003菌数报告规则
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液的制备和使用（以白色念珠菌为示例）白色念珠菌（0）代↓传代培养↓实验菌液的制备：沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20~25℃，培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查：胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu↓计数方法适用性试验：胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu 注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性.1。
2菌液制备（按表1规定程序培养各试验菌株）取白色念珠菌的新鲜培养物↓用pH7。
0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0。
9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑曲霉的新鲜培养物↓加入3～5ml含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0.05％聚山梨酯80的pH7。
0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用;若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
1。
3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
2.培养基适用性检查按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表1规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好3计数方法适用性试验供试液制备：水不溶性非油脂类供试品↓取供试品，用pH7。
2015版中国药典微生物限度
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细 菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符 合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检验， 包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外 ，本法不适用于活菌制剂的检查。
• 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检 测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方
– 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数法 ，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
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• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数报告菌 数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报告菌数（每张 滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供试品）,或﹤1 乘以 最低稀释倍数的值报告菌数。
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3. MPN 法
– 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方 法进行供试液制备和供试品接种，所有试验管 在30～35℃培养3～5 天，如果需要确认是否 有微生物生长，按方法适应性试验确定的方法 进行。记录每一稀释级微生物生长的管数，从 表3查对每1g 或1ml 供试品中需氧菌总数的最 可能数。
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1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方 法适用性试验
• 1.3.1菌液制备及使用 • 1.3.2计数培养基适用性检查 • 1.3.3计数方法适用性试验
第10页，共59页。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数 方法适用性试验
• 1.3.1菌液制备及使用
– 菌种
• 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（ 从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行 保存，以保证试验菌株的生物学特性。
003菌数报告规则
（一）菌落计数1．细菌培养时间为72小时（3天），、分别在24小时及48小时，72小时，点记菌落数，一般以72小时菌落数为准，2：霉菌、酵母菌培养时间为120小时（5天），分别在48小时及72小时点记菌落数，一般以小时菌落数为准。
点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
3．一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。
勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。
注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的区别。
【必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。
如仍难区别，可延长培养时间4～7天，细菌菌落常会生长增大而加以区别。
】（4．供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点记在细菌、霉菌和酵母菌数内。
排除的方法须按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。
）5．供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，（特别是1：10级别），培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落用肉眼相区别的有形物。
（为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（1～2个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。
或用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。
［0.001%TTC肉汤琼脂培养基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂），TTC即为：2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂在每1000ml营养琼脂内加入灭菌的1％TTC溶液1ml混匀后倾注平皿，防止菌落蔓延］。
）有些软膏等非水溶性供试品：经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，【为防止这种情况，也可用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬以白色背景上易于点计。
】若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个菌落或2个以上菌落计数；若片状菌落不到平板的一半,而余下的一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2代表全平板菌落数.若生长蔓延较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。
洁净室(区)浮游菌测定标准操作规程
1.目的：建立一个洁净室（区）浮游菌测定的标准操作规程，确保洁净室（区）洁净程度。
2.范围：适用于洁净室和洁净区、无菌室或局部空气净化区域（包括洁净工作台）的浮游菌的测定和环境的验证。
3.责任：质量管理部QA监测员对本规程的实施负责。
4.程序：4.1.术语和定义：下列术语和定义适用于本标准操作规程。
4.1.1.菌落：微生物培养后，由一个或几个微生物繁殖而形成的微生物集落，简称CFU。
通常用个数表示。
4.1.2.浮游菌：用本标准操作规程提及的方法收集悬浮在空气中的活微生物粒子，通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。
4.1.3.浮游菌浓度：单位体积空气中含浮游菌菌落数的多少，以计数浓度表示，单位是个/m3或个/L。
4.1.4.纠偏限度：对于受控的洁净室（区），由使用者自行设定微生物含量等级。
当检测结果超过该等级时，应启动监测程序对该区域的微生物污染情况立即进行跟踪。
4.1.5.警戒限度：对于受控制的洁净室（区），由使用者自行设定一个微生物含量等级，从而给定了一个正常状态相比最早警戒的偏差值。
当超过该最早警戒的偏差值时，应启动保证工艺或环境不受影响的程序及相关措施。
4.2.测试方法4.2.1.方法提要：本标准操作规程采用的方法是计数浓度法。
即通过收集悬游在空气中的生物性粒子于专门的培养基（选择能证实其能够支持微生物生长的培养基），经若干时间和适宜的生长条件让其繁殖到可见的菌落计数，以判定该洁净室的微生物浓度。
4.2.2.人员的职责及培训：洁净室（区）的测试人员应进行本专业的培训并获得相应资格后才能履行对洁净室（区）测试的职责，其中包含涉及的卫生知识和基本微生物知识。
洁净室（区）的测试人员应选择与生产操作的空气洁净度级别要求相适应的穿戴方式。
4.2.3.仪器、辅助设备和培养基选择合适的浮游菌采样器，包括采用无油的抽气泵，较低的气流流速和较大的采样流量，以保证培养基表面的水分不被吹干。
本测试需要具备仪器、辅助设备和培养基如下：浮游菌采样器、培养皿、培养基（见本标准附录B）、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器。
微生物检验结果报告注意事项
微生物检验结果报告注意事项一、涉及定性项目的检验结果报告沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌O157：H7、空肠弯曲杆菌、副溶血性弧菌（定性）等，如果检样是称重取样，则最后检测结果一定报告为检出/25g或未检出/25g。
如果检样是体积取样，则最后检测结果一定报告为检出/25mL或未检出/25mL。
检测标准要求g必须要小写，mL中m必须小写，L则必须大写。
记录中所有有用的信息必须填上，无法填充的用“/”划掉。
二、菌落总数检验结果报告1.菌落总数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约以整数报告，如80.5CFU可修约报告为81CFU;80.4CFU则修约报告为80CFU。
2.菌落总数大于等于100CFU时，左边数第3位数字采用四舍五入原则修约后，取前2位数字，后面位数用0代替，也可用10的指数形式表示：如10-2两平板平均菌落数为238CFU/g，可修约为240CFU/g，最后报告为24000CFU/g或2.4×104CFU/g。
3.霉菌、酵母菌、乳酸菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌报告形式和菌落总数一样。
4.称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
三、大肠菌群检验结果报告。
LST初发酵，产酸产气，接种BGLB复发酵后仍产酸产气，则证明样品受到了大肠菌群污染，可检索MPN表，得出相应结果。
检测时如果采用（10-1，10-2,10-3）三个稀释度，最后BGLB产气管为（2，0，0），查MPN表可得出大肠菌群检测值为9.2MPN/g；检测时如果采用（100，10-1,10-2）三个稀释度，最后BGLB产气管仍为（2，0，0），查MPN表可得大肠菌群检测值为0.92MPN/g；如果采用（10-2，10-3,10-4）三个稀释度，最后BGLB产气管仍然为（2，0，0），查MPN表可得大肠菌群检测值为92MPN/g。
称重取样以MPN/g为单位报告，体积取样以MPN/mL为单位报告。
微生物限度检查
控制菌检查
培养基 胆盐乳糖培养基
特性 促生长能力
实验菌株 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
大肠埃希菌 MUG 培养基
抑制能力 促生长能力+指示能力
2010年版微生物限度检查法增修订内容
前言及检验量 供试液制备 计数实验的培养基适用性 计数实验的方法验证 计数实验的操作方法 控制菌检查的培养基适用性 控制菌检查的方法验证 控制菌检查的内容 标准体系
大肠埃希菌（Escherichia coli）„CMCC（B） 44 102‟ 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）„CMCC（B） 26 003‟ 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）„CMCC（B） 63 501‟ 白色念珠菌（Candida albicans）„CMCC（F） 98 001‟ 黑曲霉（Aspergillus niger）„CMCC（F） 98 003‟
1.1.2菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆
菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基 中，培养 18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养 物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养 24～48 小时。上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制
成每 1ml 含菌数为 50～100cfu 的菌悬液。
并对该方法的使用范围进行了限定
ISO4833-2003菌落总数的检测方法
ISO与美国FDA的不同处食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）内容提要：l 菌落总数检测l 大肠菌群及大肠杆菌检测l 金黄色葡萄球菌检测l 沙门氏菌检测l 单核细胞增生李斯特氏菌检测菌落总数测定——菌落总数的概念l 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义l 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
l 及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。
l 通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）适当十倍稀释样品选择2~3个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做两个平行）每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）35 ℃ 48 ± 2h菌落计数FDA BAM 菌落计数方法l 选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*dl 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。
EAPC：estimated aerobic plate countl 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。
l 所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100* 1/d。
l 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。
l 最终结果保留前两位有效数字。
按照4舍6入，5是奇进偶不进。
大肠菌群计数3种国标的比较
4
平板法（第 二法）
无
1.2008版和2010版增加了大 肠菌群平板计数法。 2.2010版的平板计数法在 2008版的基础上将平板菌落 数的选择范围从“30CFU～ 150CFU"改为“15CFU～ 150CFU”。
5
计数报告方 式
无
2008版和2010版报告方法无 区别。
6
Petrfilm TM测 试片法（第 三法）
GB 4789.3-2003、GB/T 4789.3-2008、GB/T 4789.3-2010的比较 、 、 的比较
GB/T 4789.3-2003 序号 项目 内容描述 1.乳糖胆盐发酵管； 2.伊红美蓝琼脂培养平板； 3.乳糖发酵管； 培养基和试 4.EC肉汤； 剂 5.磷酸盐缓冲溶液； 6.85%灭菌生理盐水； 7.革兰氏染色液； 内容描述 1.月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉 汤 2.煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤； 3.结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）； 4.磷酸盐缓冲液； 5.无菌生理盐水； 6.1mol/mL的氢氧化钠溶液； 7.1mol/mL的盐酸溶液； 8.Petrifilm TM1）大肠菌群检验测试 片和压板 1.检样稀释：25g(mL)样品+225 mL稀 释液，充分振摇均匀，按照10倍系列 稀释成3个稀释度。 2.初发酵试验：每个稀释度接种3管 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤。置36℃ ±1℃温箱内，培养24h±2h,观察气 泡产生情况，如未产气则继续培养至 48h±2h.如都未产气则报告为大肠菌 群阴性，如有产气者，则进行复发酵 试验。 3.复发酵试验：将所有48h±2h内产 气的LST肉汤管中分别取接种1环于煌 绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36℃ ±1℃培养48h±2h，观察产气情况， 产气则记为大肠菌群阳性管。 内容描述 1.月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 2.煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤； 3.结晶近紫中性红胆盐琼脂 （VRBA）； 4.磷酸盐缓冲液； 5.无菌生理盐水； 6.1mol/mL的氢氧化钠溶液； 7.1mol/mL的盐酸溶液； GB/T 4789.3-2008 GB 4789.3-2010 三者区别
SSJ-SOP-PK-003A微生物取样标准操作规范
陕西爽爽佳食品有限公司微生物取样标准操作规范文件号：SSJ-SOP-PK-003A/0颁布日期：2017年4月14日文件类型：SOP 密级：仅供内部使用1.0目的1.1确保所取的样品具有代表性，确保测试过程的准确性。
1.2评估人员、原材料、产品、设备表面、内包环境的微生物状况。
2.0范围适用于所有样品、设备表面、人员、内包环境的微生物采集。
3.0职责微生物品控员负责本文件的执行，品控主管负责监督本文件的执行。
4.0定义无5.0程序5.1原材料5.1.1进厂原材料按照《原材料进厂检验标准》进行检验，对是产品的原料或直接接触产品的包装材料抽样做微生物检测。
5.1.2针对已在库房存放暂未使用的原材料，根据原料使用周期定期做微生物检测；对已经开封未使用完毕的原材料，根据原料特性定期检测微生物。
5.2产品5.2.1产品每天检测一次，根据生产产品品项取样，每个品项取一组样，根据微生物检验、复检、留样合理取样做微生物检测，并做好记录，对于经检测发现的异常需及时通知相关部门负责人，并予以跟踪。
5.2.2将取样的产品带回实验室，做微生物检测实验前用75%的酒精擦拭，以达到消毒杀菌的目的，避免污染引起的误差。
5.3设备表面5.3.1每天对半成品存放筐、拌料斗、盛料盆、内包操作台做涂抹试验。
5.3.2涂抹试验方法5.3.2.1将准备好的装有棉签的无菌瓶表面用75%酒精杀菌，将棉签取出后拭擦待测试区域，一般设备表面擦拭面积为10cm*10cm。
5.3.2.2将擦洗后的棉签插入已灭菌并有无菌水的试管中，然后摇晃几下使棉签上的擦拭物品充分洗下来。
5.3.2.3进行微生物实验。
参见附表：棉球擦拭微生物测试频率及测试点5.4人员5.4.1人员手部涂抹：取已准备好的无菌空白平皿，快速揭开1/3，让操做人员用手接触平皿内培养基后立即还原，做好标记并放置于36℃培养箱内观察微生物生长情况。
5.4.2工作服、工作鞋涂抹：将准备好的装有棉签的无菌瓶表面用75%酒精杀菌，将棉签取出后拭擦员工工作服，一般擦拭面积为10cm*10cm。
ISO4833-2003菌落总数的检测方法
ISO与美国FDA的不同处食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）内容提要：l 菌落总数检测l 大肠菌群及大肠杆菌检测l 金黄色葡萄球菌检测l 沙门氏菌检测l 单核细胞增生李斯特氏菌检测菌落总数测定——菌落总数的概念l 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义l 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
l 及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。
l 通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）适当十倍稀释样品选择2~3个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做两个平行）每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）35 ℃ 48 ± 2h菌落计数FDA BAM 菌落计数方法l 选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*dl 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。
EAPC：estimated aerobic plate countl 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。
l 所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100* 1/d。
l 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。
l 最终结果保留前两位有效数字。
按照4舍6入，5是奇进偶不进。
附录ⅩⅢC微生物限度检查法
附录ⅩⅢC微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包含细菌数、霉菌数、酵母菌数及操纵菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。
检验全过程务必严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌与沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，假如使用了表面活性剂、中与剂或者灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检查法中细菌及操纵菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。
检验结果以1g、1ml、10g、10ml 或者10c㎡为单位报告，特殊品种能够最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或者cm2）。
除另有规定外，通常供试品的检验量为10g 或者10ml；膜剂为100 cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量能够酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g 或者20ml（其中10g或者10ml 用于阳性参照试验）。
检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于 4 片。
通常应随机抽取很多于检验用量（两个以上最小包装单位）的3 倍量供试品。
供试品溶液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过 1 小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品取供试品10ml，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10 的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
大肠菌群计数3种国标的比较
无
已将此方法删除
2010版将PetrfilmTM测试片 法删除。
7
计数报告方式
无
无
——————
1.检样稀释：25g(mL)样品+225 mL稀 释液，充分振摇均匀，按照10倍系列 稀释成3个稀释度。 2.初发酵试验：每个稀释度接种3管月 桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤。置36℃±1 ℃温箱内，培养24h±2h,观察气泡产 生情况，如未产气则继续培养至48h± 2h.未产气则报告为大肠菌群阴性，如 有产气者，则进行复发酵试验。 3.复发酵试验：将所有48h±2h内产气 的LST肉汤管中分别取接种1环于煌绿 乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36℃±1 ℃培养48h±2h，观察产气情况，产气 则记为大肠菌群阳性管。
GB/T 4789.3-2003 序号 项目 内容描述
GB/T 4789.3-2008 内容描述 1.检样稀释：25g(mL)样品+225 mL稀 释液，充分振摇均匀，按照10倍系列 稀释做成3个稀释度。 2.平板计数：选择2～3个稀释度的均 匀样品接种于VRBA平板。翻转平板， 置于36℃±1℃培养18h～24h. 3.平板菌落选择：选取菌落在30CFU ～150CFU之间的平板，分别计数平板 上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 4.证实试验：从VRBA平板上挑取10个 不同类型的典型和可疑菌落接种于 BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养18h～ 24h.凡肉汤管内产气的报告为大肠菌 群阳性。 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比 例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀 释倍数，即为每g（mL）样品中大肠 菌群数。 1.检样稀释：25g(mL)样品+225 mL稀 释液，充分振摇均匀，按照10倍系列 稀释成3个稀释度。 2.样品接种：选择2～3个稀释度的均 匀样品接种于PetrfilmTM测试片上。 置于36℃±1℃培养24h±2h. 3.判读：培养24h±2h后立即计数， 经观察，红色有气泡的菌落确认为大 肠菌群。 选取菌落数在15～150之间的测试 片，两个测试片的平均数乘以稀释倍 数，即可得每g（mL）样品中大肠菌 群形成单位（CFU)数。
微生物限度
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。
检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2 为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或cm2）。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g 或20ml（其中10g 或10ml用于阳性对照试验）。
检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4 片。
一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3 倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品取供试品10ml，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10 的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10 的供试液。
细菌检测合格判定标准
3、水溶性产品的制备：
称取10g样品放入灭菌的90ml生理盐水中的锥形瓶中，充分
名称：
菌落总数检验操作规程
职能部门：
质检部
页数：
第３页 共４页
2、半成品……………………………………………菌落总数<10cfu/g（ml）
3、空气
质检部微检室……………………………………菌落总数<10cfu/m3
消毒室、灌装间…………………………………菌落总数<500cfu/m3
配料间……………………………………………菌落总数<1000cfu/m3
4、包装容器及半成品贮料桶
7、消毒的手
质检部微检室……………………………………菌落总数<5cfu/手
折布室……………………………………………菌落总数<300cfu/手
灌装间……………………………………………菌落总数<300cfu/手
8、消毒毛巾…………………………………………菌落总数<10cfu/cm2
9、去离子水…………………………………………菌落总数<100cfu/ml
1.1%氯化三苯四氮唑（ＴＴＣ）
称取0.1gＴＴＣ，放入三角瓶中，加水100ml，溶解后，塞上胶塞，用报纸包好，用皮圈扎好，１21度,20min高压灭菌。
平皿、小勺用报纸包好，１21度,20min高压灭菌。
菌落总数检验收的操作方法：
1、收到车间送检样品后，按要求填写记录，写好标签（每样品写２张小标签），用法75%酒精擦干净样品，并把样品放入干净的小筐中，放在无菌室中的小推车上，把高压灭菌后的所需生理盐水、平皿、吸管放在小推车上。用小盆装１000ml水，加入４瓶盖新洁而灭消毒水配成0.1%水溶液作为无菌操作时洗手和擦操作台用。
中药饮片微生物限度检查法
2020版药典中药饮片微生物限度检查法中药饮片微生物限度检查法用于检查中药材及中药饮片的微生物污染程度。
检查项目包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、耐热菌总数、耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌。
本法中的耐热菌系供试液置水浴（98～100℃）30分钟处理后按需氧菌总数测定方法检出的微生物总称。
中药饮片微生物限度检查的试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
微生物计数培养基适用性检查和方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代)，并釆用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
菌液制备按表1规定程序培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%( ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸岀孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%( ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
微生物限度
16
灭菌方式
湿热：115 ℃ ~121 ℃，15min~30min 物品切勿立即取出置冷处，以免急速冷却， 使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，以致染 菌。 干热：160 ℃~ 170 ℃ ，2h 适于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭 菌。 灭菌程序需要经过验证
17
计数培养基适用性检查
30
细菌、霉菌及酵母菌计数
营养琼脂-细菌
玫瑰红钠琼脂培养基-霉菌
31
细菌、霉菌及酵母菌计数
1.平皿法
菌数报告规则： 细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300、霉菌宜 选取平均菌落数小于100的稀释级，作为菌数报告 （取两位有效数字）的依据。 以最高平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml 或10cm2供试品中所含的菌数 如果各稀释级的平板均无菌落生长，或仅是最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时， 以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
医疗器械微生物限度检验
何燕英 heyy2006@ 广东省医疗器械质量监督检验所 2010年12月
1
概述
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂 及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
细菌、真菌菌落数 微生物限度检查 控制菌
2
概述
微生物：形体微小，结构简单，通常要用光学显 微镜和电子显微镜才能看清楚的生物 特点： 1、 个体微小，一般<0.1mm 2、构造简单，有单细胞的，简单多细胞 的，非细胞的 3、进化地位低 分类：原核类：二菌，四体（细菌、放线菌、螺旋 体、支原体、立克次氏体、衣原体） 真核类：真菌，原生动物，显微藻类 非细胞类：病毒，亚病毒
培养基
微生物检验结果报告注意事项
微生物检验结果报告注意事项一、涉及定性项目的检验结果报告沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌O157：H7、空肠弯曲杆菌、副溶血性弧菌（定性）等，如果检样是称重取样，则最后检测结果一定报告为检出/25g或未检出/25g。
如果检样是体积取样，则最后检测结果一定报告为检出/25mL或未检出/25mL。
检测标准要求g必须要小写，mL中m必须小写，L则必须大写。
记录中所有有用的信息必须填上，无法填充的用“/”划掉。
二、菌落总数检验结果报告1.菌落总数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约以整数报告，如80.5CFU可修约报告为81CFU;80.4CFU则修约报告为80CFU。
2.菌落总数大于等于100CFU时，左边数第3位数字采用四舍五入原则修约后，取前2位数字，后面位数用0代替，也可用10的指数形式表示：如10-2两平板平均菌落数为238CFU/g，可修约为240CFU/g，最后报告为24000CFU/g或2.4×104CFU/g。
3.霉菌、酵母菌、乳酸菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌报告形式和菌落总数一样。
4.称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
三、大肠菌群检验结果报告。
LST初发酵，产酸产气，接种BGLB复发酵后仍产酸产气，则证明样品受到了大肠菌群污染，可检索MPN表，得出相应结果。
检测时如果采用（10-1，10-2,10-3）三个稀释度，最后BGLB 产气管为（2，0，0），查MPN表可得出大肠菌群检测值为9.2MPN/g；检测时如果采用（100，10-1,10-2）三个稀释度，最后BGLB产气管仍为（2，0，0），查MPN表可得大肠菌群检测值为0.92MPN/g；如果采用（10-2，10-3,10-4）三个稀释度，最后BGLB产气管仍然为（2，0，0），查MPN表可得大肠菌群检测值为92MPN/g。
称重取样以MPN/g为单位报告，体积取样以MPN/mL 为单位报告。
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（一）菌落计数1．细菌培养时间为72小时（3天），、分别在24小时及48小时，72小时，点记菌落数，一般以72小时菌落数为准，2：霉菌、酵母菌培养时间为120小时（5天），分别在48小时及72小时点记菌落数，一般以小时菌落数为准。
点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
3．一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。
勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。
注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的区别。
【必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。
如仍难区别，可延长培养时间4～7天，细菌菌落常会生长增大而加以区别。
】（4．供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点记在细菌、霉菌和酵母菌数内。
排除的方法须按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。
）5．供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，（特别是1：10级别），培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落用肉眼相区别的有形物。
（为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（1～2个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。
或用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。
［0.001%TTC肉汤琼脂培养基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂），TTC即为：2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂在每1000ml营养琼脂内加入灭菌的1％TTC溶液1ml混匀后倾注平皿，防止菌落蔓延］。
）有些软膏等非水溶性供试品：经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，【为防止这种情况，也可用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬以白色背景上易于点计。
】若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个菌落或2个以上菌落计数；若片状菌落不到平板的一半,而余下的一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2代表全平板菌落数.若生长蔓延较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。
若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界限，仅有一条链,可视为一个菌落（一条链作为一个菌落计，）但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，如果有不同来源的几条链,则应将每条链作为一个菌落计附表：细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较（营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板）6．如同一稀释级2个平板菌落数超过1倍以上，不应计数，菌落蔓延成片不应计数。
7．当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，按菌落计数的Poisson分布菌数的95%可信限计。
二个平板最大差值分别在0～4，1～7，2～9，3～10，4～12，5～14，6～15，以上各数分别为菌落平均值1、2、3、4、5、6、7的上限及下限，超出以上限度，视为操作误差，不得作为计数依据。
每个稀释级使用3个平板时，平板菌落数均在10个以下的情况：0～3，1～5，2～7，3～9，4～10，5～12，6～13，7～14。
8．对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。
9：求出同稀释度的两个平板平均菌落总数.一个稀释度使用两个平板应采用两个平板的平均数,【其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用, 】而应以无片装菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,（二）菌数报告规则（取两位有效数字）1．细菌数选取稀释级：平均菌落数在30～300（国外近年有选取25～250的趋向）之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。
霉菌、酵母菌数选取稀释级：平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为报告菌数计算的依据。
（1）如只有1个稀释级平均菌落数在30～300（30～100）之间：则将该稀释级的菌落数×稀释倍数报告。
（2）当有2个或2个以上稀释级的菌落数符合上述规定：以最高的平均菌落数×稀释倍数值的值报告。
2．如有2个相邻稀释级平均菌落数在30～300（30～100）之间时，则按比值计算。
①当比值Z ≤2时，则以2个稀释级的均值报告：（X平×N X+Y平×N Y ）÷2如：X平= 295（为1：100稀释级的平均菌落数）Y平= 46 为（1：1000稀释级的平均菌落数）N X =10N Y = 100Y平46 × 100Z = ----------------------------------------- = 1.6X平295 × 102则报告数为：（4600 + 2950）÷2 =3775 ，取两位有效数为：3800 =38 × 10②当比值 2 ＜Z ≤5时，则以低稀释级的平均菌落数乘以高稀释倍数报告。
低稀释级平均菌落数X平×N YX平= 271（为1：100稀释级的平均菌落数）Y平= 60 为（1：1000稀释级的平均菌落数）N X =10N Y = 100Y平60 × 100Z = ----------------------------------------- = 2.2X平271 × 10则报告数为：（低稀释级平均菌落数X平×N Y ），即：271 × 100 =27100取两位有效数为：27000 （27×103 ）【Z = 比值＝（高稀释级平均菌落数×稀释倍数）／（低稀释级平均菌落数×稀释倍数）N = 稀释倍数（N X ----- 低稀释级稀释倍数N Y ---- 高稀释级稀释倍数）Z = 比值X平：低稀释级的平均菌落数）Y平：高稀释级平均菌落数③当比值Z＞5时或高稀释级的平均菌落数≥低稀释级的平均菌落数，为异常，必要时重验证。
X平= 39（为原液的平均菌落数）Y平= 41 为（1：10稀释级的平均菌落数）N X = 1N Y = 10 Y平41× 10Z = ----------------------------------------- = 10.5X平39 × 1Z = 10.5 ＞5 为异常，3．如有3个稀释级平均菌落数均在30～300（30～100）之间时，则以后2个稀释级计算级间比值报告。
4．如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，则按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，一般则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。
如：X平=24（为1：10稀释级的平均菌落数）N X =1Y平= 10 为（1：100稀释级的平均菌落数）N Y = 10W = 12 为（1：1000稀释级的平均菌落数）N W = 100则报告菌落数：X平=（为原液稀释级的平均菌落数）×N Y24 × 10 = 2405．如各稀释级平均菌落数均不在30～300（30～100）之间：则以最接近30或300（100）的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。
6．如各稀释剂的平板均无菌落生长或最低稀释级的平板有菌落生长，最低稀释级平均菌落数小于1时：则报告菌数为小于10个／g或ml。
以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数。
如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌，则报告未检出霉菌及酵母菌／ml。
7．当各稀释级平均菌落数均小于30时：如高稀释级平均菌落数≥低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定，按测定结果报告菌数。
培养基稀释法：取低稀释级供试液（原液或1：10供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或＜0.2ml )，每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。
5个或5个以上平板点计的菌落数之和，即为每1ml菌落数，共得3组数据。
以3份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
8．结果报告①菌落数在100以内时，按实有数报告。
②菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数值修约规则处理。
③复试供试品细菌数、霉菌数及酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的平均值报告。
（三）注意事项1．供试品检验全过程必须符合无菌技术要求：使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。
2．从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在1小时内完成，【避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡】。
3．供试液稀释及注皿应取均匀的供试液，以免造成实验误差。
4．为避免细菌菌落蔓延生长，宜采取下列方法处理：菌落如蔓延生长成片，此平板不宜计数。
一：菌落总数结果的记录7：菌落数在100以内时,-------按其实有数报告大于100时--------采用两位有效数字,在有效数字后面的数值,以“四舍五入”法计算.为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。
3．1．3）、菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30~300之间、霉菌平均菌落数在30~100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。
当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。
若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌数等异常情况，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。
当各稀释级的平均菌落数小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
如各稀释级的平板无菌落生长，或仅最低稀释级的平均菌落数生长，但平均菌落数小于1小时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
菌落数报告举例10.1.510.1.5.1 一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。
勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。
注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之间，以及菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的区别。
必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。
10.1.5.2 供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。
排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。
10.1.5.3 供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多的有形物，且难与菌落相区别。
为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（1～2个平皿）。