的提取(下面的ASA 测定也使用该提取液)
精确称0.2g 左右叶片，将样品剪碎加入5mL 10％三氯乙酸，研磨，15000×g 离心10 min ，
留取上清液备测。

同时再精确称取0.2g左右叶片，105ºC杀青10min，80ºC烘干恒重后称重。

3、总GSH含量的测定
分别取上述样品提取液0.25mL，各加入磷酸缓冲液2.6mL、DTNB试剂0.15mL，以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白。

摇匀后，于30℃保温反应5min，测定412nm波长下的光吸收值。

根据标准曲线计算样品的GSH含量。

折衷：分别取上述样品提取液83uL，各加入磷酸缓冲液867uL、DTNB试剂50uL于1.5ml离心管中(总体积1ml)，以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白。

摇匀后，于30℃保温反应5min，使用微量比色皿测定412nm波长下的光吸收值。

重复3次。

实验结果：
GSH含量用μg/gDW表示。

ASA含量的测定
试剂药品：
1、150mM磷酸缓冲液(pH7.4) :Na2HPO4·12H2O38.679g和NaH2PO4·2H2O3.952g溶于约1L 水；加入EDTA使其浓度为5mM，搅匀后蒸馏水定容。

2、10％三氯乙酸（TCA）溶液；10g三氯乙酸，用蒸馏水配成100mL溶液；
3、44％H3PO4：分析纯磷酸(含量85%)取44ml加水45ml混匀。

4、4％的2，2-二联吡啶（溶于70%乙醇）；4g二联吡啶用70%乙醇溶解并定容到100ml。

5、3％FeCl3：3g FeCl3蒸馏水溶解并定容到100ml。

实验步骤：
1、ASA标推曲线的制作
称取17.613mg的ASA，溶解并定容至100mL，得到1mmol/L的标准母液，利用该母液配制浓度分别为0mM、0.1 mM、0.2mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5mM、0.6 mM、0.7 mM 的标淮ASA 溶液，吸取上述标准液各0.2mL。

分别加入150 mM NaH2PO4 (pH7.4) 0.2mL，H2O0.2mL，混合均勾后。

超过30s后再分别往各管中加入10％TCA溶液0.4mL、44％H3PO40.4mL，4％ 2，2-二联吡啶0.4mL、3％FeCl30.2mL，混匀后在37℃水浴中保温60min，然后测525nm处的OD值。

将测定结果以ASA浓度为横坐标、光密度值为纵坐标制作标淮曲线。

2、ASA的提取（使用前面的GSH提取液）
称0.2g叶片，将样品剪碎加入5mL 10％三氯乙酸，研磨，15000×g离心10 min。

重复3次。

同时再精确称取0.2g左右叶片，105ºC杀青10min，80ºC烘干恒重后称重。

3、ASA含量的测定
分别取上述样品提取液0.1mL，分别加入150 mM磷酸缓冲液(pH7.4) 0.1mL，H2O(蒸馏水)0.1mL，混合均匀后，至少30s后再分别往各管中加入10％TCA溶液0.2mL、44％H3PO40.2mL，4％ 2，2-二联吡啶0.2mL、3％FeCl30.1mL(总体积1ml)，混匀后在37℃水浴中保温60min，然后用微量比色皿测525nm处的OD值。

重复3次。

实验结果：ASA含量用μg/gDW表示。