药品无菌检测技术中培养基的灭菌控温技术方法

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无菌技术基础操作方法

无菌技术基础操作方法
无菌技术是一种重要的实验室操作方法，用于防止微生物的污染和传播。

以下是一些基础的无菌技术操作方法：
1. 预热培养皿和培养基：将培养皿和培养基在高温下进行预热，以杀灭可能存在的微生物。

通常在121C高压下进行15-20分钟的蒸气灭菌。

2. 消毒工作区：使用消毒剂如酒精或漂白水彻底清洁工作台面。

确保所有工作区和设备都是无菌的。

3. 洗手消毒：在进行任何无菌操作之前，要使用洗手液或消毒剂洗手并进行彻底的手部消毒。

4. 穿戴适当的无菌装备：穿戴手套、口罩和实验室服，并确保它们是无菌的。

5. 开烧杯或试管盖：在操作前，应用酒精灯或火机加热杯盖或试管盖，以减少无菌操作时可能附着在盖子上的微生物。

6. 打开培养皿或试管时注意：在开启培养皿或试管盖时，应尽量避免接触到空气中的微生物。

可以通过倾斜培养皿或试管，并迅速打开。

7. 无菌传递：使用的工具如移液器、开烧杯等应经过灭菌处理，并且在操作过
程中应尽量不碰触无菌物。

8. 快速操作：尽量减少操作时间，以减少微生物悬浮于空气中的时间。

9. 培养皿/试管的密封：在操作完成后，及时将培养皿或试管盖封闭，以避免外界污染。

10. 废弃物的处理：将已使用的无菌物品或实验废弃物进行适当封装和处理，以防止微生物的传播。

以上是基础的无菌技术操作方法，但实际操作中还需根据具体情况和实验要求进行相应的调整和改进。

培养基的配制及灭菌

培养基的配制及灭菌培养基的配制及灭菌一．实验目的1.三角瓶，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒等仪器的清洗。

2.三角瓶棉塞的制作，三角瓶，吸管，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒的包装与灭菌。

3.高温蒸汽灭菌原理的学习。

4.LB和MacConkey培养基的制作与灭菌。

二．实验原理1.高温灭菌的原理：由于培养基配置过程中并非是无菌操作，所以要通过立即灭菌来防止配制过程中混入的杂菌利用培养基中的营养物质进行繁殖从而破坏培养基的性能。

高压蒸汽灭菌是生物试验应用最广，效果最好的一种湿热灭菌法。

在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。

在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。

在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意：①使用高压蒸汽灭菌前一定要完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。

否则在同一压力下，锅内实际温度和理想温度就会有差距，不能达到最好灭菌效果。

②在使用灭菌锅前切勿忘记加水，水加至与三角搁架相平，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

③使用完后要等到压力降为零再打开锅盖，否则会因为锅内外压力不平衡而导致棉塞蹦出造成污染，也容易伤害到操作者。

2.培养基的配置原理：微生物的生长依赖于可利用的营养物质和适宜的生长环境。

培养基是用于培养，转移，贮存微生物的固体，半固体或液体的营养物质。

培养基中含有微生物所需的全部营养物质，包括碳源、氮源、能源、无机盐、水分和生长因子。

适宜的pH对微生物的生长是必不可少的。

培养基的物理状态有三种：液体、半固体和固体。

这些培养基的主要区别是在固体和半固体培养基里面加了固化剂------琼脂。

当将琼脂加入溶液中时，在98℃能融化成有一定粘性的液体。

并在42℃凝固。

琼脂具有的特性有：不易被微生物降解；接近无色等。

对于固体培养基需要加入琼脂量约为 1.4%~1.6%，半固体培养基加入约0.6%~0.8%。

培养基在配制过程中容易受到污染，因此必须进行灭菌，同时不能将培养基中的营养物质破坏。

培养基和设备的灭菌

培养基和设备的灭菌在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？1由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降；3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化；4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败；5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，等等工业上具体的措施：1.使用的培养基和设备须经过灭菌2.好氧培养中使用的空气应除菌处理3.设备应严密，发酵罐维持正压环境4.培养过程中，加入的物料应经过灭菌5.使用无污染的纯粹种子一、灭菌的原理和方法消毒与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。

消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。

一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。

例如，用于消牛奶、啤酒和酿酒原汗等的巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的物料中的微生物营养细胞。

灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。

消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。

1、化学试剂灭菌法:化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 ; 适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒2、射线灭菌法：电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱3、干热灭菌法 ;常用烘箱，灭菌条件为在160℃下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿4、湿热灭菌法 :利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121℃，30min适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌例：高压灭菌锅5、过滤除菌法 :利用过滤方法阻留微生物适用范围：制备无菌空气6、火焰灭菌法 :火焰 :适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口、酒精灯二、培养基的灭菌湿热灭菌原理：由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。

培养基质量控制

培养基质量控制标题：培养基质量控制引言概述：培养基是微生物学实验中不可或者缺的重要物质，其质量控制直接影响到实验结果的准确性和可靠性。

因此，对培养基的质量进行严格控制是非常重要的。

本文将从培养基的选择、制备、贮存、消毒和使用等方面进行详细介绍。

一、培养基的选择1.1 选择基础成份：根据微生物的需求选择合适的碳源、氮源、矿物盐等基础成份。

1.2 添加生长因子：根据微生物的生长特性，添加适量的生长因子，如维生素、氨基酸等。

1.3 调节pH值：保持培养基的pH值在适宜范围内，通常为7.0摆布，可通过添加缓冲液进行调节。

二、培养基的制备2.1 材料准备：准备好所需的各种原料和试剂，确保其质量符合要求。

2.2 按比例混合：按照配方比例将各种基础成份、生长因子等混合均匀。

2.3 消毒灭菌：将混合好的培养基进行高压蒸汽灭菌或者过滤灭菌，确保无菌状态。

三、培养基的贮存3.1 温度控制：将制备好的培养基保存在4℃摆布的冰箱中，避免高温或者受潮。

3.2 防光保鲜：避免暴露在阳光下，尽量保存在阴凉干燥处，避免光照导致培养基变质。

3.3 定期检查：定期检查培养基的外观温和味，确保无明显变质迹象。

四、培养基的消毒4.1 灭菌方法：选择合适的灭菌方法，如高压蒸汽灭菌、紫外线灭菌等。

4.2 消毒时间：控制好消毒时间，确保灭菌效果，同时避免对培养基中的营养成份造成破坏。

4.3 消毒环境：在无菌条件下进行培养基的消毒处理，避免二次污染。

五、培养基的使用5.1 温度控制：在适宜的温度条件下使用培养基，保持微生物的生长活力。

5.2 湿度控制：避免培养基过度干燥或者受潮，影响微生物的生长。

5.3 使用时限：尽快使用制备好的培养基，避免长期贮存导致培养基质量下降。

总结：培养基的质量控制是微生物实验中至关重要的一环，通过选择合适的基础成份、严格制备、科学贮存、有效消毒和正确使用，可以确保培养基的质量稳定，为实验结果的准确性和可靠性提供保障。

培养基（料）的消毒灭菌

培养基（料）的消毒灭菌培养基（料）的消毒灭菌一、培养基（料）的灭菌方法食用菌培养基（料）的消毒灭菌是指对培养基（料）中的微生物进行杀灭，它是对食用菌纯培养的必要条件，一般采用热力灭菌、拌药消毒等方法。

1、热力灭菌热力灭菌是利用高温使菌体蛋白变性，从而失去活性，达到灭菌的目的。

热力灭菌常采用湿热灭菌的方法对培养基质进行灭菌，因为热蒸汽的穿透力强，蛋白质的凝固点随含水量的增加而降低。

根据采用不同的仪器、温度、时间及压力指标分为高压蒸汽灭菌、常压灭菌、常压间歇灭菌、发酵杀菌（巴氏消毒）等方法。

①高压蒸汽灭菌即将灭菌物置于密封的高压锅内，利用加压高温蒸汽在较短的时问内达到彻底灭菌的方法。

一般液体培养基在1公斤／平方厘米的压力下，处理20～30分钟，温度约为121℃。

对固体培养基，如木屑、棉籽壳、谷粒、粪草等，必须在1.5公斤／平方厘米的压力下，处理1～2小时，温度约为128℃，才能达到满意的灭菌效果。

使用高压锅的步骤为：加水至水位线→装锅→加盖→加热升温→压力至0.5公斤／平方厘米时，打开排气阀排除锅内冷空气，压力降至0，排气阀有大量热蒸汽冲出时，关闭排气阀→继续升温，压力升至规定指标，温度达到规定指标时，开始调火稳压规定时间→灭火→降压→开盖→取物。

②常压灭菌常压灭菌将灭菌物置于常压灭菌锅内，以自然压力的蒸汽进行灭菌的方法。

常压灭菌灶的建造方法根据各地习惯而异。

常压灭菌的时间通常以见冒大气（100℃）开始计算，一般维持8～10小时。

灭菌时注意不要将灭菌物排得过密，以保证灭菌锅内的蒸汽流通。

开始要求以旺火猛攻，使灭菌灶内的温度尽快上升至100℃，中途不能停火，经常补充热水以防蒸干。

此法的优点是建灶成本低、容量大，但灭菌时间长、能源消耗量大。

③常压间歇灭菌在没有高压灭菌设备的条件下，或对一些不宜用100℃以上温度而又须杀灭其中的细菌芽孢的物质的灭菌，可采用此法。

具体做法是：将培养基或其他灭菌物置于灭菌锅里，经100℃的热蒸汽30～120分钟，杀死细菌的营养体，然后将灭菌物取出，置于25～30℃条件下培养24小时，诱发其中残留的芽孢萌发成营养体，再放入灭菌锅内灭菌30分钟，以杀死新萌发的营养体。

培养基灭菌温度与时间的选择

培养基灭菌温度与时间的选择作者：赵德胜韩文清张明斗来源：《价值工程》2010年第05期摘要: 用湿热灭菌方法对培养基灭菌时,加热的温度和时间对微生物死亡和营养成分的破坏均有作用。

由于培养基营养成分的破坏和菌体死亡都属于一级动力学反应,其反应速度常数与温度的关系皆可用阿累尼乌斯方程式表示;由此公式导出,当灭菌温度上升时,微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。

所以采用高温快速灭菌方法,即可达到杀死培养基中的全部有生命的有机体,又可减少营养成分的破坏。

Abstract: When damp heat is used in medium sterilization, heating temperature and time are both the roles of on the microbial death and the destruction of nutrients. As the nutrient medium of destruction and the microbial death all pertains to A kinetics, the reaction rate constant with temperature could be expressed by Arrhenius equation; derived from the formula, when the sterilization temperature rises, the increasing microbial kill rate is greater than the increasing destruction rate of medium components. Therefore, high-temperature fast sterilization method, will not only meet the medium to kill all living organisms, but also reduce the destruction of nutrients关键词: 菌体死亡速率常数;培养基成分的破坏速率常数;高温快速灭菌Key words: bacterial death rate constant;rate constants of the destruction of culture medium composition;rapid high-temperature sterilization中图分类号:Q93-3 文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)05-0205-020引言绝大多数工业发酵是需氧的纯种发酵,因此,所使用的培养基、各种设备和附件以及通入罐内的空气均须彻底灭菌,这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。

培养基及无菌操作检测

培养基及无菌操作检测一、培养基培养基是用于培养和繁殖微生物的一种均质物质。

它提供了微生物生长所需的营养物质和环境条件。

培养基的种类繁多，根据不同的需求可以选择不同的培养基。

1.基本培养基：基本培养基可以支持大多数微生物的生长。

常见的基本培养基有葡萄糖琼脂培养基、肉汤培养基和大肠杆菌培养基等。

2. 选择性培养基：选择性培养基通过添加特定的抑制剂或诱导剂来选择性地培养其中一种或几种特定的微生物。

例如，大肠杆菌用MacConkey琼脂培养基，能选出革兰阴性菌。

3.差异培养基：差异培养基可以通过其中一种指示剂的变化来区分不同的微生物。

例如，革兰氏染色后，革兰阳性菌染成紫色，而革兰阴性菌染成红色，可以用来区分不同的菌株。

无菌操作检测是用于确保实验环境和实验物品的无菌状态，以避免微生物污染并保证实验结果的准确性和可靠性。

1.空气检测：空气中的微生物是实验室中最常见的污染源之一、可以使用空气采样器或空气意器进行采样，然后将采样物培养在琼脂培养基上，通过菌落计数或形态学鉴定，来检测空气中的微生物数量和种类。

2.高压蒸汽灭菌器检测：高压蒸汽灭菌器是常用的无菌操作设备，用于对实验器皿、培养基和试剂进行灭菌处理。

使用有色孢子检测器可以检测高压蒸汽灭菌器的灭菌效果，确认灭菌温度和时间是否达到标准要求。

3.培养基质量检测：培养基的质量直接关系到微生物的生长情况。

可以通过菌落计数法、倒置培养法、加试剂法等方法来测定培养基的质量，确保培养基无菌和营养成分的完整性。

4.器皿和器械检测：在无菌操作中，实验器皿和器械都需要经过灭菌处理，然后进行使用。

可以使用平板法或搅拌法将器皿和器械表面刮取样品，然后进行培养和生长，通过菌落计数或形态学鉴定来检测器皿和器械的无菌状态。

5.人员手部检测：人员的手部是微生物传播的重要渠道。

可以使用手部采样器或手部印迹板进行采样，然后在琼脂培养基上培养，通过菌落计数或形态学鉴定来检测手部的微生物污染情况。

培养基的灭菌

培养基的湿热灭菌
4、灭菌温度的选择在培养基灭菌过程中，除了杂菌死亡，还伴随着培养基成分的破坏。因此必须选择伴随着培养基成分的破坏。因此必须选择既能达到灭菌目的，既能达到灭菌目的，又能使培养基的破坏降低至最低的工艺条件。降低至最低的工艺条件。许多实验研究结果表明，培养基在高温灭菌的过程中，其营养成分的破坏在很大程度上可以用一级反应来描述其反应速度：
培养基的湿热灭菌
（一）热灭菌的原理 1、微生物的热阻在这里先讲几个概念：致死温度：杀死微生物的极限温度。 ①致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下， ②致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。微生物的热阻：表示微生物对热的抵抗能力， ③微生物的热阻：表示微生物对热的抵抗能力，即指微生物在某一特定条件下（主要是温度）的致死时间。物在某一特定条件下（主要是温度）的致死时间。其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。相对热阻： ④相对热阻：某一微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。例如：芽孢/ 另一微生物在相同条件下—5/1等。大肠杆菌=3000000/1；病毒/大肠杆菌=1—5/1等。
培养基的湿热灭菌
2、对数残存定律微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程： -dN/dt = k * N 式中，N 残存的活菌数；t 灭菌时间（s）；K 式中，N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速度常数（s 度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt— 此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt— 活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。该方程称为对数残存活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。该方程称为对数残存定律，定律，表示微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比。正比。

微生物培养基常见的灭菌方法

微⽣物培养基常见的灭菌⽅法在发酵过程中，培养基灭菌主要有以下⼏个原因：如不灭菌，会使⽣物反应的基质或产物，因杂菌的消耗⽽损失，造成⽣产能⼒的下降;杂菌也会产⽣代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降;杂菌⼤量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常;有些杂菌会分解产物，使⽣产失败;如果发⽣噬菌体污染，⽣产菌细胞将被裂解，使⽣产失败。

常见的灭菌⽅法1、化学物质灭菌原理：药物与微⽣物细胞中的成分反应，使蛋⽩质变性酶失活。

使⽤范围：器⽫、双⼿和实验室、⽆菌室的环境灭菌，不能⽤于培养基灭菌。

常⽤的灭菌剂：甲醛 37%、戊⼆醛 2%、⾼锰酸钾 0.1%~0.25%、苯酚 0.1%~0.15%、漂⽩粉 5%、过氧⼄酸 0.02%~0.2%、酒精 75%、焦碳酸⼆⼄酯 0.01%~0.1%、煤酚皂(来苏尔) 1%~5%2、辐射灭菌辐射灭菌的原理是利⽤⾼能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。

常⽤的有紫外线、X射线和γ射线。

⽤于室内空⽓及器⽫表⾯灭菌。

3、⼲热灭菌灭菌原理是利⽤⾼温对微⽣物有氧化、蛋⽩质变性和电解质浓缩作⽤⽽杀灭微⽣物。

常⽤灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2⼩时。

适于对玻璃及⾦属⽤具及沙⼟管灭菌。

4、湿热灭菌灭菌原理是直接⽤蒸汽灭菌，蒸汽在冷凝时能释放出⼤量潜热，蒸汽具有强⼤的穿透⼒，破坏菌体蛋⽩和核酸的化学键，使酶失活，微⽣物因代谢障碍⽽死亡。

⽔煮常压灭菌：100℃。

或饱和蒸汽灭菌：⼀般121℃，30分钟。

适合培养基和发酵设备灭菌。

5、过滤除菌除菌原理是利⽤微⽣物不能透过滤膜除菌。

⽅法是使⽤0.01~0.45 mm孔径滤膜，⽤于压缩空⽓、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。

在⼯业⽣产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采⽤蒸汽加热到⼀定的温度，并保温⼀段时间的灭菌⽅法，称之为湿热灭菌。

湿热灭菌的显著优点是：使⽤⽅便，⽆污染，⽽且其冷凝⽔可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。

培养基的灭菌

3 热致死反应的速度常数K
K是表达微生物耐热性的特征常数，与微生物的种类和灭菌温度有关。K越小，微生物越耐热
E
K A e RT
• 式中 ΔE为菌体死灭反应的活化能（J/mol），它是菌体死灭反应的特征常数，所以，不同菌其热死灭反应的ΔE不同。
反应的△E越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K 的影响越大
1 湿热灭菌法
借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。优点：1）蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒
2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底 3）蒸汽均有很大的潜热，冷凝后的水分有利于湿热灭菌 4）蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易缺点：1)设备费用高 2）不能用于怕受潮的物料灭菌
三分批式灭菌
典型的分批灭菌全过程包括升温、保温、降温三个过程
四连续灭菌流程：
连续灭菌：采用专一灭菌设备-连消塔，在高温下对液体培养基进行短时间加热灭菌
优点：（1）培养基受热时间短（可在20~30s达到预定灭菌温度），营养成分破坏少；(2)质量均匀；（3）适应与制动控制。
适用条件：大规模生产，培养基中不含有固体颗粒或泡沫较少
积分边界条件：N0→Nθ；t0=0
N dN
N N0
K

d
ln
N
0
N0
K N
N0 eK
ln N K ln N0 K 1 ln N0
N0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
N
K N
式中，θ 灭菌时间（s）； N0 灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个）； Nθ 经过灭菌时间θ后，残存的活菌数（个）。

药品无菌检测中培养基灭菌控温的方法验证

药品无菌检测中培养基灭菌控温的方法验证【摘要】本文对药品无菌检测中培养基灭菌控温验证方法进行研究。

【关键词】药品；无菌；验证无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法[1-5]。

无菌检查全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及生长素和水等[6-10]。

本文对药品无菌检测中培养基灭菌控温验证方法进行研究。

1.验证目的本次验证主要进行的运行、性能确认，以确认本设备能够达到工艺技术要求并满足GMP要求。

2.验证范围适用于化验室立式压力蒸汽灭菌柜的验证。

3.验证相关文件及资料（1）相关文件及资料：药品生产质量管理规范（2010年修订）、立式压力蒸汽灭菌柜使用说明书。

（2）所需仪器、设备：EBRO无线温度检测仪。

（3）所需试剂：嗜热脂肪杆菌指示剂。

4.法规标准要求（1）设备的设计与安装应符合药品生产及工艺的要求，安全、稳定、可靠，易于清洗、消毒或灭菌，便于生产操作和维修保养，并能防止差错和交叉污染。

（2）用于生产和检验的仪器、仪表、量具、衡器等其适用范围和精密度应符合生产和检验要求，有明显的合格标志，并定期校验。

（3）压力容器应具有法律部门认可的各项设计、制造、检测、使用等许可证和报告。

5.验证实施5.1人员培训（1）目的：使生产相关人员掌握相关操作规程及工艺规程。

（2）程序：对验证实施有关人员进行灭菌罐验证方案培训、灭菌罐操作规程培训。

（3）可接受标准：上岗操作人员已经接受了方案及操作规程培训，并经考核合格后方可上岗。

5.2运行确认（OQ）5.2.1灭菌罐盖运行可控（1）目的：检查并确认灭菌罐盖运行可控。

（2）程序：抬起灭菌罐盖，关闭灭菌罐盖，此过程重复三次。

（3）灭菌罐盖密封圈目测外观（4）可接受标准：灭菌罐盖开合正常。

无菌检查法检技术与方法

无菌检查法检技术与方法
无菌检查法是一种常用的微生物检测方法，用于确定物体或环境是否存在可生长的微生物。

以下是无菌检查法的一般技术与方法：
1. 准备工作：在进行无菌检查之前，需要准备无菌培养基、培养器具（如平皿、试管等）以及所需的无菌工具（如火焰灭菌器、无菌棉签等）。

2. 灭菌操作：使用火焰灭菌器将培养器具和工具进行灭菌处理，以确保无菌状态。

3. 取样：将待检物体或环境样品采集到无菌容器中，避免外界微生物的污染。

4. 培养基接种：将采集到的样品通过无菌棉签或无菌工具划取，均匀涂布于无菌培养基的表面。

5. 培养：将涂布好的培养基平皿或试管密封好，放入恒温培养箱中，以适当的温度和时间进行培养。

6. 观察和计数：在培养一定时间后，观察培养基表面是否有生长的微生物，如菌落的形成。

可以使用显微镜观察细菌的形态。

7. 结果分析：根据观察到的菌落形态、颜色、大小等特征，结合相关标准和文献，确定是否存在可生长的微生物。

需要注意的是，无菌检查法的具体步骤和条件可能因检测对象的不同而有所变化。

同时，为了确保检测结果的准确性，无菌
操作、培养条件和培养基的选择都至关重要。

在进行无菌检查时，应严格遵守相关的操作规范和实验室安全要求。

怎样进行培养基灭菌

怎样进行培养基灭菌在发酵过程中，培养基灭菌主要有以下几个原因：如不灭菌，会使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降;杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降;杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常;有些杂菌会分解产物，使生产失败;如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。

怎样进行培养基灭菌?湿热灭菌培养基灭菌大多数用湿热灭菌。

衡量热灭菌的指标很多，最常用的是“热死时间”，即在限定的温度下杀死原有微生物中一定比例所需的持续时间。

影响热灭菌的温度和时间的因素很多，包括：微生物种类、性质、浓度和培养基的性质、浓度等。

(1)连续灭菌连续灭菌也叫连消，其温度一般以126～132 ℃为宜，总蒸汽压力要求达到0.044～0.049 MPa以上。

培养基采用连续灭菌时，需在培养基进入发酵罐前，直接用蒸汽进行空罐灭菌(空消)，用无菌空气保压，待培养基流入罐后，开始冷却。

灭菌时对培养基的加热可采用各种加热器。

培养基的冷却方式有喷淋冷却式、真空冷却式、薄板换热器式几种方式，其过程均包括加热、维持和冷却。

(2)间歇灭菌间歇灭菌即实消，是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。

实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。

其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备十分耐压，则可采用较高的温度，但必须注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的部位。

高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌适合于耐高温培养基、接种器械和蒸馏水的灭菌。

培养基在制备过程中混入各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24h内完成灭菌工作。

灭菌时一般是在0.105MPa压力下，温度121℃时，灭菌15~30min即可。

消毒时间不宜过长，也不能超过规定的压力范围，否则有机物质特别是维生素类物质就会在高温下分解，失去营养作用，也会使培养基变质、变色，甚至难以凝固。

对培养基灭菌的方法

对培养基灭菌的方法一、物理灭菌法（一）加热灭菌法：加热可破坏微生物中酶、蛋白质和核酸，导致微生物死亡。

加热灭菌又分干热灭菌法和湿热灭菌法。

在同一温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好。

主要是因湿热灭菌时，有水分存在，蛋白质容易变性。

水分又易使微生物膜壁润湿，湿热的穿透力比干热大。

干热灭菌法常用的有火焰灭菌法与干热空气灭菌法两种。

（二）紫外线灭菌法：是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。

一般用于灭菌的紫外线波长是200～300nm，灭菌力最强的波长是253.7ｎｍ。

紫外线作用于核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。

紫外线进行直线传播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水。

因此本法适用于照射物体表面之灭菌、无菌室的空气及水的灭菌；不适用于药液的灭菌、固体物质深部的灭菌；普通玻璃可吸收紫外线，因此装于玻璃容器中的药物不能用此法灭菌。

紫外线对人体照射过久，会发生结膜炎，红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在人入室前开启紫外线灯1～2小时，关闭后人才进入洁净室。

如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌，则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。

一般在6～15m3的空间可装置30瓦紫外线灯一盏，离地面2.5～3m 为宜。

用紫外线照射灭菌时要注意下列问题：紫外线的杀菌力，随使用时间增加而减退，一般使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管，以保证杀菌效果。

国产紫外线灯平均寿命一般为2000h。

紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40～50倍。

紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计，室内湿度增加时，照射量应相应增加。

紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关，这需要通过验证来确定照射时间。

紫外照射灯的安装形式及高度，应根据实际情况，参考使用说明决定。

灭菌方法的验证采用生物指示剂挑战试验，生物指示剂多用枯草芽孢杆菌。

（三）微波灭菌法：微波是指频率在30～3000MHz之间的电磁波。