建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定_杨丽

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大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化与鉴定

ｉｏａｅｔｅｓｔｒｄｉｎｅｔｆｇｔｎａｄａｈｒｎｕｔｒｒｍｈｎｒｏｏｈｏｎｓｌｔｄｗｉｄｎｉｇａｅｔｃｎｒｕａｉｎｄｅｅｔｃｌｅｆｏｔｅｂｅｍａｒｗｆｔｅｙｕｇＳＤａｓ．ＣＣＫ－ｈｙｉｏｕｏｒｔ８ｒａｅｔＷａｓｄｔｅｅｍｉｅｔｅｇｏｈｃｒｅ．ＬｉｈｃｏｃｐｅｒｓｄｔｔｄｅｍｏｐｏｏｉｅｇｎＳｕｅｏｄｔｒｎ￣ｕｖｈｒｇｔｍｉｒｓｏｓｗｅｅｕｅｏｓｕｙｔｒｈｌｇｃ￣ａｕｈｔｍｓ．Ｆｌｗｏ
ｃｍｅ￣ｗｓａｐｉｄｔｉｅｔｙｔｅｃｌ．ｍｍｕｏｙｃｅｓｙｔｃｎｑｅｗｓｅｌｙｄｔｅａｎｅｃｌａｔｅｓｐｏｔａｐｌｏｄｎｉｈｅｌＩｅｆｓｎｃｔｈｍｉｒｅｈｉａｍｐｏｅｏｘｍｉｅｔｅｌｎｉｎｏｔｕｈｇ
基础研究・
大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化与鉴定＊
卢仁荣一陈良龙 … 江琼郭进建
［要］目的：讨骨髓间充质干细胞（ＭＣ）外获取及培养增殖的方法并鉴定。方法：密度摘探ＢＳｓ体用
ＭｅｉｌＵｉｒｔｄｃｎｖｓｙ，ＳｎｎＦｊｎ３５０Ｃｉａａｅｉａｍｉｇ，ｕｉ６００，ｏｅｐｒａｉｒｃｃｌｅｏｆｈｏｔｎｃｌｒａｄｕｆａｏｆｏｅＡｓａｔｒｂｅｔｅＴｘｌｅｎｉｖｒｐａｔａｍｔｄｏｔｉｌｉ，ｕｕｅｎｒｃｔｎｎｉｏｎｔｏｉｈｅｓａｏｔｐｉｉｉｏｂ

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定作者：李兰兰陈玲肖马炬明来源：《中国现代医生》2014年第01期[摘要] 目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）体外分离培养方法。

方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs，进行形态学观察，绘制生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物，并进行成脂、成骨分化诱导。

结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样，并呈集落样生长。

生长曲线呈S形，细胞周期显示86.02% P3代细胞为G0/G1期，保持活跃的扩增能力。

BMSCs 高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。

成脂诱导21 d后，可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。

成骨诱导21 d后，可见大量橘红色矿化结节形成。

结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。

[关键词] 骨髓间充质干细胞；全骨髓贴壁法；鉴定[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）01-0007-04BMSCs具有高度增殖的能力、体外基因转移效率高以及多向分化潜能等优点[1-2]，使其成为组织工程、细胞替代治疗等领域的首选种子细胞。

但是骨髓中的间充质干细胞含量极低[3]，且其含量随年龄增长而逐渐减少[4]，需经体外分离、纯化、扩增为纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞才能满足组织工程需求。

实验旨在建立一套简便有效的BMSCs原代培养方法，为后续实验做好准备。

1 材料与方法1.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠6只，4周龄，体质量100 g，由浙江省实验动物中心提供。

实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 时间及地点于2013年1～6月在中国人民解放军第一一七医院干细胞治疗中心完成。

1.3 实验主要试剂低糖DMEM培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/链霉素（吉诺生物），优质胎牛血清（Gibco），anti-CD45、anti-CD90（BD），anti-CD34（Santa Cruz），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红O （Cyagen公司）。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记发表时间：2011-2-17 15:31:47来源：创新医学网医学编辑部推荐作者：王亭忠，马爱群，蒋文慧，徐正云，席雨涛作者单位(西安交通大学第一医院心内科;教育部环境与疾病相关基因重点实验室，陕西西安710061)【关键词】大鼠,骨髓间充质干细胞;培养;绿色荧光蛋白;转染摘要：目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法，检测绿色荧光蛋白基因转染MSCs的瞬时表达及转染效率。

方法应用Percoll密度梯度离心法分离大鼠MSCs，贴壁法不断纯化，流式细胞仪检测2代细胞表面CD34、CD71和CD90的表达，然后用pEGFPN3与Lipofectamine 2000不同浓度比例转染MSCs，荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率。

结果①原代MSCs多呈纺锤形或梭形，有聚集生长的倾向，多3～5个细胞成为一个集落。

传代后，细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样，长梭形，胞浆突起较少，胞体轮廓不甚清晰，胞体也相对较大;②GFP转染后24h即可见绿色荧光蛋白表达，72h表达最强，此后逐渐减弱，到4周时仍可见少量表达;③转染效率与质粒和脂质体的浓度比例有关，1∶2到1∶3最高。

结论利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;GFP转染是一种较好的MSCs标记方法。

Rat mesenchymal stem cells culture and label withgreen fluorescent protein gene transfectionWang Tingzhong, Ma Aiqun, Jiang Wenhui, Xu Zhengyun, Xi Yutao(Department of Cardiology, First Hospital of Xi an Jiaotong University, Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education, Xian 710061, China)ABSTRACT: ObjectiveTo establish a method of isolation and culture of the rat mesenchymal stem cells (MSCs), and to investigate the transient expression of green fluorescent protein gene transfection into MSCs. Methods MSCs, which were initially isolated from the bone marrow of rats, were cultured in vitro and tested by flow cytomertry. Then they were transfected with pEGFPN3 by means of Lipofectamine 2000. The ratio of plasmid to Lipofectamine varied according to the experiment design. The results of the transient expression of GFP and transfection efficiency were observed by fluorescence microscope. Results MSCs were adherent, elongated, and spindleshaped in the primary culture after 24 hours of plating, and then became several little clones; During mitosis the cells regained a rounded appearance, and remained loosely attached until division was completed. When they reached 80% confluence, MSCs were subcultured and gained uniform shape and similar growth pattern. The expression of GFP began at 24 hours after transfection, and reached the peak at 72 hours and decreased in 1 week; however, the transient expression remained for more than 4 weeks. Transfection efficiency was correlated with the ratio of plasmid to lipofectamine. Conclusion High pured MSCs can be obtained by Percoll gradient centrifuging and adherent method. GFP transfection is a better method to label MSCs.KEY WORDS: rat; mesenchymal stem cell; culture; green fluorescent protein; transfection 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)存在于骨髓基质中，是由Friedenstein最初在骨髓培养中发现的一种容易贴壁的纺锤状细胞[1]。

骨髓间充质细胞的提纯和分离、增殖

骨髓间充质干细胞分离及条件培养基在其培养扩增中的作用摘要：【目的】建立一种简便、快速、实用的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells，MSCs)体外分离、纯化和扩增的方法。

【方法】采用贴壁法分离纯化大鼠骨髓MSCs(rMSCs)，并对其形态学特征进行观察，培养时观察条件培养基对rMSCs生长的影响。

【结果】贴壁法能有效地分离rMSCs，采用条件培养液培养，细胞活力好，增殖能力强，对维持细胞正常形态有着重要作用。

【结论】贴壁分离法能成功地进行rMSCs的体外分离，采用爷件培养液建立的rMSCs培养方法有效可行。

关键词：骨髓问充质干细胞／分离和提纯；细胞培养骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种成体干细胞，具有较强的可塑性，能被诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成肌细胞等⋯1，同时发现MSCs还具有独特的免疫调节作用[2-4J。

细胞学、组织学及器官学的研究者均把目光投向MSCs，同时MSCs也受到药理研究者的关注。

MSCs除了可作为组织工程较理想的种子细胞外，也可作为药物作用的靶标或药理研究的工具，利用MSCs体内外生物学性质进行中药作用机理的研究已有众多报道I 。

但由于骨髓中的MSCs含量很低，1 个骨髓单核细胞中仅含有1～2个MSCs~11 J，加之MSCs主要存在于骨内膜_】，要获得满足药物研究所需的数量比较困难。

因此，采用合适的MSCs分离、纯化和扩增的方法是许多研究的重要前提。

1 材料与方法1．1 动物Sprague Dawley(SD)大鼠，性别不限，体质量100～120 g，本校实验动物中心提供，合格证号为SCXK (粤)2003．0001。

1，2 主要试剂低糖Dulbeceo改进的Eagle培养基(1ow glucose Dulbecco’s Modified Ea e Medium，LDMEM)由GIBCO 公司提供；胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；2．5 g／L胰酶(含0．2 g／L EDTA)由吉诺生物医药技术有限公司提供；HEPES为Sigma产品，广州威佳公司分装；青霉素、链霉素由华北制药有限公司提供；兔抗大鼠CD44、CD54、I 型胶原抗体，生物素化抗生蛋白链菌素复合(Streptavidin．Biotin．Complex，SABC)试剂盒，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒均由武汉博士德公司提供。

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养标记及向移植肺趋化的实验研究

清（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），ＤＡＰＩ试剂（美国Ｓｉｇｍａ公司），ＣＤ３４ＦＩＴＣ抗体（美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司）、ＣＤ４４一ＰＥ抗体（英国ＳＥＲＯＴＥＣ公司），ＣＤ１１ｂ — ＰＥ
１．２．１ＭＳＣ的分离、培养及鉴定全骨髓贴壁法分离培养ＭＳＣｓ。取大鼠股骨及胫骨，骨髓细胞以２ ×１０ｅｍ密度接种，使用低糖ＤＭＥＭ培养。通
高度增殖的能力。１９７６年由Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ发现并描
ＭＳＣｓ向移植肺的趋化现象。方法全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠ＭＳＣｓ，流式细胞法检测细胞表型。观察
包括细胞形态学、生长曲线在内的生物学特征。通过定向诱导ＭＳＣｓ向成骨和成脂肪分化鉴定其多向分化潜能。
发现ＭＳＣｓ在肺缺血再灌注损伤、急性心肌梗死、急性肝功能损伤、脑梗死等组织损伤修复方面，优势
显著。］。目前研究发现ＭＳＣｓ具有分化为脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肝细胞以及神经细胞等多种类型细胞的潜能，已成为重要的组织工程种子细胞。本实验对ＭＳＣｓ进行分离培养及表型鉴定，并应用ＤＡＰＩ和ＧＦＰ双重标记观察其能否趋化到同种异体移植肺内。

大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、鉴定与培养

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。

用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。

用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。

在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。

本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。

BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。

因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。

近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。

BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。

细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。

其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。

本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。

具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。

细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。

细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。

细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。

通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。

通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。

经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。

在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。

这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。

普通贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)及其生物特性研究

普通贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）及其生物特性研究作者：吴春朋张潜方宁刘金伟刘祖林章涛来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第03期【摘要】目的：建立从大鼠骨髓分离、培养间充质干细胞的标化流程，并探讨BMMSCs 生物学特性。

方法：无菌条件下剪取2～3周龄SD大鼠两侧完整股骨，采用D-PBS冲洗骨髓腔，含骨髓细胞的洗脱液经离心后收集细胞沉淀，用含10%FBS的LG-DMEM，于37ºC、5% CO2、饱和湿度环境下进行BMMSCs原代培养，每2 d换液1次，同时洗脱未贴壁的血细胞；当BMMSCs生长汇合度达60%～70%时，按2～5×105/ml细胞密度进行传代培养。

采用流式细胞术对第3代BMMSCs进行CD45、CD29和CD90表型分子检查。

结果：分离纯化的BMMSCs具有典型MSCs特征，高表达CD90和CD29，不表达CD45；结论：表明普通贴壁法成功分离培养了具有间充质干细胞表型特征的大鼠BMMSCs【关键词】间充质干细胞；大鼠【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0044-02引言研究表明，骨髓含有造血干细胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多种成体干细胞。

EPCs主要分化为血管内皮细胞，有助于血管疾病组织的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潜力的特点，研究表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化为成骨、软骨、心肌、肌腱、上皮、内皮等几乎所有三胚层类型细胞的能力[1-3]，基于这个特性使BMMSCs成为了中药诱导、临床移植及一些分子生物学实验的种子细胞源。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和外源基因的导入

维普资讯
山盘医药０７２０年第４卷第２７期
大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和外源基因的导入
王晓军崔连群。李，，４东省科技大学）山
［摘要］目的探讨绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞的可行性。方法采用ＦｃｌＰｑｅＰｕ淋巴ｉｌａｕｌ１ｓ０— ￣
ｔｅｘａｄｄｂｕｃｌｒｕｃｓｉｅｙＴｈｒｈｌｇｓｏｓｒｅｔｈｓｃｎｒｓｃｏｃｐ．Ｔｈｈｎｅｐｎｅｙｓｂｕｔｅｓｃｅｓｖｌ．ｕｅｍｏｐｏｏｙｗａｂｅｖｄｗｉｈｐａｅｏｔａｔｍｉｒｓｏｅｅ
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大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、鉴定与培养

用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。

不同周龄大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的对比研究

不同周龄大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的对比研究于波;赵劲民;苏伟;李晓峰;许国杰【摘要】目的:寻求大鼠周龄对骨髓间充质干细胞体外培养的影响,并进行细胞形态学观察和表面分子鉴定.方法:分别对1,4,8周龄SD大鼠采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记物.结果:全骨髓贴壁法能有效的获得大鼠骨髓间充质干细胞,以梭形细胞为主,细胞集落呈鱼群状或放射状排列.传代至第3代以后能获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,表面分子鉴定CD44、CD90呈阳性表达,CD34、CD45呈阴性表达.原代及传代细胞的融合时间相比较,小周龄BMSCs较大周龄BMSCs明显缩短.细胞培养达80％融合时间:原代细胞依次为(5±0.7),(7.8±0.8),(10.2±1.1)d,第3代细胞依次为(3.8±0.4),(5.2±0.5),(6±0.7)d,结果均有明显差异(P＜0.05).结论:1,4,8周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞经多代传代培养后,1周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞较4周龄和8周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞能维持更好的细胞状态和细胞活性.应用1周龄SD大鼠进行全骨髓贴壁法分离体外培养骨髓间充质干细胞,能更经济、更快捷、更高效地为组织工程研究提供数量充足、状态良好的种子细胞.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(031)002【总页数】4页(P197-200)【关键词】骨髓间充质干细胞;原代培养;周龄【作者】于波;赵劲民;苏伟;李晓峰;许国杰【作者单位】广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R-33骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)来源于中胚层，具有分裂增殖和多向分化潜能，在适宜条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞和神经细胞等，在组织工程、基因治疗、细胞移植等领域被广泛应用。

大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性

大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性曹华;高建华;刘小龙;林思思【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2017(021)009【摘要】背景：如何能简便高效地获得均质性的骨髓间充质干细胞群是软骨组织工程研究的重点。

目的：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,观察其生物学特性。

方法：抽取30只SD大鼠股骨以及胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法体外分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪测定细胞表面标记物的表达,细胞计数法观察细胞生长增殖能力,MTT法检测细胞存活率。

结果与结论：（1）刚分离培养的细胞呈圆形、椭圆形,部分细胞呈三角形,接种12-15 d后,细胞开始融合,传代后细胞增殖速度加快,传代2 h后细胞均匀分布在瓶底;（2）随着传代次数的增加,细胞增殖能力出现下降趋势,第1-5代细胞存活率均超过95%,显著高于第6代和第7代（P〈0.05）;（3）骨髓间充质干细胞表面CD34呈阴性表达,CD44呈阳性表达;（4）结果表明,采用全骨髓贴壁法可有效分离大鼠骨髓间充质干细胞,获得的细胞生长稳定,增殖能力强,可选用前5代细胞作为软骨组织工程的种子细胞。

【总页数】5页(P1357-1361)【作者】曹华;高建华;刘小龙;林思思【作者单位】[1]江西医学高等专科学校,江西省上饶市334000;[2]南昌大学医学部,江西省南昌市330006【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.骨髓间充质干细胞分离鉴定及在糖尿病大鼠肾脏保护中的机制研究 [J], 康岩;李志杰;王丽娜;郭玉卿;刘璠;张洁2.大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定及免疫调节性能初探 [J], 张志强;刘义;李克秋;李光3.大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性 [J], 曹华;高建华;刘小龙;林思思4.大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定及其在胶质瘤治疗中的作用 [J], 刘辉;张鹏幸;范菲艳;刘楠;任东妮;张永生;涂艳阳5.不同分离及培养方法对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖和生物学特性的影响 [J], 贾贵清;张明鸣;杨平;程惊秋;陆燕蓉;伍晓汀因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法的比较及细胞鉴定

ＹｏｎｇｃｈｕａｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０２１６０，Ｃｈｉａｎ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｔｏｃｕｌｔｕｒｅｒａｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙ —
第３６卷第１Ｏ期
２０１３年１０月
新疆医科大学学报
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ＶｏＩ．３６Ｎｏ．１０Ｏｃｔ．２Ｏ１３
的表达率。结果２种培养方法所获得的细胞形态均呈长梭形，呈特征性的漩涡状生长。全骨髓培养法细胞增
殖较快。全骨髓培养法获得的细胞表面标志ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５的表达率分别为９１．０、４．３、８７．１、０．１；密度梯度离心法获得的细胞表面标志ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５的表达率分别为９６．９、３．６、８９．７、
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｒａｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｃｅｌｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ０ｎ

大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养

４ｈ８时观察贴壁细胞以分散方式和克隆方式生长，以后克隆逐渐增大，首次传代的细胞为成纤维细胞样细胞。经过２３￣次传代培养，细胞融合生长时，呈放射状或旋涡状生长。２．２骨髓间充质干细胞的形态４ｈ８换液后，倒置显微镜观察，贴壁细胞约有６％的细胞呈梭形、０多边形、星形，这３细胞梭形细胞最多，传代１２后贴壁细胞分布种￣ｄ均匀细胞形态以梭形为主。
１．．１实验动物１
１２￣个月龄Ｓ大鼠一只，Ｄ体质量８￣０ｇ０１０，泸州医学院实验动物中
心提供。
１．．２主要试剂１ＤＭＥＭ高糖培养基（ＩＣ公司），０２％胰酶（ＩＣＧＢＯ．５ＧＢＯ公司），胎牛血清（ｙｌｅ司）。ＨＣｏ公ｎ１．．３主要仪器１
细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等中胚层细胞分化。【关键词】间充质干细胞；骨髓；培养；Ｓ大鼠Ｄ
中图分类号：Ｑ６４２
文献标识码：Ｂ源自文章编号：１７－１４（０２１０８— ２６１８２１）２— ｏ６０９
版）００４４：７ —３８，１，（）１４１５．２０６
ｐｏｉｒｔｎＪＪｉｌｈｍ，０，８（５：１ —９６ｒｌｅｉ［．Ｂｏｅ２９４１）９７９２．ｆａｏ］Ｃ０２９［】ＳａｋｅｎＭ， ’ ｅｌＬ，ｕｅａｄＫ，．ａｅｃｔｎ９ｈｃｌｔＯＲｉｙＡＳｔｒｎＤｅａＩｉｄａｔｉｏｌｈｌｔ１ｍｐｒｌａｏ

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性

宾
（１青岛大学医学院，东青岛２６０；岛市立医院；山６０３２青３即墨市中医医院；
胞特性，保持细胞活性。证实密度梯度离心结合贴壁法以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓ＭＳｓ培养并Ｃ，的细胞具有骨髓ＭＳｓ的基本表型和特性。本研究可为临床进行细胞移植奠定基础。Ｃ
二抗，３置７ｌＣ反应３ｉ免疫荧光组化染色。② ０ｒｎ行ａ
透射电镜观察：集第２骨髓ＭＳｓ１５０ｒｒｉ收代Ｃ．０／ｎａ
离心１ｎ得到的细胞应用２５戊二醛前固定．５ｍｉ，．４
１１材料１月龄雄性Ｓ大鼠１只（岛市立医．Ｄ青院实验动物基地提供，重１２ｇ。置相差显微镜体０）倒（ｙｕＯｌｍｐｓ公司）３Ｃ、Ｏ２温培养箱（ｅａｕ，７Ｃ恒Ｈｒｅｓ公司）离心机（ｒｃｓ司４０，Ｈｅａｕ公０Ｅ型）超净工作台，（京半导体设备厂）透射电镜（Ｅ北，ＪＣ公司）荧光共，聚焦显微镜（ｙｕＯｌｍｐｓ公司）ＭＥ培养基（ — 。ＤＭＨｙ
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山东医药２００７年第４７卷第５期
大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性
张承韶杨利民，其亮王希强。王，张，，４泰山医学院）

大鼠骨髓间充质干细胞的无血清培养与鉴定

大减少。（４）交互作用。由以上因素的交互作用引起的问题有：在僵化的课程考试制度下，教师将教学工作看做是学生在一定时间内完成某种教材的学习，考出高分；而在班级人数较多的情况下，要使教学工作顺利、如期完成，教师往往先把教材整理成有条不紊的知识体系再传授给学生，而非提出开放性的问题
［４】路振富．日本医学院校ＰＢＬ－Ｔ模式在我校口腔解剖生理教学中的应用［Ｃ】．第六次全国口腔医学教育学术会议暨２００７年国际口腔医学教育研讨会论文汇编，２００７．【５】杜鹃，柯道平，孔德虎，等．ＰＢＬ教学法在生理学实验教学中的应用探ｉ－，ＪＩ．１］。基础医学教育，２０１１（１０）：２６ — ２８．
医科大学，２００７．
从结构层面来看，有以下因素可能会成为ＰＢＬ教学小组合作的障碍：班级人数太多，教室空间太小，实验经费有限，课程考试制度僵化。“ 一人开讲、众人听讲 ” 的传统讲授式教学虽然具有
经济、有效的特点，但使创新教学及师生合作学习的可能性大
血清组的４６．４％，两组差异有显著性。结论无血清培养基的条件能较好地使细胞处于ＧｄＧ。期，保持更好的分化潜能及干
细胞特性。
关键词：骨髓间充质干细胞；无血清培养；细胞培养；流式细胞仪
中图分类号：Ｇ４２４．３１
文献标识码：Ｂ
近年来研究发现，ＭＳＣｓ还可以分化为神经元、神经胶质细胞、

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及向脂肪细胞分化的实验研究

爬片显示约有６骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。结论Ｏ
导分化为脂肪细胞。
大鼠骨髓间充质干细胞能进行体外分离培养并能诱
【关键词】骨髓细胞；问充质干细胞；脂肪细胞；细胞分化【中图分类号１Ｒ２．３９２【文献标识码】Ａ
ＥｐｒｍｅｔｏｆｅｅｔａｉｎｏｔＢｎａｒｗｅｅｃｙａｔｍｌｓｉｔｉｏｙｅｘｅｉｎｆＤｉｆｒｎｉｔｏｆＲａｏｅＭｒｏＭｓｎｈｍｌｅＣｅｌｎｏＡｄｐｃｔＳ
ｃｎａｎｎｅａｅｈｓｎｎｓｌｒＴｈｎｄｆｒｎｉｄｃｌｒｅｉｃｔｄｂｕａＶｔｉｏｔｉｉｇｄｓｍｔａｏｅａｄｉｕｉｅｉｅｅｔｎｒｆａｅｅｓｗｅｅｉｎｆａｅｙＳｄＩｓａｒｌｄｔｉｎ＿Ｒｅｕｔｓｌｓ
ｍａｒｗ．ｕｔｒｄａｄｐｓａｅ．ｒｏｃｌｅｎａｓｇｄＭＣｒｎｕｅｏｄｆｅｅｔｔｎｏａｉｏｙｅｎｉｄｃｉｎｍｅｉｍｕｓｗｅｅｉｄｃｔｉｒｎｉｅｉｄｐｃｔｓｉｎｕｔｄｕｄｆａｔｏ
ｔｅ１ｔａｆｅｅｎｎｕｅ，ｐｒｘｍａｅｙ６ｒｔｈ２ｈｄｙａｔｒｂｉｇｉｄｃａｐｏｉｔｌ０ｄａＭＣｓｗｅｅｉｄｃｔｄｐｇｎｃｃｌ￣Ｃｉｕｉｎｒｎｕｅｏａｉｏｅｉｅｌｄｓｏ￣ｓｏＣｓｃｎｃｌｒｎｉｅｅｔｔｔｄｐｃｔｓｉｉ．ａｕｔｅａｄｄｆｒｎｉｅｉｏａｉｏｙｅｖｔｕｆａｎｎｒｏ

骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学鉴定

实验动物中心）。
１２方法．
１２１大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养将．．ＳＤ大鼠处死后，菌条件下取出大鼠股骨和胫骨，无
用ＰＳ冲出骨髓，Ｂ充分混匀后，１按：２比例缓慢加在比重为１０３ｅｃｌ分离液上，０ｒｍ离心．７ｐｒｏ１２００ｐ３ｍｉ，０ｎ吸取液面交界处的单个核细胞，糖ＤＭ低ＭＥ培养液洗涤２次。将上述细胞以１ｘ１ｍｌ／密度接０种于含１％胎牛血清的ＤＭ—Ｇ培养基（ｍ谷０ＭＥＬ２Ｍ氨酰胺、Ｏｕｍ青霉素、０ｕｍｌ霉素）２ｃｌＯ／ｌ１０／链的５ｍ培养瓶中，于３ ℃ 、和湿度、％Ｃ培养箱中置７饱５Ｏ进行原代培养，培养７ｈ后首次换液，２以后每３天换
甘凤英肖丽霞，，陈彬娟叶德富，
（．１赣南医学院第一附属医院风湿免疫科；．２赣南医学院第一附属医院内分泌科，江西赣州３１０４００；３江西省莲花县人民医院，．江西莲花３７０；．３１０４福建医科大学第一附属医院风湿科，福建福州３００）５０６摘要：目的：建立体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞（Ｃ）ＭＳｓ的方法，描述ＭＳｓ的生物学特征，Ｃ探索ＭＣ作为组织工程种子细胞的可行性。方法：Ｓｓ采用密度梯度离心法结合贴壁培养法，离纯化大鼠ＭＳｓ分Ｃ。利用流式细胞仪检测细胞表面标志物ＣＩ、Ｄ９Ｃ３、Ｉ、Ｄ０Ｄ４Ｃ２、Ｄ４ＣＭ５Ｃ１５的表达率。取第４代ＭＳｓＣ进行成骨、成脂肪、成软骨诱导分化，观察细胞的形态变化情况，在诱导第１ｄ４进行茜素红染色和油红染色以检测ＭＳｓＣ是否分化成骨和脂肪细胞；在诱导第２ｄ用阿新蓝染色法检测ＭＳｓ否分化成软骨细胞。结果：骨髓分离获得的ＭＳｓ１Ｃ是从Ｃ为体积小、核浆比大、呈旋涡状生长的梭形细胞。第３代细胞表面标记物阳性率分别为Ｃ１０６％，Ｄ９Ｄ４：．７Ｃ２：９．％，Ｄ４０７％，Ｄ５０３％，Ｄ０：６３％。ＭＣ在相应的诱导条件下，化成骨、肪、４５Ｃ３：．２Ｃ４：．９Ｃ１５８．６Ｓｓ分脂软骨细胞。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法可分离出较纯的ＭＳｓ经扩增培养后获取足够数量的ＭＳｓ能满足组织工Ｃ，Ｃ，程的需要。ＭＳｓＣ具有多向分化的潜能，可在体外诱导分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，有广阔的应用前具景。关键词：骨髓问充质干细胞；软骨；；骨脂肪