用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响
生物化学实验报告
一、实验目的：1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项；2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法；3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；4、掌握酶蛋白分离提纯的原理；5、掌握酶的比活力测定及其计算方法；6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法；7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。
称量技术：1、了解电子天平的用途2、了解电子天平的工作原理3、掌握电子天平的使用方法4、掌握电子天平使用前后的注意事项离心技术：1、了解离心机的基本原理和用途2、了解离心机的类型和用途3、了解离心机的型号和控制版面4、掌握离心机的使用方法5、掌握离心机使用的注意事项层析技术：1、了解层析技术的基本原理2、了解层析技术的分类情况3、了解各种层析技术的原理4、掌握凝胶层析技术光谱分析技术：1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理2、了解仪器结构和分类3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项电泳技术：1、了解电泳的基本原理2、了解电泳的类型3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理4、掌握垂直板电泳的操作技术5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术6、了解转移电泳的基本原理和操作方法7、了解双向电泳的基本原理和操作方法二、实验原理：1、蔗糖酶的提取：①酵母菌的基本特征：单细胞，椭圆形、圆形或柱形。
长5-30μm，宽1-5μm。
②生物材料破碎方法：（1）机械（匀浆）法①研钵②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。
③高速组织捣碎机（0.5-1L）将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
④高压匀质机（XL）高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。
20 各因素相互影响的正交试验法
各因素相互影响的正交试验法
正交试验法是一种常用的多因素试验设计方法，用于评估各因素之间的相互作用。
它通过选择正交表来安排试验，以最小化实验次数并获得全面的结果。
以下是正交试验法的步骤：
1. 确定需要评估的因素：首先确定你想要研究的因素，这些因素可能包括产品配方、生产工艺、环境条件等。
2. 确定每个因素的水平：根据实验设计原则，为每个因素选择一个或多个水平。
水平通常分为三个等级，例如高水平、中水平和低水平。
3. 安排试验：使用正交表来安排试验。
正交表是一种特殊的表格，用于选择试验组合，以最小化实验次数并充分利用可用的资源。
4. 实施试验：按照正交表中的指示进行试验，收集数据并记录结果。
5. 分析结果：根据收集的数据，分析各因素之间的相互作用。
你可以通过查看每个因素的贡献、计算每个因素的加权得分、绘制交互图等方式来进行分析。
6. 优化决策：基于分析结果，你可以做出优化决策或建议，以改进产品配方、生产工艺或环境条件等。
正交试验法的优点包括：
1. 减少了实验次数，提高了效率。
2. 可以全面分析各因素之间的相互作用，从而获得更全面的结果。
3. 可以使用统计方法来评估结果的显著性，从而更准确地确定哪些因素对结果有显著影响。
请注意，正交试验法是一种高级实验设计方法，需要一定的统计学知
识才能正确应用。
如果你不熟悉实验设计方法，建议寻求专业人士的帮助。
实验操作指导书：pH对蔗糖酶活动性的影响
（五）pH对蔗糖酶活动性的影响酶的生物学特性之一是它对酸碱度的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境pH 的影响。
pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。
各种酶在特定条件下都有它各自的最适pH。
在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其它条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横座标，反应速度为纵座标作图。
由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适PH。
酶溶液pH值之所以会影响酶的活性，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态，而酶只有处于一种特殊的解离形式时才具有活性，例如：H＋H＋EH2＋＋EH E－pKa1 (有活性) pKa2酶的活性部位有关基团的解离形式如果发生变化，都将使酶转入“无活性”状态。
在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适合于酶与底物的作用。
此外，缓冲系统的离子性质和离子强度也会对酶的催化反应产生影响。
蔗糖酶有两组离子化活性基团，它们均影响酶水解蔗糖的能力。
其解离常数分别是pKa = 7和pKa =3 。
实验方法：1.按下表配制12种缓冲溶液（公用）：将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。
2. 准备二组各12支试管，第一组12支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然后加入一定量的蔗糖酶（此时的蔗糖酶只能用H2O稀释，酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到0.6~1.0的光吸收值（A650））。
另一组12支试管也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。
所有的试管都用水补足到0.8ml。
3. 所有的试管按一定时间间隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L)开始反应，反应10min后分别加入1.0ml碱性铜试剂，用保鲜膜包住试管口并剌一小孔，在沸水浴中煮8分钟，取出速冷，分别加入1.0ml磷钼酸试剂，反应完毕后加入5.0ml水，摇匀测定A650。
实验九 用正交法测定几种因素对蔗糖
3）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9 （34 ）、 L27（313 ）、L18 （36×6）和L27（38×9）。本实验不考察各 因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3 的的四个因素，故选用L9（34）表，见表2。 分析： A. 判断各因素的水平范围是否选偏； B. 判断各因素显著性大小的顺序； C. 判断实验结果的置信度。 4）实验安排:根据因素和各因素的水平条件设计实验。 （见表3）
思 考 题
1.正交试验设计法与简单比较法及全面试验 法相比较，有何优缺点？ 2.设计实验方案时应遵循什么原则？
数据的计算整理（举例） 数据的计算整理（举例）
因素 水平 1 A 温度 （ ℃） 20 ℃ K1 和 R 35 ℃ K2 和 R 50 ℃ K3 和 R B pH值 值 2.5 K1 和 R 4.5 K2 和 R 6.5 K3 和 R C 底物浓度 （ml） ） 0.10 K1 和 R 0.3 K2 和 R 0.6 K3 和 R D 酶浓度 （ml） ） 0.02 K1 和 R 0.06 K2 和 R 0.1 K3 和 R
具体操作步骤： 具体操作步骤：
1、将已配制好的三种不同pH的0.2mol/L的缓冲液于试管中。 将已配制好的三种不同pH的 pH mol/L的缓冲液于试管中。 的缓冲液于试管中 将酶粉用蒸馏水溶解（适当体积10 30ml不等） 10- ml不等 2、将酶粉用蒸馏水溶解（适当体积10-30ml不等），离心去 除不溶物，10,000rpm/min,10min, rpm/min,10min,4 除不溶物，10,000rpm/min,10min,4℃。 酶活预示实验，确定酶的稀释倍数。 3、酶活预示实验，确定酶的稀释倍数。（可根据产物稀释的 倍数来确定酶的稀释倍数） 之间即可。 倍数来确定酶的稀释倍数）A520在0.4-2.0之间即可。 准备10支试管。其中一支为“ 10支试管 号管， 4、准备10支试管。其中一支为“0”号管，作为测量时的参 比溶液。其他九支试管根据前面的图表3 比溶液。其他九支试管根据前面的图表3加入相关的溶 液，分别在不同的条件下进行酶反应。利用二硝基水杨酸 分别在不同的条件下进行酶反应。 的方法测定不同管在A 下的光密度值。 的方法测定不同管在A520下的光密度值。 计算同一因素不同水平的级差，级差小代表离散度小， 5、计算同一因素不同水平的级差，级差小代表离散度小， 表示该水平为酶反应的最适条件。 表示该水平为酶反应的最适条件。
正交实验法就是利用排列整齐的表
正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。
正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。
正交实验设计包括两部分内容：第一，是怎样安排实验；第二，是怎样分析实验结果。
目录试验方法正交实验法举例编辑本段试验方法我们知道如果有很多的因素变化制约着一个事件的变化，那么为了弄明白哪些因素重要，哪些不重要，什么样的因素搭配会产生极值，必须通过做实验验证(仿真也可以说是实验，只不过试验设备是计算机)，如果因素很多，而且每种因素又有多种变化(专业称法是：水平)，那么实验量会非常的大，显然是不可能每一个实验都做的。
能够大幅度减少试验次数而且并不会降低试验可行度的方法就是使用正交试验法。
首先需要选择一张和你的实验因素水平相对应的正交表，已经有数学家制好了很多相应的表，你只需找到对应你需要的就可以了。
所谓正交表，也就是一套经过周密计算得出的现成的实验方案，他告诉你每次实验时，用那几个水平互相匹配进行实验，这套方案的总实验次数是远小于每种情况都考虑后的实验次数的。
比如3水平4因素表就只有9行，远小于遍历试验的81次；我们同理可推算出如果因素水平越多，试验的精简程度会越高。
建立好实验表后，根据表格做实验，然后就是数据处理了。
由于试验次数大大减少，使得试验数据处理非常重要。
首先可以从所有的实验数据中找到最优的一个数据，当然，这个数据肯定不是最佳匹配数据，但是肯定是最接近最佳的了。
这是你能得到一组因素，这是最直观的一组最佳因素。
接下来将各个因素当中同水平的实验值加和(注:正交表的一个特点就是每个水平在整个实验中出现的次数是相同的)，就得到了各个水平的实验结果表，从这个表当中又可以得到一组最优的因素，通过比较前一个因素，可以获得因素变化的趋势，指导更进一步的试验。
蔗糖酶生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。
2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。
3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。
4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。
- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。
- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。
2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。
- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。
2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。
4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。
- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。
- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。
1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。
3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。
七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
正交试验的定义
正交试验的定义
正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。
正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。
正交实验设计包括两部分内容：第一，是怎样安排实验；第二，是怎样分析实验结果。
《混凝剂和混凝技术》共分9章，主要介绍了混凝的基本理论、无机混凝剂、合成有机高分子絮凝剂、天然高分子改性絮凝剂、混凝的工艺与设备，以及混凝技术在微污染原水、城市污水及工业废水处理中的应用等方面的内容。
全书力求做到理论与实践有效结合，同时反映当前国内外的研究成果和发展趋势，具有较强的技术性和实用性。
用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响
生化实验的方法--用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响1．正交试验设计法的基本思想正交试验设计法，就是使用已经造好了的表格--正交表--来安排试验并进行数据分析的一种方法。
它简单易行，计算表格化，使用者能够迅速掌握。
下边通过一个例子来说明正交试验设计法的基本想法。
[例1]为提高某化工产品的转化率，选择了三个有关因素进行条件试验，反应温度(A)，反应时间(B)，用碱量(C)，并确定了它们的试验范围：A：80-90℃B：90-150分钟C：5-7％试验目的是搞清楚因子A、B、C对转化率有什么影响，哪些是主要的，哪些是次要的，从而确定最适生产条件，即温度、时间及用碱量各为多少才能使转化率高。
试制定试验方案。
这里，对因子A，在试验范围内选了三个水平；因子B和C也都取三个水平：A：Al＝80℃，A2＝85℃，A3=90℃B：Bl＝90分，B2＝120分，B3=150分C：Cl＝5％，C2＝6%，C3＝7%当然，在正交试验设计中，因子可以是定量的，也可以是定性的。
而定量因子各水平间的距离可以相等，也可以不相等。
这个三因子三水平的条件试验，通常有两种试验进行方法：(Ⅰ)取三因子所有水平之间的组合，即AlBlC1，A1BlC2，A1B2C1，……，A3B3C3，共有33=27次试验。
用图表示就是图1 立方体的27个节点。
这种试验法叫做全面试验法。
全面试验对各因子与指标间的关系剖析得比较清楚。
但试验次数太多。
特别是当因子数目多，每个因子的水平数目也多时。
试验量大得惊人。
如选六个因子，每个因子取五个水平时，如欲做全面试验，则需56＝15625次试验，这实际上是不可能实现的。
如果应用正交实验法，只做25次试验就行了。
而且在某种意义上讲，这25次试验代表了15625次试验。
图1 全面试验法取点..........(Ⅱ)简单对比法，即变化一个因素而固定其他因素，如首先固定B、C于Bl、Cl，使A 变化之：↗A1B1C1 →A2↘A3 (好结果)如得出结果A3最好，则固定A于A3，C还是Cl，使B变化之：↗B1A3C1 →B2 (好结果)↘B3得出结果以B2为最好，则固定B于B2，A于A3，使C变化之：↗C1A3B2→C2 (好结果)↘C3试验结果以C2最好。
浙江大学生物化学实验甲用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响PPT课件
• 我们常常需要考察各因素对实验影响的情况，但在多因素、多水平试验中，如果对每个因素的每个水 平都互相搭配进行全面试验，需要做的试验次数就会很多。
• 比如对两个7水平的因素，如果两因素的各个水平都互相搭配进行全面试验，要做72=49次试验， • 而3个7水平的因素要进行全面试验，要做73=343次试验。 • 作这么多次试验，要花费大量的人力、物力，还要用相当长的时间，显然是非常困难的。
水平就均出现几次） ➢ b、任何两列中，横行组成的数对出现的次数相等，均出现一次（这里有9个不同的数对，均出现一
次），即（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3， 2）、（3，3）各出现一次。
第9页/共19页
用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影
响
• 以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析 数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。
分钟（显色反应）。 • 取出后立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入5ml蒸馏水，摇匀，测A540值。
第13页/共19页
用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影 响
• 2、非酶对照管（调零用） • 另取试管一支作非酶对照管（调零用）， • 先加入蔗糖酶溶液0.5ml ， • 再加入蒸馏水2.0ml，摇匀后沸水中加热10min让酶变性失活， • 再加入5%蔗糖溶液0.5ml，65℃保温10分钟。 • 然后向管中加入1.0ml 3.5-二硝基水杨酸试剂（碱性终止酶促反应，同时为显色剂），沸水中加热5分
• 试验次数n=q（t-1）+1
• 本试验选用四因素，每个因素选三个水平，因此可选用正交表L9（34）。 4、在所选的正交表上进行表头设计
蔗糖酶活力测定
一、目的了解植物组织中提取蔗糖酶的方法，掌握蔗糖酶活力测定的原理。
二、原理本实验以Nelson 方法测定酶活力，其原理是：蔗糖酶可将非还原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖作为还原糖含有的自由醛基，在碱性溶液中将Cu 2+ 还原，还原糖本身被氧化成羟酸；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物（砷钼蓝），在510nm 波长下有正比于还原糖浓度的光密度，从而确定蔗糖酶的活力，该法测定的范围为25~200μg。
三、主要仪器及试剂四、操作步骤1．标准曲线制作（1）取9 个具塞试管，按表1 加样：（2）向每管中加1mL Nelson 试剂，盖上塞子，置沸水浴中20 min。
冷至室温，向每管中加1 mL 砷钼酸试剂。
（3）5 min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，混匀。
（4）在510 nm 下测定光密度，以还原糖葡萄糖为横坐标，以OD510nm 值为纵坐标，制作标准曲线。
2．酶活力测定取2g 小麦苗，加入2mL 乙酸缓冲液，在冰浴中用研钵研磨成糊状，12 000r/min 离心10min，留取上清液用于酶活测定。
取2 支具塞刻度试管，向每个试管中加入乙酸缓冲液0.8ml，0.5 mmol/L 蔗糖溶液0.2mL，适当稀释的酶液1mL，以同样处理但不加酶液者为空白对照，室温下放置10min。
然后向每管中加1mL Nelson 试剂，置沸水浴中20min。
冷却至室温，向每管中加1mL 砷钼酸试剂，5min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，510 nm 下比色，测定光密度OD510nm。
五、实验结果活力计算：在室温、pH4.5 条件下，每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量，定义为酶的1 个活力单位（U）酶活力的影响教师：XXX实验类型：基础学时：10(参考)内容：一、实验目的初步掌握用正交表设计实验方案并用数理统计方法处理实验数据的步骤和注意事项。
二、实验原理酶的催化作用受多种因素的影响。
欲求某因素对酶活力的影响，通常是固定其它因素，测定该因素不同水平下的酶活力。
实验五-影响酶活力的因素
用正交法测定几种因素对酶活力的影响实验目的：1 掌握正交法的原理2 用正交法测定几种因素对于酶活力的影响实验原理：酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等都能影响酶的反应速度。
这种多因素的实验可通过正交法即用—特制的表格——正交表来安排试验，计算和分析实验结果。
这样就能通过少量实验取得较好的效果。
实践证明正交法是一个多、好、快、省的方法，目前已广泛用于农业生产和科学实验中。
本实验运用正交法测定酶浓度、温度、PH值这三个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、温度和pH值时酶的活性最大。
实验设计原理：实验器材：试管1.5cm*15cm X30吸管5.0ml X1洗耳球X1漏斗X10恒温水浴锅X3紫外可见分光光度计X1烧杯实验所需药品：1. 2%血红蛋白液：于20ml蒸馏水中加入血红蛋白2.2g，尿素36g，1mol/L NaOH溶液8ml，室温放置1h，使蛋白质变性。
过滤除去不溶物，再加0.2ml/L NaH2PO4溶液至110ml及尿素4g，调节溶液pH达到7.6左右。
2. 15%三氯醋酸溶液：15g三氯醋酸溶于蒸馏水，并稀释至100ml。
3. 牛胰蛋白水解酶：3mg牛胰蛋白水解酶冷冻干粉，溶于10ml蒸馏水。
4. 0.04ml/L pH7 8 9巴比妥缓冲溶液5. Folin-酚试剂A：溶液。
将1g Na2CO3溶于50ml 0.1mol/L NaOH溶液。
另将0.5gCuSO4·5H2O溶于100ml 1%酒石酸钾溶液。
将前者50ml与硫酸铜-酒石酸钾溶液1ml 混合。
混合后的溶液一日内有效。
6. Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠，25g钼酸钠，700ml蒸馏水，50ml 85%磷酸及100ml浓盐酸至于1500ml磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回流10h。
再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml以及液溴数滴，开口煮沸15min，驱除过量的溴。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验报告
课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________ 同组学生姓名：
一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得
用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响
一、实验目的和要求：
1. 初步掌握正交试验设计法的使用；
2. 运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH 值这四种因素对酶活力的影响。
二、
实验内容和原理：
酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、 pH 值、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。
通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活性测定求得该因素的影响，这是单因素的试验方法。
对于多因素的试验可以通过正交试验设计法来完成。
正交法是借助于正交表，简化的表格计算，正确分析结果，找到实验的最佳条件，分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。
本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH 值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH 值时酶的活性最大。
正交表 Ln （ tq ） L —— 正交表的代号
n —— 处理数（试验次数） t —— 水平数 q —— 因素数
合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度。
本实验中：
试验次数 n = q( t –1 )+1= 4（3－1）+1＝9
总自由度 V 总= n-1
专业：
姓名： 学号： 日期： 地点：
装
订 线
各列自由度V列= K（该列水平数）–1
本实验选用四个因素，每个因素选三个水平，四个因素各占一列，那么四个因素的自由度分别为：
V1 = 3–1 = 2，V2 = 3–1 = 2，V3 = 3–1 = 2，V4 = 3–1 = 2。
四个因素的自由度总和= V1 + V2 + V3 + V4 = 8
因为各因素自由度总和是8，它没有超过L9（34）的总自由度= 9–1 = 8。
所以选择正交表L9（34）是适合的。
正交表都应具有以下两个特性：
（1）在每一列中，各水平出现的次数相等。
即在任何一列中，数字1和数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）。
（2）任何两列中，横行组成的数对出现次数相等，均出现一次
以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。
三、实验材料与试剂：
1、实验材料
蔗糖酶溶液（样品Ⅳ1:10稀释）
2、实验试剂
⑴5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）；
⑵0.2mol/L乙酸缓冲液，pH3.6、4.6、5.6；
⑶3,5－二硝基水杨酸试剂。
四、实验器材与仪器：
1. 试管及试管架；
2. 吸量管；
3. 恒温水浴箱（37℃、50℃、65℃、100℃）；
4．可见光分光光度计。
五、操作方法和实验步骤：
1、实验设计
（1）确定试验因素和水平
本实验取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH值。
每个因
素选三个水平，实验因素和选用水平如表1。
表1 因素、水平表
水平
因素
【S】
（ml）
【E】
（ml）
温度
（℃）
pH
1 0.5 1.0 50 3.6
2 0.2 0.6 37 5.6
3 0.8 0.2 65 4.6 （2）选择合适的正交表
（3）在所选的正交表上进行表头设计
表2 表头设计
实验号水平
因素
1
【S】
2
【E】
3
温度
4
pH
1 1 1 1 1
2 1 2 2 2
3 1 3 3 3
4 2 1 2 3
5 2 2 3 1
6 2 3 1 2
7 3 1 3 2
8 3 2 1 3
9 3 3 2 1
2、试验安排
表3 实验安排表
试剂
试验号
2 4 9 1 6 8
3 5 7 5%蔗糖溶液（ml）0.5 0.2 0.8 0.5 0.2 0.8 0.5 0.2 0.8
0.2mol/L乙酸缓冲液（ml）pH5.6
1.0
pH4.6
1.0
pH3.6
1.0
pH5.6
1.0
pH4.6
1.0
pH3.6
1.0
pH5.6
1.0
pH4.6
1.0
pH3.6
1.0
蒸馏水（ml）0.9 0.8 1.0 0.5 1.6 0.6 1.3 1.2 0.2
37℃预温5min 50℃预温5min 65℃预温5min
蔗糖酶溶液（ml）0.6 1.0 0.2 1.0 0.2 0.6 0.2 0.6 1.0 温度（℃）37℃反应10min 50℃反应10min 65℃反应10min DNS （ml） 1 1 1 1 1 1 1 1 1
沸水浴5min
蒸馏水（ml） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 A520nm
另取试管一支作非酶对照：加5%蔗糖溶液0.5ml，缓冲液1.9ml。
先加DNS 1ml摇匀室温放
置5分钟后再加入蔗糖酶溶液0.6ml摇匀室温放置10分钟，100℃×5min，再加入蒸馏水5ml，混匀后在520nm处测光密度值。
六、实验数据记录和处理：
实验号水平
因素
1
【S】ml
2
【E】ml
3
温度（℃）
4
pH值
实验结果
A520nm
1 1 0.5 1 1.0 1 50 1 3.6
2 1 0.5 2 0.6 2 37 2 5.6
3 1 0.5 3 0.2 3 65 3 4.6
4 2 0.2 1 1.0 2 37 3 4.6
5 2 0.2 2 0.
6 3 65 1 3.6
6 2 0.2 3 0.2 1 50 2 5.6
7 3 0.8 1 1.0 3 65 2 5.6
8 3 0.8 2 0.6 1 50 3 4.6
9 3 0.8 3 0.2 2 37 1 3.6
I（一水平实验结果总和）
II（二水平实验结果总和）
III（三水平实验结果总和）
I/3
II/3
III/3
极差
分析表格中的数据可知：
各因素对酶活力影响程度的大小为
且蔗糖酶反应的最佳条件为：
七、实验结果与分析：
八、讨论、心得：
1、为了使得反应液的OD值在一个比较合适的范围内，可以先做一组预实验，预实验的各个因素都应该是理论上的最佳条件，测得的OD值最好在1.6左右，假如OD值过高或者过低，则调整蔗糖酶溶液浓度。
2、试剂加样应准确，各管反应时间一定要一致，加入DNS应该摇匀，以达到完全终止酶促反应的目的。
3、在测定吸光值的时候，要将各样品液摇匀，并且要设置一非酶对照，而不能取蒸馏水作为对照。
4、在进行数据处理时要仔细，避免出错。