生化大实验实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳PPT课件
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聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有 较高的平衡浓度。
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对 数的线性关系。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)
是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸
银（银离子）还原成金属银，以使银 颗粒沉积在蛋白带上。
（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定
3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线 形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部 分冷却不好。
分离胶聚合之后
（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而 改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充 分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合 物。
《血清蛋白的分离》PPT课件
2.加样
将 电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的上.下 槽中（注意需没过玻璃管的上下端），用微量注 射器通过缓冲液在每个玻璃管的凝胶表面加约5ul 的样品
3.电泳
将样品端(上槽)接直流稳压电泳仪的负极，下槽接 直压电泳仪的正极。开始时电流控制在1-2mA/管， 待样品进入分离胶时，将电流调至5mA 左右/管。 当蓝色染料迁移至距离玻璃管下缘1-2cm 左右时， 停止电泳。将缓冲液回收至试剂瓶中（注意正负 极分开回收）。
形成时有一水平面，在室温中放置，当两界面
出现不同折射率是表明已凝胶，将分离胶上层
的水倒去，再用滤纸吸去多余的水（注意不要
碰破胶面），为下一步做准备。
(3) 浓缩胶制备（同垂直板）：
按垂直板的方案进行配制，配制好后，立
即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上 端约1cm，然后放于日光灯下10 分钟左右浓 缩胶就开始凝胶，30~50 分钟左右凝好（凝缩 胶变为乳白色为准）。
2.加样
将 Tris—甘氨酸电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳 装置的左、右槽中，短玻板一侧要稍微超过玻板， 长玻板一侧只要越过电泳丝的高度。
用微量注射器通过缓冲液在每个加样凹槽中加入 约5ul的样品。
3.电泳
将样品端(短玻璃的一边)接直流稳压电泳仪 的负极，接通冷却水，开始电泳。
开始时电流控制在10mA，待样品进入分离 胶时，将电流调至30mA左右。当蓝色染料 迁移至距离橡胶框下缘琼脂界面处0.5cm 左右时，电泳完成。
实验步骤
一、垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.凝胶的制备：
（1）安装夹心式电泳槽 将长短玻璃板分别插到U形硅橡框的凹
形槽中（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），在 长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内加入已 融化的1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼 脂糖（其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应 避免有气泡），琼脂凝固后，将硅胶橡框装入 电泳槽内，以对角线的方式将螺丝帽旋紧。
动物医学 生化实验《实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)》课件
实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS–PAGE）
【原理】
带电的颗粒（蛋白质）在电场的作 用下发生迁移，移动的速度决定于各蛋 白质的带电量和自身分子的大小。若使 各蛋白质成分的带电量相近似时，则各 蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋 白质成分自身分子的大小 。
SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键， 使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白 质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合形成 SDS–蛋白质复合物。由于SDS解离后带有很强的 负电荷，致使SDS–蛋白质复合物都带上了相同密 度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有 的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质同原有的 电荷差异。SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质 原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似 椭圆柱形。
【 操 作】 （一）安装夹心式垂直板电泳槽 （二）配胶及凝胶板的制备 1．配胶： 分离胶（浓度为15％）
水 凝胶贮液
1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8 10％SDS 10%过硫酸铵 TEMED 总计
4.6ml 10ml 5.0ml 0.2ml 0.2ml
8 uL 20ml
2．凝胶板的制备：用细长头滴管将胶混 合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离 短玻璃板上缘0.5cm处，插入梳形样品 槽模板 。大约30min胶聚合，继续放置 20~30min后 ，小心拔出梳形样品槽模 板 ，将凝胶板装入电泳槽中。
在电泳槽中倒入电极缓冲液，连接 电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接 正极。打开电源，待染料前沿迁移至距 硅橡胶框底边1~1.5cm处，停止电泳 。
Байду номын сангаас
（五）凝胶板剥离与固定
电泳结束后，取凝胶板，卸下硅橡胶 框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板 ， 将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液， 固定10min 。
【原理】
带电的颗粒（蛋白质）在电场的作 用下发生迁移，移动的速度决定于各蛋 白质的带电量和自身分子的大小。若使 各蛋白质成分的带电量相近似时，则各 蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋 白质成分自身分子的大小 。
SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键， 使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白 质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合形成 SDS–蛋白质复合物。由于SDS解离后带有很强的 负电荷，致使SDS–蛋白质复合物都带上了相同密 度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有 的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质同原有的 电荷差异。SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质 原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似 椭圆柱形。
【 操 作】 （一）安装夹心式垂直板电泳槽 （二）配胶及凝胶板的制备 1．配胶： 分离胶（浓度为15％）
水 凝胶贮液
1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8 10％SDS 10%过硫酸铵 TEMED 总计
4.6ml 10ml 5.0ml 0.2ml 0.2ml
8 uL 20ml
2．凝胶板的制备：用细长头滴管将胶混 合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离 短玻璃板上缘0.5cm处，插入梳形样品 槽模板 。大约30min胶聚合，继续放置 20~30min后 ，小心拔出梳形样品槽模 板 ，将凝胶板装入电泳槽中。
在电泳槽中倒入电极缓冲液，连接 电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接 正极。打开电源，待染料前沿迁移至距 硅橡胶框底边1~1.5cm处，停止电泳 。
Байду номын сангаас
（五）凝胶板剥离与固定
电泳结束后，取凝胶板，卸下硅橡胶 框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板 ， 将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液， 固定10min 。
6第二节 PAGE-生化分析
第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Polyacylamide Gel Electrophoresis,PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和 交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵 ( 或 维 生 素 B2) 和 加 速 剂 四 甲 基 乙 二 胺 （TEMED）的作用下聚合，并联结成三维网 状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
SDS(十二烷基硫酸钠)
二、凝胶聚合的原理及有关特性 1．聚合反应
凝胶的聚合常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲 基乙二胺(TEMED)为加速剂。此外，核黄素亦可 为催化剂，聚合需光照，故使用不多。
2．凝胶的有关性质 （1）凝胶性能与总浓度及交联度的关系
凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、黏度和聚合程度取决 于凝胶浓度和交联度。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克 数称为凝胶浓度(T)。
1. 样品的浓缩效应
（1）凝胶层的不连续性
a. 样品胶：大孔胶，样品预先加在其中，起防止对流的 作用，避免样品跑到上面的缓冲液中。（目前电泳一 般不制作）
b. 浓缩胶：大孔胶，有防止对流作用，样品在其中浓缩， 并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上 积聚成薄层。
c. 分离胶：小孔胶，样品在其中进行电泳和分子筛分离。 蛋白质分子在大孔径凝胶中受到的阻力小，移动速度 快，进入小孔胶时遇到阻力大，速度减慢。由于凝胶 的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品 浓缩，区带变窄。
T(%)=[Acr(g)+Bis(g)]/V(ml)×100% 凝胶溶液中，交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度(C)。
C(%)=Bis/(Acr+Bis)×100%
(2) 凝胶浓度与孔径的关系
(Polyacylamide Gel Electrophoresis,PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和 交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵 ( 或 维 生 素 B2) 和 加 速 剂 四 甲 基 乙 二 胺 （TEMED）的作用下聚合，并联结成三维网 状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
SDS(十二烷基硫酸钠)
二、凝胶聚合的原理及有关特性 1．聚合反应
凝胶的聚合常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲 基乙二胺(TEMED)为加速剂。此外，核黄素亦可 为催化剂，聚合需光照，故使用不多。
2．凝胶的有关性质 （1）凝胶性能与总浓度及交联度的关系
凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、黏度和聚合程度取决 于凝胶浓度和交联度。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克 数称为凝胶浓度(T)。
1. 样品的浓缩效应
（1）凝胶层的不连续性
a. 样品胶：大孔胶，样品预先加在其中，起防止对流的 作用，避免样品跑到上面的缓冲液中。（目前电泳一 般不制作）
b. 浓缩胶：大孔胶，有防止对流作用，样品在其中浓缩， 并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上 积聚成薄层。
c. 分离胶：小孔胶，样品在其中进行电泳和分子筛分离。 蛋白质分子在大孔径凝胶中受到的阻力小，移动速度 快，进入小孔胶时遇到阻力大，速度减慢。由于凝胶 的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品 浓缩，区带变窄。
T(%)=[Acr(g)+Bis(g)]/V(ml)×100% 凝胶溶液中，交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度(C)。
C(%)=Bis/(Acr+Bis)×100%
(2) 凝胶浓度与孔径的关系
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
第29页/共53页
上样缓冲液 Loading buffer
第6页/共53页
第7页/共53页
一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
第22页/共53页
3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
动物医学 生化实验《实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)》课件
动物医学生化实验《实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)》课件一实验目的1.掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的基本原理和操作方法。
2学习蛋白质分离纯化和鉴定方法。
2.了解SDS-PAGE技术在动物医学研究中的应用。
二、实验原理SD-PAGE是蛋白质分离纯化和鉴定的一种常用方法，它利用蛋白质分子量大小的不同，在电场作用下，通过聚丙烯酰胺凝胶进行分离。
1. SDS的作用SDS是一阴离子表面活性剂，可以与蛋白质结合，使蛋白质分子解折叠并带负电荷。
由于SDS与蛋白质的结合比例与蛋白质分子量成正比，因此SDS可以使不同蛋白质分子带相同的电密度，从而消除蛋白质分子本身电荷差异对电泳的影响。
2. 聚丙烯酰胺凝胶的作用聚丙烯酰胺凝胶是一种多孔性物质，其孔径大小可以根据丙烯酰胺和交联剂的浓度进行调节。
蛋白质分在电场作用下通过凝胶，根据其分子量大小不同，在凝胶中迁移速度也不同，从而实现蛋白质的分离。
3. 电泳原理在电场作用下，带负电荷的蛋白质分子在凝胶中向正极迁移，分子小的蛋白质迁移速度快，分子量大的蛋白质迁移速度慢，最终在凝胶中形成不同的蛋白质条带。
三、实验材料1.试剂：o SDS（十二烷基硫酸钠）o Tris（三羟甲基氨基甲烷）o甘氨酸o丙烯酰胺o交联剂（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺）o TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）o过硫酸铵（APS）o考马斯亮蓝R-250o乙醇o醋酸o水o蛋白质样品2.仪器：o电泳槽o电源o微量移液器o烧杯o量筒o试管o培养皿o电泳仪o凝胶成像仪o其他实验室常用仪器四、实验步骤1. 凝胶的制备(1)制备分离胶* 根据需要分离的蛋白质分子量范围，选择合适的丙烯酰胺浓度。
o将丙烯酰胺、交联剂、Tris缓冲液、SDS、TEMED和APS混合，充分搅拌均匀。
o将混合液倒入电泳槽中，蒸馏水覆盖，静置使其聚合。
(2)制备浓缩胶：o将丙烯酰胺、交联剂、Tris缓冲液、SDS、TEMED和APS混合，充分搅拌均匀。
实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳
20-30 15-20
1-5×104-1×105 1×105 5×105
104 104–105 105-2×106
核酸(RNA)
10-15 5-10 2-5
15–20 5-10 2-2.6
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两 大类。
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图 2)，两者电泳原理完全相同。
当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率 超过蛋白质；
（c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 (3)电荷效应
图4 电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的
区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇 床
五、 操作方法
1.安装夹心式垂直板电泳槽
(1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。
(2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中， 注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃 板应面对上贮槽。
(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双 手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根) 有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)
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不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液 为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的 小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲 液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2 种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、 pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩 的主要因素。
实验八、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳
02
根据电泳槽的容积，配制适量的 电极缓冲液，用于维持电泳过程 中的稳定电场。
安装凝胶板和电极
将凝胶溶液倒入电泳槽中，用吸水纸吸干凝胶板的多余水分。 将凝胶板放入电泳槽中，确保凝胶板与电极接触良好。
加样和电泳
用移液管将样品加入样品槽中，注意 不要产生气泡。
连接电源，开始电泳，根据实验需求 调整电流和电压。
缓冲液
选择合适的缓冲液对于 保持电泳过程中的pH 稳定至关重要，从而确
保分离效果。
温度
温度对电泳的影响较小 ，但过高的温度可能导 致凝胶变形，影响分离
效果。
03
实验步骤
准备实验材料和器具
1 2
聚丙烯酰胺凝胶粉
用于制备凝胶溶液，根据实验需求选择合适的规 格和浓度。
电泳槽
用于电泳的容器，需选择合适的尺寸和规格。
染色与脱色
电泳结束后，将凝胶取出，进 行染色和脱色处理，使蛋白质
条带显现。
了解聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的应用
蛋白质分离
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳常用 于蛋白质的分离和纯化，可分离 出不同分子量和电荷的蛋白质。
疾病诊断
通过聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技 术对生物样品中的蛋白质进行分析， 有助于疾病的早期诊断和监测。
电泳分离效果的评价
分辨率评价
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的分辨率取决于凝胶的孔径和浓度，以及电泳条件。评价电泳分离效果时 ，应关注分辨率的高低。
重复性评价
为了确保实验结果的可靠性，需要评价电泳的重复性。可以通过多次重复实验，观察电泳谱带的重现 性来评价。
实验数据的处理和结果分析
数据整理
将电泳谱带的位置、宽度、亮度等信息进行整理，以便进一步分析。
结果分析
根据电泳槽的容积，配制适量的 电极缓冲液，用于维持电泳过程 中的稳定电场。
安装凝胶板和电极
将凝胶溶液倒入电泳槽中，用吸水纸吸干凝胶板的多余水分。 将凝胶板放入电泳槽中，确保凝胶板与电极接触良好。
加样和电泳
用移液管将样品加入样品槽中，注意 不要产生气泡。
连接电源，开始电泳，根据实验需求 调整电流和电压。
缓冲液
选择合适的缓冲液对于 保持电泳过程中的pH 稳定至关重要，从而确
保分离效果。
温度
温度对电泳的影响较小 ，但过高的温度可能导 致凝胶变形，影响分离
效果。
03
实验步骤
准备实验材料和器具
1 2
聚丙烯酰胺凝胶粉
用于制备凝胶溶液，根据实验需求选择合适的规 格和浓度。
电泳槽
用于电泳的容器，需选择合适的尺寸和规格。
染色与脱色
电泳结束后，将凝胶取出，进 行染色和脱色处理，使蛋白质
条带显现。
了解聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的应用
蛋白质分离
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳常用 于蛋白质的分离和纯化，可分离 出不同分子量和电荷的蛋白质。
疾病诊断
通过聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技 术对生物样品中的蛋白质进行分析， 有助于疾病的早期诊断和监测。
电泳分离效果的评价
分辨率评价
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的分辨率取决于凝胶的孔径和浓度，以及电泳条件。评价电泳分离效果时 ，应关注分辨率的高低。
重复性评价
为了确保实验结果的可靠性，需要评价电泳的重复性。可以通过多次重复实验，观察电泳谱带的重现 性来评价。
实验数据的处理和结果分析
数据整理
将电泳谱带的位置、宽度、亮度等信息进行整理，以便进一步分析。
结果分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
• 温度 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快， 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快， 而聚合的速度影响交联孔径的大小， 而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚 合时必须保持温度恒定， 合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温 度。 分子氧的存在会阻止碳链的延长， • • 分子氧 分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨 碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 • • 杂质 某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶 的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和 的化学聚合，所以应选择高纯度的 、 和 AP。 。
化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶， 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶， 重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 应选择合适的AP和 • 催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的 和 TEMED浓度使聚合时间控制在 浓度使聚合时间控制在30—60min内较好， 内较好， 浓度使聚合时间控制在 内较好 过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的 畸变。 畸变。 • pH TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在 只能以游离碱的形式发挥作用， 只能以游离碱的形式发挥作用 酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由 酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发 产生自由 基的过程会被延迟，聚合时间延长。 基的过程会被延迟，聚合时间延长。 •
凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响
• 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚 丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、 丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着 度及孔径大小的主要因素。 为凝胶溶液中单体和交联剂的 度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的 总质量浓度， 为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的 总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的 质量分数。 质量分数。
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
过氧化物酶染色原理
过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化 为蓝色或棕色产物
电泳装置
本实验采用不连续系统凝胶电泳，
整个电泳系统包括DYY型常压电泳
仪、夹心式垂直板电泳槽。
试剂
（1）1.5％琼脂 （3）分离胶缓冲液，pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) （5）浓缩胶缓冲液，pH6.7 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) （2）核黄素溶液 （4）电极缓冲液，pH8.3 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) （6）40％蔗糖溶液
实验4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析过氧化物酶同工酶
同工酶
• 电泳 是指带电粒子在电场中向与其自
身带相反电荷的电极移动的现象。
带负电粒子
正极
带正电粒子
负极
影响电泳速度的外界因素
1.电场强度
电场强度也称电位梯度，是指单位长度 （每一厘米）支持物体上的电位降 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速 度越快。 过高、过低均不宜 当需要增大电场强度以缩短电泳时间时， 需附有冷却装置
2．缓冲液的pH值和离子强度
pH 值距离其等电点愈远，其所带 净电荷量就越大，电泳的速度也 就越大
缓冲液通常要保持一定的离子强 度，一般所用离子强度为 0.020.2之间。
3.电渗现象
液体在电场中对于一个固体支 持物的相对移动，称为电渗现 象。
电渗方向影响泳动速率
4、温度的影响
温度每升高 1 ℃，迁移率约增加 2.4%。为降低热效应对电泳的影 响，可控制电压或电流，或在电 泳系统中安装冷却散热装置。
pH8.9
(a)
１、电荷效应：各种蛋白质按其所带电 荷的种类及数量，在电场向一定电极， 以一定速度泳动。
§4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以具有分离复 杂体系的功能是因为其设计上具有如下特点： 一、电泳系统多种不连续性 (1)凝胶浓度的不连续：凝胶在一个体系中被制成 不同浓度的浓缩胶和分离胶，导致凝胶孔径不同。 浓缩胶浓度低，属于大孔胶，电泳中蛋白质颗粒 泳动遇到的阻力小，移动速度快。浓缩胶只起浓 缩作用，无分子筛作用；分离胶浓度高，属于小 孔胶，蛋白质进入分离胶后遇到的阻力增大，移 动速度减慢，具有了分子筛效应。
§4. 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为 支持介质用于生物大分子分析的常用电泳技术之一， 适用于低分子质量蛋白质、小于1kb DNA片段及 DNA序列分析等。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯 酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide,Acr）和交联剂 N, N′-亚甲双丙烯酰胺〔CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N′-methylenebisacryl -amide，Bis〕聚合而成。
分离DNA分子范围/bp 凝胶浓度T% C=3.3% 双链 1000～ 2000 80～500 单链 凝胶浓度T% C=3.3% 分离DNA分子范围 /bp 双链
3.5
750～2000
12.0
40～200
5.0
200～1000
15.0
25～150
8.0
64～400
50～400
20.0
6～100
②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中， 达到更高的灵敏度：10-9 ～10-12 mol L-1。③由于 聚丙烯酰胺凝胶是由－C－C－键结合的酰胺多聚 物，侧链只有不活泼的酰胺基－CO－NH2，没有 带电的其它离子基团，化学惰性好，电泳时不会 产生“电渗”。
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SDS的作用
SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质 的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部 分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下， SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各 种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电 荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电 荷和形状的影响，电泳速度只与蛋白质的分 子量有关。
解离度)
当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其 有效迁移率超过蛋白质；
（c)电位梯度的不连续性：
(2)分子筛效应
(3)电荷效应
12
图4 电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的
区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
5
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不 溶；
(3)对pH和温度变化较稳定；
(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致， 则样品分离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)， 两者电泳原理完全相同。
8
图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
(A为正面,B为剖面)
(1)样品胶pH6.7
(2)浓缩胶pH6.7
(3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3
9
图2 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝
4
二、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和
交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N， N ， N ， N— 四 甲 基 乙 二 胺 (TEMED) 和 催 化 剂过硫酸铵(APS)或核黄素的作用下聚合交联 成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的 区带电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
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蛋白质染色
常用蛋白质染色的几种方法： 1）氨基黑10B 2）考马斯亮蓝R250 3）考马斯亮蓝 G250 4）固绿 5）荧光染料： （l）丹磺酰氯（2，5-二甲氨基萘磺酰氯，简称DNS-Cl）： （2）荧光胺： （3）2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮（MDPF）： （4）1-苯胺基-8-萘磺酸（简称 ANS）： 6）银染色法 常用脂蛋白染色方法： 1）油红O染色 2）苏丹黑 B
13
图5 不连续系统浓缩效应示意图
14
SDS － 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ SDSPAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时， 它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子 的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝 胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸 钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于它的分子量，而与所带电荷和形状 无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质 分子量。
(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度， 通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电
荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有
更高的分辨率。
6
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
6.上贮槽 7.冷凝系统
图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 橡胶框
2.长玻璃板 3.短玻璃板 4.凹形 返回
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不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是由APS催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液 为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由APS催化聚合而成 的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓 冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、 2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔 径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品 浓缩的主要因素。
纯度检测： 1.SDS-PAGE测定LDL纯度 2.双向免疫扩散测定LDL纯度
含量测定： 1.Folin-酚试剂法测定LDL含量
1
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分 析LDL纯度
2
一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电
泳（SDS-PAGE）分离蛋白质技术
3
电泳概述：
11
不连续凝胶分离蛋白质原理：
（1）样品浓缩效应
(a)凝胶孔径不连续性：
(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中
前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)
尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
m代cl表cl甘>m氨p酸p根>m)有G效G迁(C移l代率表=氯m根，，mP代为表迁蛋移白率质，，为G
电泳：带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极 移动，如带正电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。
影响电泳的主要因素： 1） 电泳介质的pH 2） 缓冲液的离子强度 3） 电场强度 4） 电渗作用 5） 对支持物的选择 6） 温度对电泳的影响 电泳分类： 按原理分：区带电泳、移界电泳、等速电泳、聚焦电泳
17
三、试剂与器材
试剂：10%SDS、 分离胶胶贮液（30％ACr0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris －HCl 缓冲液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵 （APS)、 1%四基乙二胺（TEMED）及原液、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 0.05％考马斯亮兰 R250染色液 、脱色液、水饱和正丁醇、50%丙 三醇
分子量范围
适用的凝胶浓度/(%)
蛋白质
104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105
104 104–105 105-2×106
核酸(RNA)
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
15–20 5-10 2-2.6
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聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两 大类。
SDS的作用
SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质 的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部 分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下， SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各 种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电 荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电 荷和形状的影响，电泳速度只与蛋白质的分 子量有关。
解离度)
当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其 有效迁移率超过蛋白质；
（c)电位梯度的不连续性：
(2)分子筛效应
(3)电荷效应
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图4 电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的
区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
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聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不 溶；
(3)对pH和温度变化较稳定；
(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致， 则样品分离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)， 两者电泳原理完全相同。
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图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
(A为正面,B为剖面)
(1)样品胶pH6.7
(2)浓缩胶pH6.7
(3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3
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图2 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝
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二、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和
交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N， N ， N ， N— 四 甲 基 乙 二 胺 (TEMED) 和 催 化 剂过硫酸铵(APS)或核黄素的作用下聚合交联 成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的 区带电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
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蛋白质染色
常用蛋白质染色的几种方法： 1）氨基黑10B 2）考马斯亮蓝R250 3）考马斯亮蓝 G250 4）固绿 5）荧光染料： （l）丹磺酰氯（2，5-二甲氨基萘磺酰氯，简称DNS-Cl）： （2）荧光胺： （3）2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮（MDPF）： （4）1-苯胺基-8-萘磺酸（简称 ANS）： 6）银染色法 常用脂蛋白染色方法： 1）油红O染色 2）苏丹黑 B
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图5 不连续系统浓缩效应示意图
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SDS － 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ SDSPAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时， 它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子 的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝 胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸 钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于它的分子量，而与所带电荷和形状 无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质 分子量。
(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度， 通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电
荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有
更高的分辨率。
6
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
6.上贮槽 7.冷凝系统
图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 橡胶框
2.长玻璃板 3.短玻璃板 4.凹形 返回
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不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是由APS催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液 为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由APS催化聚合而成 的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓 冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、 2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔 径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品 浓缩的主要因素。
纯度检测： 1.SDS-PAGE测定LDL纯度 2.双向免疫扩散测定LDL纯度
含量测定： 1.Folin-酚试剂法测定LDL含量
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SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分 析LDL纯度
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一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电
泳（SDS-PAGE）分离蛋白质技术
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电泳概述：
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不连续凝胶分离蛋白质原理：
（1）样品浓缩效应
(a)凝胶孔径不连续性：
(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中
前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)
尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
m代cl表cl甘>m氨p酸p根>m)有G效G迁(C移l代率表=氯m根，，mP代为表迁蛋移白率质，，为G
电泳：带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极 移动，如带正电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。
影响电泳的主要因素： 1） 电泳介质的pH 2） 缓冲液的离子强度 3） 电场强度 4） 电渗作用 5） 对支持物的选择 6） 温度对电泳的影响 电泳分类： 按原理分：区带电泳、移界电泳、等速电泳、聚焦电泳
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三、试剂与器材
试剂：10%SDS、 分离胶胶贮液（30％ACr0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris －HCl 缓冲液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵 （APS)、 1%四基乙二胺（TEMED）及原液、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 0.05％考马斯亮兰 R250染色液 、脱色液、水饱和正丁醇、50%丙 三醇
分子量范围
适用的凝胶浓度/(%)
蛋白质
104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105
104 104–105 105-2×106
核酸(RNA)
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
15–20 5-10 2-2.6
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聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两 大类。