蛋白质的纯化与鉴定

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血浆清蛋白的分离纯化与鉴定实验原理不同的蛋白质的分子量

血浆清蛋白的分离纯化与鉴定实验原理不同的蛋白质的分子量

血浆清蛋白的分离纯化与鉴定

实验原理

不同的蛋白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同,可以更据这些性质的差别,分离及提纯各种蛋白质。利用硫酸铵分段盐析法将血清中的清蛋白及球蛋白分离,清蛋白液再利用葡聚糖凝胶过滤法除盐,即可得到较纯的清蛋白。纯化后的清蛋白可利用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。

盐析:是指将中性盐(如硫酸铵)加入蛋白质溶液中,中和Pr蛋白质表面电荷及破坏水化膜,使蛋白质相互聚集在析出。分段盐析:各种蛋白质盐析时所需的盐浓度和PH不同,利用不同盐浓度下Pr溶解度不同,将蛋白质分段沉淀下来。半饱和硫酸铵沉淀血清中球蛋白(清蛋白溶解)将血清清蛋白和球蛋白初步分离。

常用的除盐方法:半透膜透析;凝胶过滤(层析)。在葡聚糖凝胶层析柱中,由于蛋白质和盐的分子量不同,洗脱速度也不同,大分子蛋白质不能进入凝胶的网孔内而先流出,小分子盐则可进入网孔滞留在凝胶内,收集蛋白洗脱液,即可得到脱盐的蛋白质。用三氯醋酸液鉴定洗脱的蛋白液,以BaCL2检测硫酸铵。

纯化后的清蛋白用醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果。

实验试剂

1.饱和硫酸溶液:称固体硫酸铵85g于100ml蒸馏水中,在70~80℃水浴中搅拌溶解,用浓氨水调PH为7.2,室温放置过夜,瓶底析出白色结晶,上

层液即为饱和硫酸铵液。

2.生理盐水:称取分析纯NaCl 0.89克,蒸馏水稀释至1000ml.

3.葡聚糖凝胶Sephadex G-25: 称取10克Sephadex G-25,加入200ml 0.02mol/lPH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。

蛋白质的表达纯化

蛋白质的表达纯化

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上,注意薄玻璃朝向自己,厚 极架(卡在底面的卡口上),注意薄玻璃朝向
玻璃上的箭头向上。按弹簧夹,电极架,厚玻璃的箭头朝上,玻璃与红色橡胶
将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃 条必须完全紧贴。(需同时放置两块制好的胶,
的间隙内灌胶,放上梳子,待 如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替,
胶凝固。
注意塑料板上的提示,必须使塑料板与橡胶条
• 3. 细胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流 出液。
• 4.洗脱杂蛋白:用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱, 分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。
• 5.洗脱目标蛋白:用10mL洗脱缓冲液洗柱,每管0.5-1 mL, 共收集6-10管,分别取1蛋0白u质l样的表品达纯用化于SDS-PAGE 分析。
8M Urea, 10 mM 2-ME, pH8.0 • [4] Washing Buffer(UWB): 100 mM NaH2PO4, 10
mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 • [5] Elution Buffer(洗脱): 100 mM NaH2PO4, 10 mMTris,
8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 • [6] IPTG

蛋白质纯化与鉴定实验指南

蛋白质纯化与鉴定实验指南

二、Hela细胞核提取物的Sephacry S-300 HR柱层析98实验3 序列特异性DNA亲和层析101

一、用制备凝胶电泳纯化寡核苷酸 105

二、DNA亲和介质的制备107

三、亲和层析中非特异性竞争DNA的正确使用112

四、亲和层析的操作 113实验4 DNA酶I足迹分析117

一、DNA酶I足迹探针的制备118

二、DNA酶I足迹分析122实验5 凝胶迁移变动分析126实验6 肝素-Sepharose CL-2B的制备129试剂的配制 131参考文献 138第3单元 大肠杆菌中过表达重组蛋白的纯化 Richard R. Burgess和Mark W. Knuth141实验1 大肠杆菌细胞的破碎和包涵体的配制144实验2 包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析148 实验3 可溶性提取物(核心RNA聚合酶-复合物)的聚乙烯亚胺沉淀和免疫亲和层 152 析

一、PEI沉淀法分级分离可溶性提取物153

二、免疫亲和层析 154实验4 定量测定与制备小结158

一、蛋白质的定量测定 158

二、定量SDS凝胶染色与扫描159

三、定量蛋白质斑点印迹 160

四、酶测定法 163

五、纯化记录表 164

六、蛋白质纯化总结表与主要组分的总电泳照片 165实验5 蛋白质的鉴定167

一、纯蛋白质的紫外光谱——A280mm/A260nm167

二、消光系数的测定(Scopes法)167

三、过载染色SDS凝胶扫描法估测纯度169

四、由非变性凝胶电泳迁移率法评估均一性 169方案补充实验:从过表达细菌提纯 172

一、快速蛋白质斑点印迹试验 172

蛋白质的分离鉴定

蛋白质的分离鉴定

蛋白质的分离鉴定

蛋白质的分离鉴定包括了两个主要步骤,第一步是对蛋白质进行分离,第二步是对蛋白质进行鉴定。百泰派克生物科技提供蛋白质的分离鉴定服务,包括基于质谱的蛋白质鉴定服务。

蛋白质的分离

蛋白质的分离,是指从复杂混合物(通常是细胞,组织或整个生物体)中分离出蛋白质的一系列过程。蛋白质的分离和纯化对于表征目的蛋白质的功能、结构和相互作用至关重要。分离过程主要是分离混合物中的蛋白质和非蛋白质部分,纯化的过程主要是从所有其他蛋白质中纯化出所需的目标蛋白质。理想的蛋白质分离方法应该能同时分离成千上万个蛋白质以及它们的修饰物并可以与之后的鉴定技术有效衔接。常用的蛋白分离技术包括有电泳法和层析法,如双向电泳技术(2-DE)和液相层析色谱技术。

蛋白质的分离鉴定。

蛋白质的鉴定

蛋白质鉴定一般在完成蛋白质分离之后进行,主要用来确定蛋白产物的种类和正确

性。蛋白质鉴定可以通过测定蛋白质的分子量、等电点、结构(一级结构、晶体结构、肽谱、N/C末端)、生物学功能以及免疫学反应等实现。常用的鉴定方法有图像分析法、微量测序法和质谱法等。

血清蛋白的分离、提纯与鉴定

血清蛋白的分离、提纯与鉴定

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定

一、实验目的:

1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法

2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法

3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法

4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法

5、了解柱层析技术

二、实验原理:

蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。对于不同的蛋白质,其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用不同蛋白质在这些性质上的差别,利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。

A.盐析法:在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时,加盐后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,从而破坏了蛋白质的胶体性质,导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间易于聚集沉淀,进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。

B.凝胶层析:利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时,溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔,而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中,因此在洗脱过程中,小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来,从而达到去盐的目的。

C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

D.纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳):血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低

于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

蛋白质纯化实验流程

蛋白质纯化实验流程

蛋白质纯化实验流程

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蛋白质纯度鉴定的方法

蛋白质纯度鉴定的方法

蛋白质纯度鉴定的方法

1. 引言

在生物学和生物化学领域,蛋白质的纯度鉴定是一个重要的实验步骤。蛋白质纯度的高低直接影响到后续实验的结果和解释。因此,科研人员需要掌握多种方法来评估蛋白质的纯度。本文将介绍几种常用的蛋白质纯度鉴定方法,并讨论它们的优缺点。

2. SDS-PAGE

SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)是一种常用的蛋白质分离和鉴定方法。它利用SDS脱变性电泳,通过蛋白质分子量的差异来达到纯度鉴定的目的。

2.1 原理

SDS-PAGE使用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质,将蛋白质根据其分子量大小进行分离。同时,SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)可以使蛋白质带负电荷,并且使蛋白质的二级结构失去稳定性。经过电泳后,蛋白质分子会在凝胶中移动,较小分子量的蛋白质迁移距离较远,较大分子量的蛋白质迁移距离较短。

2.2 实验步骤

1.制备凝胶:用聚丙烯酰胺和交联剂制备凝胶。

2.样品处理:将待鉴定的蛋白样品加入SDS缓冲液,并加热至95°C。

3.蛋白质加载:将样品加入凝胶孔中。

4.蛋白质电泳:将凝胶放入电泳槽,接通电源进行电泳分离。

5.凝胶染色:将凝胶染色以可视化分离的蛋白质。

2.3 优点和局限性

优点: - 简单、快速、经济。 - 可以同时分离多个蛋白质样品。 - 可以定量分析蛋白质的含量。

局限性: - 只能根据分子量差异进行纯度鉴定,不能确定是否存在多个亚单位。

- 在高分子量蛋白质的分离上有一定的局限性。 - 对某些特殊蛋白质可能无法获

蛋白质纯化与鉴定

蛋白质纯化与鉴定

蛋白质纯化与鉴定

蛋白质纯化与鉴定是生物化学研究中的重要环节,它们对于解析蛋

白质的功能与结构具有至关重要的作用。本文将介绍蛋白质纯化与鉴

定的基本原理和常用方法,帮助读者深入了解和掌握这一领域的知识。

一、蛋白质纯化的基本原理

蛋白质纯化的目的是从复杂的混合物中分离出目标蛋白质,使其达

到高纯度并可供进一步研究。纯化的基本原理包括分子大小、电荷、

氢键、亲和性等特性的利用。

1. 分子大小

分子大小是蛋白质纯化中最常用的原理之一。常见的技术包括凝胶

过滤、超速离心和透析等。凝胶过滤是利用滤膜的孔径大小将分子按

大小分离,大分子会滞留在凝胶中,而小分子则通过滤膜。超速离心

则是通过离心的力将分子按大小分离,大分子相对于小分子会沉降得

更快。透析则是通过膜的选择性渗透,让目标蛋白质在液相中透析。

2. 电荷

蛋白质具有酸性和碱性基团,它们在不同pH条件下会带有正电荷

或负电荷。利用这一特性,可以利用离子交换色谱和等电聚焦等技术

进行纯化。在离子交换色谱中,蛋白质在具有相反电荷的交换树脂上

吸附,通过改变溶液中的离子浓度和pH值来洗脱目标蛋白质。等电聚

焦则是通过在pH梯度中,蛋白质在等电点向电极方向移动,实现纯化。

3. 氢键

氢键是蛋白质中常见的一种相互作用力,利用氢键的特性可以进行水相相互作用色谱的纯化。该技术通过蛋白质与水相固定相的相互作用,实现蛋白质的纯化。

4. 亲和性

亲和性是蛋白质纯化中常用的原理之一,通过将特定配体固定在固定相上,使其与目标蛋白质发生亲和作用,实现纯化。常见的技术包括亲和层析、亲和电泳、亲和免疫吸附等。

3-12蛋白质的分离纯化和测定

3-12蛋白质的分离纯化和测定

蛋白质的分离纯化测定

---介绍蛋白质分离纯化的步骤、主要方法、定量测定和纯度鉴定

⏹为什么要进行蛋白质的分离纯化

●研究目标蛋白质的结构、功能及生理学意义;

●工业生产的需要:食品、发酵、纺织、制革等工业,需要大量

的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。

●医疗的需要:如用猪胰岛素治疗糖尿病。

●基因工程的需要

●………..

蛋白质分离纯化的基本流程

细胞

抽提分离纯化鉴定破碎

回收率/纯化倍数回收率/纯化倍数回收率/纯化倍数纯度/活性/性质总蛋白和目标蛋白含量监测总蛋白含量与酶活力监测

⏹分离纯化的要求和目的

●纯度:主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白

和一级结构、空间结构,一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂,都要求均一;工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂,达到一定纯度即可,不要求均一。

●活性:要求大分子保持天然构象状态,有高度的生物活性

●收率:希望收率越高越好,但在分离纯化过程中总有不少损失,

而且提纯步骤越多,损失越大。

◆增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性

◆设法除去变性的和不要的蛋白质,目标蛋白质产量达到最高值。

1、细胞破碎

⏹将蛋白质从原来的组织细胞中以溶解状态释放

出来,并保持原来的天然状态和生物活性

◆机械破碎法

◆渗透破碎法

◆交替冻融

◆超声波法

◆酶消化

2、抽提

⏹将蛋白质从组织细胞液中提取出来

⏹溶解性蛋白质:根据溶解性质采取相应的溶剂/

缓冲液溶解出来

⏹不溶性蛋白:将杂质溶解出来,剩余目标蛋白

⏹膜蛋白质:脂蛋白、糖蛋白,选择溶剂

血清白蛋白的分离纯化及鉴定(一)-盐析、G-25脱盐、G-75层析

血清白蛋白的分离纯化及鉴定(一)-盐析、G-25脱盐、G-75层析

不同类型的葡聚糖凝胶的分离范围和应用
凝胶类型 G-25 G-75
分离范围(Mr) 1000-5000 3000-70000
应用 去盐 中等蛋白质分离
实验步骤-硫酸铵盐析

取正常人血清2.0ml于小试管中,边摇边缓慢
滴加饱和硫酸铵溶液2.0ml,混匀后于室温中
放置10min,3000r/min离心10min。
紫外检测仪工作原理
仪器工作原理的依据是光吸收定律。从光源发出的光 经狭缝、滤光片、样品池到光电培增管上,使束由于样品 浓度不同所引起光强的变化转换成光电流的变化,此光电 流经放大器输入到对数转换器,使透光率T转成A输出,即 A=1g — =εCL式中ε为待测样品的克分子消光系统,C为样 品浓度,采用克分子/升单位,L为光程,用厘米作单位。 根据上式就知测出了A,就知样品浓度C。若从放大器直接 输入记录仪,绘出的是样品透光率T变化的图谱,若从对数 转换器输入到记录仪绘出的是样品光密度A变化的图谱。
实验注意事项

1、凝胶G-25,G-75装柱前要充分混匀;
2、凝胶G-25,G-75装柱时避免出现断层和气泡;
3、洗脱过程中,要保持洗脱液在凝胶柱中流动;

4、时刻关注蛋白值,记录收集每管的起始蛋白值。
凝胶柱G-75分离纯化
3、洗脱:凝胶柱经0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡后, 慢慢打开底口使凝胶床上的液面下降到与床面相齐(不 低于凝胶床面),夹死底口。用吸管吸取样品Ⅲ,小心 缓慢的加到凝胶床面,打开底口,使样品Ⅲ慢慢进入凝 胶床面直至与床面相齐。吸取缓冲液,沿壁慢慢加入凝 胶床面,进行洗脱。 4、收集:洗脱液用部分收集器收集(或者手工操作),每 管2ml,用紫外检测仪检测蛋白峰并收集,为样品Ⅳ,绘 制洗脱曲线。

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤

引言:

蛋白质是生物体内重要的基本组成部分,对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。蛋白质纯化是一个关键步骤,可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质,并去除杂质。下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。

一、样品制备

在开始蛋白质纯化实验之前,首先需要准备样品。样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度,避免蛋白质的降解和杂质的污染。

二、离心

将样品进行离心,以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。离心过程中,可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件,如转速、离心时间等。

三、初步分离

将离心后的上清液取出,进行初步分离。可以采用一些常用的分离技术,如离子交换色谱、凝胶过滤等。这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离,从而使目标蛋白质得到部分纯化。

四、亲和层析

亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术,通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等,可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。

五、凝胶电泳

凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术,通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移,根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质,同时也可以用于纯化蛋白质。

六、柱层析

柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术,通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析,实现蛋白质的分离和纯化。柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂,如离子交换柱、凝胶过滤柱等。

七、透析

透析是一种常用的蛋白质纯化技术,通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。透析可以用于去除一些小分子杂质,如盐类、小分子药物等。

蛋白质纯化的方法

蛋白质纯化的方法

蛋白质纯化的方法

蛋白质纯化的方法有多种,包括但不限于以下几种:

1. 层析法:包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。

2. 电泳法:包括区带电泳、等电点聚焦等。

3. 有机溶剂提取:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。

4. 盐析:将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液,使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏,导致蛋白质沉淀。

5. 免疫沉淀法:利用特异抗体识别相应的抗原蛋白,并形成抗原抗体复合物的性质,可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。

6. 透析和超滤法:透析利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开;超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜,达到浓缩蛋白质溶液的目的。

以上方法可以根据实际需要进行选择,必要时可以组合使用。请注意,不同方法的效果和适用范围可能存在差异。

蛋白质纯化技术[仅供参考]

蛋白质纯化技术[仅供参考]
▫ 阴离子交换柱:凝胶带正电荷,蛋白质带 负电荷
• 介质
▫ 惰性支持物:琼脂糖,葡聚糖… ▫ 带电基团:羧甲基—带负电;二乙基氨
基—带正电 ▫ 平衡离子:
负电基团:H+或Na+ 正电基团:OH-或Cl-
50
医疗类别
•离子交换层析( Ion exchange )
阳离子交换: 阴离子 先, 阳离子 后
*而且所用的主要技术手段都基本相同。
28
医疗类别
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
• 总原则 • 以合理的效率、速度、收率和纯度, • 将目标蛋白从细胞的全部其他成分, 特别是从杂蛋白中分离出来, • 同时仍保留其生物学活性和化学完整 性。
29
医疗类别
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
• 步骤 ▫ 选择实验材料,实验材料预处理 ▫ 蛋白质的提取 ▫ 蛋白质的粗分级 ▫ 蛋白质的细分级 ▫ 蛋白质的鉴定
▫ 高离子强度下待分离的样品吸 附在疏水介质上,然后降低离 子强度选择性将样品解吸,疏 水弱的物质先洗脱,疏水强的 物质后洗脱。
55
4.2.电泳( Electrophoresis医疗类)别
• 电泳就是带电颗粒在电场作用下,向着与其 电性相反的电极移动。
56
医疗类别
•蛋白质常用电泳技术
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS--PAGE)

蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化

一,蛋白质(包括酶)的提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等)。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值

蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2、盐浓度

稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

(二)有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内(度为10%,40度为6.6%)不会引起酶的变性失活。另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。

球蛋白的分离纯化与鉴定

球蛋白的分离纯化与鉴定
二、实验原理
(三)如何分离得到纯化的-球蛋白?
如何将带有不同性质电荷的蛋白质分离呢?
离子交换层析:利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 •离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆 的交换过程;带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂;带 负电荷的交换剂称阳离子交换剂。
•本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂,其分子带电 形式为:纤维素-OC2H4N+H(C2H5)2,溶液中带负电荷的离子可 与其进行交换结合,带正电荷的离子则不能,这样便可达 到分离纯化的目的。
• 避免气泡、纹路,凝胶面始终低于液面。 • 如凝胶表面不平时,可用玻棒轻轻搅动,让凝胶自然沉
降,使表层平整。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤 (2)上样与洗脱:凝胶面始终低于液面
使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面
用滴管吸取盐析球蛋白液,小心缓慢地加到凝胶床表面上
淡黄色
然后打开下端出口,使样品进入凝胶床,关闭出口
Contents
1 实验目的与要求 2 实验原理 3 操作步骤 4 结果分析
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
一、实验目的与要求 了解分离纯化蛋白质的基本原理; 掌握柱层析技术。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
二、实验原理 本实验为一综合性大实验,目的是要从血清中获得 纯化的-球蛋白。
血清中的蛋白质有两大类:清蛋白和球蛋白(、、)。

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:

(一)材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有:

1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。

(三)蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法:

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法

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脱水作用
--
酸-


-- -
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
溶液中蛋白质的聚沉
二、蛋白质的胶体性质
胶体性质(colloidal system)
胶体溶液的特点: 分散相质点直径在1-100 nm内 分散相质点带同种静电荷,不易聚集沉淀 溶于水 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
蛋白质的分离纯化的基础 蛋白质的分离纯化原则和程序 蛋白质的含量测定 蛋白质纯度鉴定 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质层析技术 蛋白层析的主要技术
10/12/2015
3
第一部分
蛋白质的分离纯化的基础:
结构和特性
蛋白质的结构和特性
1. 酸碱性质 2. 胶体性质 3. 分子量的测定 4. 结构和形状
通常长轴与短轴之比小于10者为球状蛋白 质,大于10者为纤维状蛋白质。
球状蛋白质
近似于球形或椭圆形,生物界中的大多数蛋白 质为球状蛋白质,如大多数的酶类、血红蛋白 、肌红蛋白以及多种溶解于胞液或体液中的蛋 白质。球状蛋白质一般可溶于水,并且具有特 异的生物学活性(如血红蛋白运输氧、酶起催 化作用等)。
3、细分级分离
蛋白质的分子结构包括
一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure)
球状和纤维蛋白质
根据蛋白质分子的形状可分为: 球状蛋白质(globular protein) 纤维状蛋白质(fibrous protein)
单位:Dalton(道尔顿),
英国化学家、物理学家,原子学说创始人John Dalton. 1道尔顿=1×C12绝对质量/12=1/N g( N为阿伏伽德罗常数)
≈1.67×10-27千克
蛋白质分子量的测定
1、最小分子量测定法: 2、渗透压法 3、超离心法 4、凝胶过滤法 5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1966年,Andrews得出一个经验公式: lgMr = a/b—Ve/bVo
Ve 为洗脱体积。它是自加样品开始到该 组分的洗脱峰(峰顶)出现时所流出的 体积。Vo为外水体积,Mr 为相对分子质 量,a和b为常数。
5、 SDS-PAGE 测分子量
(sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis)
1、最小分子量测定法
测定蛋白质中某一微量元素的含量 如Mb含Fe为0.335%,则M=55.8/0.335%=16700。
这就是最小分子量。其实,真实分子量是最小分子 量的n倍,n指Fe的数目,Mb的n=1,所以 M=16700。
4、凝胶过滤法 (gel filtration)
分子筛效应: 大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来
一、蛋白质的酸碱性质
两性电解质 可解离基团:α-NH3+
α-COO侧链上的功能基团 氨基酸有的化学性质蛋白质就有 pI=正负电荷相等,净电荷为零时的pH
水化膜
+++

+
+碱
++

Leabharlann Baidu
- -
- -

- --

带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
脱水作用
++ +
+
+
+ ++
脱水作用 碱
蛋白质属于生物大分子之一,分子量范围可达1万 至100万之间,其分子的直径在1~100 nm,为胶粒 范围之内。
蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷(双电层) 水化膜:1g蛋白结合0.3-0.5g水
蛋白质溶液具有丁达尔效应、 布朗运动以及不能通过半透膜等 性质
三、蛋白质分子量的测定
蛋白质分子大小 6—1,000 kD
Advanced Biochemistry Fall 2015
Protein Separation and Purification
蛋白质分离和纯化-I
蛋白质分离纯化的必要性
需要单一的蛋白质研究其结构与功能
化学修饰需要单一的蛋白质
纯化改造过的蛋白质,从而开发出性 能更优良的蛋白质
Lecture Outline
1、前处理(pretreatment)
去杂质、脱脂
细胞破碎
机械破碎法
研磨法 组织捣碎器法 超声波法 压榨法 冻融法
溶胀 自溶 化学法 酶解法
缓冲液溶提、离心或过滤去除细胞碎片
缓冲液的选择
离子强度:0.1-0.2 M pH范围:7.0 - 8.0
最常使用的两种缓冲液
磷酸盐缓冲液 Tris缓冲液
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
① SDS-蛋白质形成复合物,1.4克SDS与1克蛋白质结 合,相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。 这样,蛋白质的原有电荷效应被覆盖,带有相同密度 负电荷,分子量大小与迁移率成正比。
② SDS改变蛋白质分子单体构象,全部变成似雪茄烟 形的长椭圆棒型。
四、蛋白分子的结构和形状
添加成分
1、抗氧化剂:DTT,BME,Cys,GSH 2、酶抑制剂:EDTA,蛋白酶抑制 PMSF 3、酶的辅因子或辅基 4、植物细胞(酚类化合物):PVP 5、抗菌剂:NaN3
2、粗分级分离
目的:去除杂蛋白,核酸,多糖等杂质, 同时浓缩蛋白质溶液
特点:简便,处理量大
方法:盐析、等电点沉淀、有机溶剂分 级分离、超过滤、凝胶过滤、冷冻真空 干燥、加热变性沉淀,等等。
增加蛋白制品 (preparation) 的纯度 (purity) 或比活(specific activity)。 去除变性的和不要的蛋白质。 所得蛋白质的产量达到最高值。
蛋白质分离纯化的一般程序
前处理(pretreatment) 粗分级分离(rough fractionation) 细分级分离(fine fractionation) 结晶(crystallization)及蛋白质的鉴定
纤维蛋白质
纤维状蛋白质多是构成机体的结构 材料,如皮肤、肌腱、软骨及骨组 织中的胶原蛋白,肺、大动脉等中 的弹性蛋白,毛发及皮肤中的角蛋 白,蚕丝中的蚕丝蛋白等。它们一 般难溶于水,在机体中起着粘合、 支撑、保护、负重和营养等功能。 纤维状蛋白质的更新较慢。
第二部分 蛋白质的分离纯化原则和程序
蛋白质分离纯化的一般原则
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