HPLC法校正因子研究中的几个问题-张哲峰
164色谱法在药品研发中的应用及常见问题分析
发布日期20061130栏目化药药物评价>>化药质量控制标题色谱法在药品研发中的应用及常见问题分析作者张哲峰部门正文内容审评三部张哲峰摘要：色谱方法在药物研发中占据重要地位，本文介绍了一些常用的色谱方法原理以及在药物研发，尤其质量控制中应用的注意之处，并列举了申报资料中色谱法应用的一些常见问题，以引起大家的关注。
关键词：色谱法类型常见问题色谱法是一种分离分析技术，通过将样品中的组分分离，再逐个分析，因此是分析混合物、检测化合物纯度的有力手段，因而在药物研发中广为应用，包括原料药、中间体、制剂和生物体液中化合物的定性和定量，涉及的待测物包括手性或非手性药物、过程杂质、残留溶媒、附加剂（如防腐剂）、分解产物、从容器和密闭包装或制造过程中带入的杂质、植物药中的农药和代谢物等，包括制备工艺研究、中间体控制、质控检验、稳定性及药物动力学研究等过程。
因此，色谱方法在药物研发中占据举足轻重的地位。
一、色谱法的几种常见类型1、HPLC法：（1）手性液相色谱将“手性识别”或“手性环境”引入色谱系统中，以形成暂时非对映异构体复合物，从而直接分离药物对映体；或将对映体衍生化生成非对映体，而得以分离。
即分离光学异构体可用手性固定相、衍生化后在非手性固定相上或在非手性固定相上用流动相手性添加剂形成非对映体来实现。
（2）离子交换色谱使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。
带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离；带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。
不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。
可用pH程序洗脱。
（3）离子对/亲和色谱常用反相离子对色谱，用缓冲液和加入的对离子（与被分离的样品荷相反电荷）分离。
分离受pH、离子强度、温度、浓度和共存的有机溶剂类型的影响，亲和色谱，一般用于大分子，使用配合体（共价结合在固体基质上的生物活性分子），与其同类的抗原（分析介质）反应，生成可逆转的复合物，通过改变缓冲条件洗脱。
审评中心关于校正因子的说明
20111207栏目化药药物评价>>化药质量控制标题HPLC法校正因子研究中的几个问题作者张哲峰部门化药药学二部正文内容HPLC法具有将不同物质分离后逐一定量的分离分析能力，在药品有关物质检测中发挥着越来越重要的作用，成为药品杂质控制中常用而有效的手段之一。
在杂质对照品法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法、峰面积归一化法等几种常用的杂质定量方式中，校正因子的研究对于选择合适定量方式，准确定量杂质具有重要意义，因而成为杂质分析方法研究中的重要内容之一。
但从目前注册申报资料实际情况来看，校正因子的研究和使用中尚存在一些需要进一步思考和关注的问题。
1.校正因子的定义及特点一般来讲，HPLC定量测定中，物质的检测量W与色谱响应值（峰面积等）A之间的比值称为绝对校正因子，即单位响应值（峰面积等）所对应的被测物质的量（浓度或质量）；而某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比，即为相对校正因子，即通常所讲的校正因子。
目前校正因子主要用于“加校正因子的主成分自身对照法”定量相关特定杂质，这种定量方式因考虑了杂质与主成分的绝对校正因子的不同所引起的测定误差，将标准物质的赋值信息转化为常数，固化在质量标准中，且不需长期提供标准物质，因而成为现阶段杂质控制较为理想可行的手段。
但这种方法有时会因不同仪器及色谱条件的波动，可产生一定范围的误差，需进行充分的方法耐用性验证，并结合色谱峰定位控制等措施，将误差控制在一定范围内。
2.校正因子的测定在校正因子的研究和使用中，标准物质、色谱条件、溶剂、检测波长等均是重要的影响因素，研究中需要予以关注。
2.1 校正因子的测定需要用到特定杂质及主成分的标准物质，这些标准物质应具备量值准确的特点，符合标准物质（对照品）的相关要求；其次，确定校正因子的分析方法应与最终确定的质量标准方法一致，色谱条件等需经筛选优化后确定，如有变更，需考虑对校正因子的影响，必要时重新确定；第三，要关注影响待测物UV吸收的各种因素，如溶液制备所用溶剂最好与最终确定的流动相相同，检测波长最好在特定杂质及主成分UV曲线的峰或谷处，避开吸收值急剧变化波段，以保证测定方法具有较好的耐用性，并保持测定结果的恒定。
药品含量测定方法设计中的几个问题
日期：2004-5-25 16:35标题：药品含量测定方法设计中的几个问题正文：药品含量测定方法设计中的几个问题审评三部药学组张哲峰药品的含量或效价是评定药品的主要指标之一，设计其测定方法时，应根据药品特性、剂型、处方、鉴别试验和纯度检查综合考虑，当鉴别试验和纯度检查保证了专属性和纯度的情况下，含量测定方法的选择要着眼于准确性、稳定性和可重复性。
◆原料药：对于组份单一的原料药，首选精密度高，操作简便、快速的容量法测定含量，可根据药物分子中所具有的官能团及其化学性质，选用不同的容量分析方法，但应符合如下条件：（1）反应须按一个方向完全进行；（2）反应要迅速，必要时可通过加热或加入催化剂等方法提高反应速度；（3）共存物不得干扰主要反应，或能用适当方法消除；（4）确定等当点的方法要简单、灵敏；（5）标化滴定液所用基准物质易得，并符合纯度高、组成恒定且与化学式符合、性质稳定（标化时不发生副反应）等要求。
方法叙述中要强调：（1）供试品的取用量应满足滴定精度的要求（消耗滴定液约20ml）；（2）滴定终点的判断要明确，如选用指示剂法，应考虑其变色敏锐，提供滴定曲线，并用电位法校准其终点颜色。
（3）为排除因加入其它试剂或混入杂质对测定结果的影响，或便于剩余滴定法的计算，可采用“将滴定的结果用空白试验校正”的办法；（4）最后要给出滴定度（采用四位有效数字）。
容量法测定含量要注意参加反应的应是药物分子活性部分，而不应是次要的酸根或碱基部分。
如盐酸西替立嗪、盐酸氨溴索，有研究者采用氢氧化钠滴定液滴定法直接测定其含量，事实上这种方法测定的是其中盐酸的含量，由于其成盐工艺中的酸、碱配比不当时，可严重影响成品酸碱度，故此法的测定结果并不能代表其活性成分有机碱的含量，这种方法不能准确把握其有效成分含量。
应采用非水滴定法，以无水冰醋酸为溶剂屏蔽掉盐酸的干扰，用高氯酸滴定其有机碱的含量。
高氯酸非水滴定法因适应性广（适用于有机弱碱及其盐类）、方法简便和测定结果精密等优点，在化学原料药的含量测定中较为常用。
CTD申报资料中杂质研究的几个问题
发布日期20121226栏目化药药物评价>>化药质量控制标题CTD申报资料中杂质研究的几个问题作者张哲峰成海平宁黎丽田洁部门化药药学二部正文内容摘要：杂质研究与控制是把控药品质量风险的重要内容之一，基于杂质谱分析的杂质控制是“质量源于设计”基本理念在杂质研究与控制中的具体实践，需要与CMC各项研究乃至药理毒理及临床安全性研究等环节关联思考、综合考虑，而不仅仅拘泥于提供准确的分析数据。
本文针对当前CTD申报资料中杂质研究方面存在的问题与不足，结合CTD过程控制和终点控制相结合、研究和验证相结合、全面系统的药品质量控制理念，探讨仿制药杂质研究与控制的基本逻辑思路，提出CTD申报资料中杂质研究与控制方面几个需要关注的问题。
关键词：杂质研究与控制杂质谱CTD格式杂质研究与控制是一项系统工程，需要以杂质谱分析为主线，安全性为核心，按照风险控制的策略，将杂质研究与CMC各项研究，乃至药理毒理及临床安全性研究等环节关联思考、综合考虑，而不仅仅拘泥于提供准确分析数据的传统思维，不是一项孤立的分析工作。
CTD（Common Technical Document）申报格式体现了过程控制和终点控制相结合、研究和验证相结合、全面系统的药品质量控制理念，更加符合杂质研究与控制的基本规律和逻辑思路。
自2011年4月起，药审中心陆续发布了多项有关CTD格式及技术审评的相关要求及电子刊物，对于国内研发单位正确理解CTD格式内含的基本精神起到了一定的促进作用，但就目前阶段的申报情况看，有些申报资料在杂质研究方面仍存在一些不足，仅仅是形式上的CTD格式，尚未实质性贯彻CTD的基本逻辑思路。
以下是针对目前CTD申报资料中杂质研究相关问题的一些考虑。
1、CTD格式中杂质控制的考虑要体现在CMC的各个环节，而不是仅仅局限在“质量控制”模块。
如制剂的原辅料控制中，原辅料的选择与控制要考虑以符合制剂质量要求（杂质等）为核心，必要时进行精制处理并制定内控标准；关键工艺步骤及参数的确立、工艺开发过程等要考虑以杂质是否得到有效控制为重点关注之一；制剂相关特性中要体现与原研产品杂质谱等的对比情况；包材、贮藏条件以及有效期的确立等也要以杂质是否处于安全合理的可控范围内为核心等等。
hplc法校正因子研究中的几个问题
深度研究报告：HPLC法校正因子研究1. 研究目标本研究旨在探究HPLC法校正因子的相关问题，包括校正因子的定义、测定方法、影响因素以及其在HPLC分析中的应用，以期提供关于HPLC法校正因子研究的全面了解和深入认识。
2. 方法2.1 校正因子的定义和测定方法校正因子是用于校正HPLC分析结果的一个重要参数，它可以将峰面积或峰高转换为被测物的浓度。
本研究将首先对校正因子的定义进行详细阐述，然后介绍常用的测定方法，包括外标法、内标法和标准曲线法等。
通过对比不同方法的优缺点，选择合适的测定方法进行后续研究。
2.2 影响校正因子的因素研究校正因子的准确性和稳定性对于HPLC分析结果的可靠性至关重要。
因此，本研究将对影响校正因子的因素进行深入研究。
这些因素包括仪器条件（如流速、柱温等）、样品条件（如浓度、溶剂等）、分析方法（如梯度洗脱、等温洗脱等）等。
通过系统的实验设计和数据分析，探究这些因素对校正因子的影响规律，为优化校正因子的测定提供科学依据。
2.3 校正因子在HPLC分析中的应用校正因子在HPLC分析中有着广泛的应用。
本研究将通过实验验证校正因子在不同样品类型（如药物、食品、环境样品等）的HPLC分析中的有效性和适用性。
同时，还将探讨校正因子在定量分析、质量控制和样品比较等方面的应用，并与其他校正方法进行比较，评估校正因子的优势和局限性。
3. 发现3.1 校正因子的测定方法比较和选择通过对外标法、内标法和标准曲线法的比较研究发现，标准曲线法是一种较为常用和有效的测定校正因子的方法。
其具有测定简单、适用范围广等优势，适用于大多数HPLC分析。
然而，在某些特殊情况下，如样品浓度较低或存在复杂的干扰物时，内标法可能更为适用。
3.2 影响校正因子的因素分析实验结果表明，仪器条件、样品条件和分析方法都对校正因子的测定结果产生一定的影响。
其中，仪器条件中的流速和柱温对校正因子的准确性和稳定性影响较大。
样品条件中的浓度和溶剂的选择也对校正因子有一定的影响。
浅谈色谱方法验证原则
浅谈“色谱方法验证原则”张哲峰史继峰（国家食品药品监督管理局药品审评中心审评三部）摘要“色谱方法验证”是为保证色谱方法的可靠性和准确性进行的方法学验证，是建立和使用色谱方法所必需进行的实验步骤。
本文系参照美国ＦＤＡ药品审评和研究中心（ＣＤＥＲ）“色谱方法验证审评指南”的思路及其要点，在参考美、英、欧药典中有关色谱方法的要求以及国内专家有关论述的基础上，结合我国新药研发中色谱法应用现状编辑整理而成。
文章以ＲＰ—ＨＰＬＣ为主，阐述了色谱法在新药的制备工艺研究、中间体控制、质控检验、稳定性考察及药物动力学研究等方面应用的注意要点，尝试提出“色谱方法验证原则”，以期对新药研发及技术审评有所参考。
．色谱方法因具有分离分析的特殊优势而在新药研发中广为应用，包括原料药、中问体、制剂和生物体液７３９中化合物的定性和定量，涉及的成分包括手性或非手性药物、过程杂质、残留溶媒、附加剂（如防腐剂）、分解产物、从容器和密闭包装或制造过程中带入的杂质、植物药中的农药和代谢物等。
可见，色谱方法的可行性是至关重要的，色谱方法的验证在新药研发中占有举足轻重的地位。
色谱方法运用的目的是得到准确、可靠的数据，包括制备工艺研究、中间体控制、质控检验、稳定性及药物动力学研究等过程。
得到的数据用于药品研发或批准后的定性和定量，试验包括原料的验收、产品出厂检验、过程检验（Ｉｎ—ｐｒｏｃｅｓｓｔｅｓｔｉｎｇ）的质量保证。
色谱方法的验证是由药品的研发者或生产者来检验其方法是否达到预期的可靠性、准确度和精密度的过程。
◆色谱类型色谱是一种分离分析技术，通过该技术，先将样品中的组分分离，再逐个进行分析，因此是分析混合物、检测化合物纯度的最有力手段。
Ａ高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）ＨＰＬＣ法通常分为以下类型：１手性液相色谱分离光学异构体可用手性固定相、衍生化后在非手性固定相上或在非手性固定相上用流动相手性添加剂形成非对映体来实现。
２离子交换色谱使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。
关于校正因子和响应因子的计算推导
关于校正因子和响应因子的计算推导校正因子=c/A,相对校正因子=（A样/c样）/(A杂/c杂)=（c杂/A杂）/（c样/A样）响应因子RF=A/c,相对响应因子RRF=（A杂/c杂）/（A样/c样）=（c样/A样）/（c杂/A 杂）。
药典上相对校正因子=（A内/C内）/(A对/c对)=（c对/A对）/（c内/A内）推导：假设响应因子为k，则有k=A/m（单位质量的物质相当于多少峰面积），令杂质k杂=A杂/m杂，主成分k样=A 样/m样，则主成分中杂质含量w=m杂/m样*100%，即有：w=（A杂/k杂）/（A样/k样）*100%=（k样/k杂）*（A杂/A样）*100% =（A样/c样）/(A杂/c杂)* （A杂/A样）*100%=相对校正因子*（A杂/A样）*100%=1/RRF*（A杂/A样）*100%.= A杂/（A样*相对响应因子）故用相对响应因子就要除，用校正因子就要乘。
以下是前人的讨论：药典规定内标法计算含量的校正因子F=（A内标/C内标）/（A对照/C对照）此时是用内标物质作为标准计算主成分含量的情况，也就是内标物是标准物，我们想知道主成分的含量当采用加校正因子主成分自身对照计算杂质校正因子时，主成分是标准物，我们想知道杂质的含量，对应上去，杂质的校正因子计算应该是F=（A主峰/C主峰）/（A杂/C杂）所以药典规定计算杂质时乘以校正因子是没错的，只是你把杂质校正因子的计算搞错啦药痴：一个是relative response factor （相对响应因子，美国药典）计算的时候是除，一个是correction factors （应该是相对校正因子欧洲药典和英国药典）计算的时候是乘。
：比如我现在要做某个杂质与主成分的校正因子，我该如何做呢？比如我的一个特定杂质的限度为0.5%，我该如何配制杂质的浓度和主成分的浓度？我原来做的时候，领导说配制3个浓度做，限度的50%，100%和150%，然后用三个浓度计算的值平均，不知大家怎么做的？漫画窝窝2：1 我不知道校正因子应该在质量研究时用到，还是在定方法时就用到。
仿制药研发中的几个关键问题-CDE张哲峰
仿制药研发中的几个关键问题张哲峰CDE化药药学二部仿制药（又称Generic Drug）是指与原研药（或称商品名药）在剂量、安全性和效力（strength）、质量、作用（performance）以及适应症（intended use）上相同的一种仿制品，又称通用名药、非专利药等。
仿制研发的目标是实现临床应用上仿制药与原研药的“可替代性”。
按照美国FDA的观点，能够获得批准的仿制药必须满足以下条件：和被仿制产品含有相同的活性成分，其中非活性成分可以不同；和被仿制产品的适应症、剂型、规格、给药途径一致；生物等效；质量符合相同的要求；生产的GMP标准和被仿制产品同样严格。
仿制药的上市，可以提供更加充足的临床供应，较大幅度地降低药价，缓解患者的经济负担，具有降低医疗支出、提高药品可及性、提升医疗服务水平等重要经济和社会效益。
国外统计数据显示，随着仿制药上市数量的增加，药品价格最低将下降到原研药最初价格的9%左右。
尽管如此，仿制药与原研药的差异也须引起应有的关注并着力进行有效地控制。
仿制药只是复制了原研药主要成份的分子结构，而原研药生产中关键工艺步骤、关键试剂、生产工艺的“设计空间”或关键辅料的质量控制等属于企业核心机密内容，是仿制企业难以合法拷贝的，导致仿制药的杂质谱、释药行为等关键质量属性，在有些情况下难以与原研药完全一致；同时，相关法规也未规定仿制药中其他成份（辅料）的添加与原研药必须相同；在仿制药许可中，其生物利用度应具有原研药的±20%左右等。
这些因素导致仿制药的安全性有效性与原研药间的差异难以完全消除。
美国家庭医师学会曾在研究报告中用事实来表明原研药的疗效和安全性并不是仿制药可以完全可替代的，尤其是在治疗危急患者和危急疾病时更是需要高度关注。
事实上，如何保持仿制药与原研药的“一致”，如何研究求证仿制药与原研药的“差异”，如何准确评估并有效控制这些“差异”带来的风险，正是仿制药研发中需要高度关注的重点。
HPLC法校正因子研究中的几个问题
HPLC法校正因子研究中的几个问题20111207HPLC法具有将不同物质分离后逐一定量的分离分析能力，在药品有关物质检测中发挥着越来越重要的作用，成为药品杂质控制中常用而有效的手段之一。
在杂质对照品法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法、峰面积归一化法等几种常用的杂质定量方式中，校正因子的研究对于选择合适定量方式，准确定量杂质具有重要意义，因而成为杂质分析方法研究中的重要内容之一。
但从目前注册申报资料实际情况来看，校正因子的研究和使用中尚存在一些需要进一步思考和关注的问题。
1.校正因子的定义及特点一般来讲，HPLC定量测定中，物质的检测量W与色谱响应值（峰面积等）A之间的比值称为绝对校正因子，即单位响应值（峰面积等）所对应的被测物质的量（浓度或质量）；而某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比，即为相对校正因子，即通常所讲的校正因子。
目前校正因子主要用于“加校正因子的主成分自身对照法”定量相关特定杂质，这种定量方式因考虑了杂质与主成分的绝对校正因子的不同所引起的测定误差，将标准物质的赋值信息转化为常数，固化在质量标准中，且不需长期提供标准物质，因而成为现阶段杂质控制较为理想可行的手段。
但这种方法有时会因不同仪器及色谱条件的波动，可产生一定范围的误差，需进行充分的方法耐用性验证，并结合色谱峰定位控制等措施，将误差控制在一定范围内。
2.校正因子的测定在校正因子的研究和使用中，标准物质、色谱条件、溶剂、检测波长等均是重要的影响因素，研究中需要予以关注。
2.1 校正因子的测定需要用到特定杂质及主成分的标准物质，这些标准物质应具备量值准确的特点，符合标准物质（对照品）的相关要求；其次，确定校正因子的分析方法应与最终确定的质量标准方法一致，色谱条件等需经筛选优化后确定，如有变更，需考虑对校正因子的影响，必要时重新确定；第三，要关注影响待测物UV吸收的各种因素，如溶液制备所用溶剂最好与最终确定的流动相相同，检测波长最好在特定杂质及主成分UV曲线的峰或谷处，避开吸收值急剧变化波段，以保证测定方法具有较好的耐用性，并保持测定结果的恒定。
省局仿制药一致性评价【02】——仿制药一致性评价的几个关键问题-张哲峰(博士)
原研产品-RLD 降血脂 片剂 包衣速释片，无刻痕 20mg 口服 Tmax\Cmax\AUC\T1/2
开发目标-QTPP 相同，参照RLD说明书 药学等效，相同剂型 速释设计，相同标签要求 药学等效，相同规格 药学等效，相同给药途径 BE要求，确保迅速起效
增溶剂、抗氧剂BHT、常规辅料 相同相近
已知杂质A、B、C、D、F， 未知单一杂质，杂质总量 标准：40min，85%（方法、转 溶出度 速、介质） 含量均匀度 符合要求 水分 2.0% 含量测定 95.0%-110.0% 稳定性 避光，密闭，室温24℃,有效期 有效期 36个月 包装材料 高密度聚乙烯瓶（带干燥剂） 有关物质
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研发与评价重心的战略转移 质量检测 产品
与标准
与工艺
不仅仅求证与原研药的“一致”，更要关注如何始终确保“一致”。 对产品和工艺的深刻理解、设计和控制策略。
明确关键物料属性、关键工艺参数以及潜在的高风险变量 理解工艺变异的主要来源并加以控制„
质量控制不是孤立模块，将质量控制和风险管理结合到对产品和工
预期的临床用途，给药途径，剂型，给药系统； 剂量规格； 容器密闭系统； 影响药代动力学和质量的关键属性（如：释放度）； 药品有效期及效期内的质量属性（如：有关物质，含量和 稳性）； —ICH Q8
仿制药QTPP 基于对原研产品的分析认识。
物质基础一致、质量特征等同、 生物等效 药品质量、安全性和有效性
调释给药系统—缓释、迟释、定位释放等 靶向给药系统—脂质体、微球、微囊等 脉冲自动调控式给药系统
关键辅料的选择与制剂效能
典型案例—问题：某口服缓释片，根据RLD说明书中处方信息 采用羟丙甲纤维素为缓释材料，体外释放曲线不一致。
hplc 法采用内标法中校正因子意义及计算中的应用
hplc 法采用内标法中校正因子意义及计算中的应用摘要：一、HPLC法内标法的基本原理二、校正因子的意义及其在HPLC法中的应用三、校正因子的计算方法及其注意事项四、总结与展望正文：一、HPLC法内标法的基本原理高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析方法，广泛应用于化学、生物和食品等领域。
在HPLC法中，内标法是一种重要的校正方法。
内标法原理是在待分析样品中添加一个已知浓度的内标物，通过比较待测物和内标物的峰面积或峰高，以校正实验误差，提高分析结果的准确性。
二、校正因子的意义及其在HPLC法中的应用校正因子是在HPLC法中，用于描述待测物和内标物在色谱条件下的相对响应程度的一个参数。
校正因子的引入，可以消除实验过程中由于仪器、操作和样品制备等因素引起的误差，使分析结果更加可靠。
在校正因子计算正确的情况下，待测物的浓度可以通过其峰面积与校正因子的乘积来准确计算。
在HPLC法中，校正因子的应用主要体现在以下几个方面：1.提高分析结果的准确性：校正因子可以消除实验过程中的系统误差，使分析结果更加接近真实值。
2.简化数据处理：通过校正因子，可以将待测物的浓度直接通过峰面积计算，简化数据处理过程。
3.提高分析效率：校正因子可以使分析人员在相同的色谱条件下，快速准确地测定待测物的浓度，提高分析效率。
三、校正因子的计算方法及其注意事项1.计算方法：校正因子通常通过实验测定待测物和内标物的响应因子，然后计算得出。
响应因子包括峰面积响应因子和峰高响应因子，可以根据下式计算：校正因子= 响应因子（待测物）/ 响应因子（内标物）2.注意事项：（1）选择合适的内标物：内标物应与待测物在色谱条件下的响应行为相似，且浓度已知。
（2）确保样品制备和进样的一致性：样品制备和进样的过程中，应尽量减小对待测物和内标物的影响，以确保校正因子的准确性。
（3）多次实验验证：为保证校正因子的可靠性，应进行多次实验，对待测物和内标物的响应因子进行测定。
(2)HPLC法校正因子研究中的几个问题
HPLC法校正因子研究中的几个问题张哲峰化药药学二部HPLC法具有将不同物质分离后逐一定量的分离分析能力，在药品有关物质检测中发挥着越来越重要的作用，成为药品杂质控制中常用而有效的手段之一。
在杂质对照品法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法、峰面积归一化法等几种常用的杂质定量方式中，校正因子的研究对于选择合适定量方式，准确定量杂质具有重要意义，因而成为杂质分析方法研究中的重要内容之一。
但从目前注册申报资料实际情况来看，校正因子的研究和使用中尚存在一些需要进一步思考和关注的问题。
1.校正因子的定义及特点一般来讲，HPLC定量测定中，物质的检测量W与色谱响应值（峰面积等）A之间的比值称为绝对校正因子，即单位响应值（峰面积等）所对应的被测物质的量（浓度或质量）；而某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比，即为相对校正因子，即通常所讲的校正因子。
目前校正因子主要用于“加校正因子的主成分自身对照法”定量相关特定杂质，这种定量方式因考虑了杂质与主成分的绝对校正因子的不同所引起的测定误差，将标准物质的赋值信息转化为常数，固化在质量标准中，且不需长期提供标准物质，因而成为现阶段杂质控制较为理想可行的手段。
但这种方法有时会因不同仪器及色谱条件的波动，可产生一定范围的误差，需进行充分的方法耐用性验证，并结合色谱峰定位控制等措施，将误差控制在一定范围内。
2.校正因子的测定在校正因子的研究和使用中，标准物质、色谱条件、溶剂、检测波长等均是重要的影响因素，研究中需要予以关注。
2.1 校正因子的测定需要用到特定杂质及主成分的标准物质，这些标准物质应具备量值准确的特点，符合标准物质（对照品）的相关要求；其次，确定校正因子的分析方法应与最终确定的质量标准方法一致，色谱条件等需经筛选优化后确定，如有变更，需考虑对校正因子的影响，必要时重新确定；第三，要关注影响待测物UV吸收的各种因素，如溶液制备所用溶剂最好与最终确定的流动相相同，检测波长最好在特定杂质及主成分UV曲线的峰或谷处，避开吸收值急剧变化波段，以保证测定方法具有较好的耐用性，并保持测定结果的恒定。
HPLC色谱分析中常见问题
2020/10/19
6
进样阀
流路检查顺序
泵
预
柱
分
析
柱
检测器
2020/10/19
7
柱效低的原因 频繁更换流动相组成——加速柱效降低
最好一根色谱柱使用的流动相成分和pH值相近， 如始终在酸性条件下或碱性条件下工作
色谱柱的选择不合适或使用时间久
更换色谱柱（厂家，型号）
进样操作不当
导致进样后，各组分出峰忽而正常，忽而异 常，且峰位置发生明显变化
更换主动阀阀芯，可消除上述症状
2020/10/19
13
异常情况
主
动
阀 故
异常压力线
障
对
异常情况
色
谱 分
异常压力线
离 影
正常情况
响
2020/10/19
正常压力线
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解决办法
使用保护柱可延长分析柱寿命
每天实验后应用强溶剂（例甲醇-水等，至少2030倍柱体积的量）冲洗色谱柱
并定期进行保养，以低流速的强溶剂较长时间冲 洗色谱柱
2020/10/19
4
样品纯度差——有微小的颗粒堵塞管路
可用滤膜过滤样品后再进样 样品浓度高——连续进样，造成过载
如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在 0.5mg/ml以下较适宜
24. 432
70
60
2. 357
进样量10µL
例：三七提取物 以甲醇为溶剂， 流动相： 乙腈-水,梯度洗脱， 乙腈初始浓度20%
2020/10/19
50
正常
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20. 466 25. 208
2. 096 3.2.3465902. 953 3. 895 5. 152
浅谈色谱方法验证原则
浅谈“色谱方法验证原则”张哲峰史继峰（国家食品药品监督管理局药品审评中心审评三部）摘要“色谱方法验证”是为保证色谱方法的可靠性和准确性进行的方法学验证，是建立和使用色谱方法所必需进行的实验步骤。
本文系参照美国ＦＤＡ药品审评和研究中心（ＣＤＥＲ）“色谱方法验证审评指南”的思路及其要点，在参考美、英、欧药典中有关色谱方法的要求以及国内专家有关论述的基础上，结合我国新药研发中色谱法应用现状编辑整理而成。
文章以ＲＰ—ＨＰＬＣ为主，阐述了色谱法在新药的制备工艺研究、中间体控制、质控检验、稳定性考察及药物动力学研究等方面应用的注意要点，尝试提出“色谱方法验证原则”，以期对新药研发及技术审评有所参考。
．色谱方法因具有分离分析的特殊优势而在新药研发中广为应用，包括原料药、中问体、制剂和生物体液７３９中化合物的定性和定量，涉及的成分包括手性或非手性药物、过程杂质、残留溶媒、附加剂（如防腐剂）、分解产物、从容器和密闭包装或制造过程中带入的杂质、植物药中的农药和代谢物等。
可见，色谱方法的可行性是至关重要的，色谱方法的验证在新药研发中占有举足轻重的地位。
色谱方法运用的目的是得到准确、可靠的数据，包括制备工艺研究、中间体控制、质控检验、稳定性及药物动力学研究等过程。
得到的数据用于药品研发或批准后的定性和定量，试验包括原料的验收、产品出厂检验、过程检验（Ｉｎ—ｐｒｏｃｅｓｓｔｅｓｔｉｎｇ）的质量保证。
色谱方法的验证是由药品的研发者或生产者来检验其方法是否达到预期的可靠性、准确度和精密度的过程。
◆色谱类型色谱是一种分离分析技术，通过该技术，先将样品中的组分分离，再逐个进行分析，因此是分析混合物、检测化合物纯度的最有力手段。
Ａ高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）ＨＰＬＣ法通常分为以下类型：１手性液相色谱分离光学异构体可用手性固定相、衍生化后在非手性固定相上或在非手性固定相上用流动相手性添加剂形成非对映体来实现。
２离子交换色谱使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。
hplc法采用内标法中校正因子意义
hplc法采用内标法中校正因子意义摘要：一、HPLC法简介二、内标法原理三、校正因子的意义四、HPLC法中校正因子的应用五、实例分析六、总结与展望正文：一、HPLC法简介高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物和制药等领域。
HPLC法具有高灵敏度、高分辨率、快速分析等优点，成为实验室不可或缺的分析工具。
二、内标法原理在HPLC分析过程中，为了提高测量精度，常采用内标法进行校准。
内标法是将一个已知浓度的物质（内标物）与待测样品一起进样，通过比较待测物与内标物的响应值，消除仪器误差和操作误差，提高分析结果的准确性。
三、校正因子的意义校正因子是HPLC法中一个重要的参数，用于描述待测物与内标物在色谱条件下的响应差异。
校正因子越接近1，说明待测物与内标物的响应差异越小，分析结果越准确。
通过计算校正因子，可以对测量结果进行修正，提高分析结果的可信度。
四、HPLC法中校正因子的应用在HPLC法中，校正因子主要应用于定量分析。
通过比较待测物与内标物的响应值，可以计算出待测物的浓度。
在实际应用中，校正因子法可有效消除仪器、操作和样品制备等误差，提高分析结果的准确性。
五、实例分析以某制药企业为例，采用HPLC法测定某种原料药中有效成分的含量。
通过添加内标物，计算校正因子，并对测量结果进行修正，有效提高了分析结果的准确性。
这为企业产品质量控制提供了可靠的依据，有助于确保产品质量达到国家标准。
六、总结与展望本文介绍了HPLC法中内标法校正因子的意义及其在实际分析中的应用。
通过合理选择内标物和计算校正因子，可以有效提高HPLC法分析结果的准确性和可靠性。
药物研究中HPLC校正因子法的应用
药物研究中HPLC校正因子法的应用概述：标准物质一直是药品质量控制特别是纯度和含量分析的首选，但标准物质的供需矛盾，如有些杂质标准物质不易获取以及多个标准物质同时使用所带来的高昂检测成本等限制了标准物质的实际应用。
为解决这一问题，替代方法应运而生，高效液相色谱(HPLC)校正因子法便是其中之一。
该方法最初主要用于HPLC有关物质检查时对于特定杂质的定量，进而又逐渐用于中药多指标含量的测定，发展至今已经成为一项成熟的分析方法。
一定义在HPLC法定量测定中，通常所讲的校正因子是某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比，即相对校正因子，其计算公式如公式（1）。
校正因子在各国药典中均有应用，只是表述方式不尽相同。
《中国药典》与《欧洲药典》(EP10.0)基本一致，使用校正因子(correction factor)的概念，差别在于国内要求当已知杂质对主成分的相对校正因子在0.9～1.1内时，可以用主成分自身对照法计算杂质的含量，超出这个范围时宜用杂质对照品或者加校正因子的主成分自身对照法计算杂质的含量；而EP10.0中则规定校正因子在0.8～1.2时仍可使用主成分对照法计算杂质含量。
《美国药典》(USP)中给出了相对响应因子(relativeresponse factor)的概念，从其各论中具体计算方法可以推导出相对响应因子与相对校正因子是互为倒数的关系，在使用时需要注意将待测峰面积(A)与校正因子相乘或与相对响应因子(f)相除以校正峰面积。
c为待测物和参比物溶液浓度另外校正因子的使用也有一定的范围，如校正因子在0.2～5.0的范围以外时，表明杂质与主成分的UV吸收相差过大，校正因子的作用会受到显著影响，此时应改变检测波长等检测条件，使校正因子位于上述范围内，或使用结构或UV吸收与该杂质接近的另一标准物质为参照物质(如对照品易于获得、标准已采用对照品外标法定量的另一特定杂质)，重新确立校正因子；如校正因子仍无法调节至适当范围，需考虑采用杂质对照品外标法等适当方法定量。
HP LC法校正因子研究中的几个问题
化药药物评价>>化药质量控制HP LC法校正因子研究中的几个问题张哲峰20111207HPLC法具有将不同物质分离后逐一定量的分离分析能力，在药品有关物质检测中发挥着越来越重要的作用，成为药品杂质控制中常用而有效的手段之一。
在杂质对照品法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法、峰面积归一化法等几种常用的杂质定量方式中，校正因子的研究对于选择合适定量方式，准确定量杂质具有重要意义，因而成为杂质分析方法研究中的重要内容之一。
但从目前注册申报资料实际情况来看，校正因子的研究和使用中尚存在一些需要进一步思考和关注的问题。
1.校正因子的定义及特点一般来讲，HPLC定量测定中，物质的检测量W与色谱响应值（峰面积等）A之间的比值称为绝对校正因子，即单位响应值（峰面积等）所对应的被测物质的量（浓度或质量）；而某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比，即为相对校正因子，即通常所讲的校正因子。
目前校正因子主要用于“加校正因子的主成分自身对照法”定量相关特定杂质，这种定量方式因考虑了杂质与主成分的绝对校正因子的不同所引起的测定误差，将标准物质的赋值信息转化为常数，固化在质量标准中，且不需长期提供标准物质，因而成为现阶段杂质控制较为理想可行的手段。
但这种方法有时会因不同仪器及色谱条件的波动，可产生一定范围的误差，需进行充分的方法耐用性验证，并结合色谱峰定位控制等措施，将误差控制在一定范围内。
2.校正因子的测定在校正因子的研究和使用中，标准物质、色谱条件、溶剂、检测波长等均是重要的影响因素，研究中需要予以关注。
2.1 校正因子的测定需要用到特定杂质及主成分的标准物质，这些标准物质应具备量值准确的特点，符合标准物质（对照品）的相关要求；其次，确定校正因子的分析方法应与最终确定的质量标准方法一致，色谱条件等需经筛选优化后确定，如有变更，需考虑对校正因子的影响，必要时重新确定；第三，要关注影响待测物UV吸收的各种因素，如溶液制备所用溶剂最好与最终确定的流动相相同，检测波长最好在特定杂质及主成分UV曲线的峰或谷处，避开吸收值急剧变化波段，以保证测定方法具有较好的耐用性，并保持测定结果的恒定。
高效液相色谱（HPLC）使用中常见故障及解决方法（三）峰型异常问题
高效液相色谱（HPLC）使用中常见故障及解决方法（三）峰型异常问题峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。
1、色谱图中未出峰。
解决方法：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。
2、一个峰或几个峰是负峰。
解决方法：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。
3、所有峰均为负峰。
解决方法：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。
4、所有峰均为宽峰。
解决方法：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。
、5、所出峰比预想的小。
解决方法：样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确．定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。
6、出现双峰或肩峰。
解决方法：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7、前伸峰。
解决方法：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。
8、拖尾峰。
解决方法：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。
9、出现平头峰。
解决方法：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。
10、出现鬼峰。
解决方法：进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。
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HPLC
法校正因子
研究中的几
个问题
作者张哲峰
部门化药药学二部
正文内容HPLC法具有将不同物质分离后逐一定量的分离分析能力，在药品有关物质检测中发挥着越来越重要的作用，成为药品杂质控制中常用而有效的手段之一。
在杂质对照品法、加校正因子的主成分自身
对照法、不加校正因子的主成分自身对照法、峰面积归一化法等几种常用的杂质定量方式中，校正因子
的研究对于选择合适定量方式，准确定量杂质具有重要意义，因而成为杂质分析方法研究中的重要内容
之一。
但从目前注册申报资料实际情况来看，校正因子的研究和使用中尚存在一些需要进一步思考和关
注的问题。
1.校正因子的定义及特点
一般来讲，HPLC定量测定中，物质的检测量W与色谱响应值（峰面积等）A之间的比值称为绝对校正因子，即单位响应值（峰面积等）所对应的被测物质的量（浓度或质量）；而某物质i与所选定的参
照物质s的绝对校正因子之比，即为相对校正因子，即通常所讲的校正因子。
目前校正因子主要用于“加校正因子的主成分自身对照法”定量相关特定杂质，这种定量方式因考虑了杂质与主成分的绝对校正因子的不同所引起的测定误差，将标准物质的赋值信息转化为常数，固化在质
量标准中，且不需长期提供标准物质，因而成为现阶段杂质控制较为理想可行的手段。
但这种方法有时
会因不同仪器及色谱条件的波动，可产生一定范围的误差，需进行充分的方法耐用性验证，并结合色谱
峰定位控制等措施，将误差控制在一定范围内。
2.校正因子的测定
在校正因子的研究和使用中，标准物质、色谱条件、溶剂、检测波长等均是重要的影响因素，研究中需要予以关注。
2.1 校正因子的测定需要用到特定杂质及主成分的标准物质，这些标准物质应具备量值准确的特点，
符合标准物质（对照品）的相关要求；其次，确定校正因子的分析方法应与最终确定的质量标准方法一
致，色谱条件等需经筛选优化后确定，如有变更，需考虑对校正因子的影响，必要时重新确定；第三，要关注影响待测物UV吸收的各种因素，如溶液制备所用溶剂最好与最终确定的流动相相同，检测波长最好在特定杂质及主成分UV曲线的峰或谷处，避开吸收值急剧变化波段，以保证测定方法具有较好的耐用性，并保持测定结果的恒定。
2.2 一般情况下，校正因子可视具体情况通过如下几种方法确定：
（1）单浓度点测定：制备适当浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液，分别进样测定，照上式计算，得到校正因子。
（2）多浓度点测定：制备适当的高、中、低三水平浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液（涵盖定量限、标准限度），分别进样测定，照上式计算各校正因子，计算RSD，求平均值，得到校正因子。
（3）标准曲线法测定：精密称取杂质对照品和主成分对照品，分别制备系列溶液（涵盖定量限、标准限度），分别进样后，按最小二乘法以进样量对响应值（峰面积等）进行线性回归，求得两条标准曲线，两曲线斜率之比即为校正因子。
（4）吸收系数比值法：对于UV检测器来讲，两物质的相对校正因子实际上也是两物质以流动相为溶剂，在检测波长处的紫外吸收系数E1cm1%之比，故可按吸收系数法测定法的相关技术要求测定各自吸收系数，如对照品级别的标准物质、高中低三水平浓度测定、吸收度介于0.3～0.8之间、至少5台不同型号的UV分光光度计、2份供试液同时平行制备测定、同台仪器2份供试液的平行测定结果不超过±0.5%等。
测定两物质的吸收系数后，经统计分析确定两物质吸收系数，计算比值，求得校正因子。
上述各方法中，（1）和（2）法较为简捷，可以快捷地量化特定杂质与主成分紫外吸收特征的差异，多用于评估采用主成分自身对照法定量杂质时是否需要校正。
但如采用加校正因子的主成分自身对照法定量杂质，需将标准物质赋值信息转化为校正因子固化在质量标准中，那么校正因子的准确性非常关键，校正因子的准确计算应符合更为严格的要求，需要考虑并控制求算校正因子过程中的各种误差因素，以及仪器通用性和色谱系统的耐用性等因素，以便使求得的常数更为准确并具代表性，此时采用（3）、（4）法更为适宜，如能考虑到测定人员、不同试验室因素的影响，会更加符合常数求算的基本要求。
3.校正因子的应用
根据杂质研究相关技术指导原则，为确保杂质测定结果的准确可靠，一般情况下，校正因子在0.9～1.1时可不予校正，直接采用不加校正因子的自身对照法定量；超出该范围，如采用主成分自身对照法的定量方式，须用校正因子进行校正，，即“加校正因子的主成分自身对照法”以保证杂质定量的准确性；如
校正因子在0.2～5.0范围以外时，表明杂质与主成分的UV吸收相差过大，校正因子的作用会受到显著影响，此时应改变检测波长等检测条件，使校正因子位于上述范围内，或使用结构或UV吸收与该杂质接近的另一标准物质为参照物质（如对照品易于获得、标准已采用对照品外标法定量的另一特定杂质），重新确立校正因子；如校正因子仍无法调节至适当范围，需考虑采用杂质对照品外标法等适当的杂质方式定量。
校正因子的应用同吸收系数的使用类似，需要具备一定的前提条件，比如相同的检测波长、分析方法、色谱条件等。
需要注意的是，杂质的保留时间差别较大时，峰形及峰面积会有较大差别，对校正因子的校准作用也会产生明显影响，因此色谱峰的保留时间要相对恒定，质量标准需要对相关特定杂质的色谱峰规定相对保留时间的限定。
在目前的申报资料中，校正因子的研究和使用中存在一些需要关注的问题。
主要表现在如下几个方面：
（1）特定杂质直接采用主成分自身对照法定量，没有进行校正因子的研究以及测定结果校正前后的数据对比，无法判断定量方式的合理性和测定结果的准确性。
（2）测定的校正因子超过指导原则中不需校正的范围，仍直接采用不加校正因子的主成分自身对照法。
如某药物中杂质I、II、III校正因子分别为2.02、1.47、1.70，但质量标准仍采用不加校正因子的主成分自身对照法测定包括上述三个杂质的各种杂质。
（3）测得的校正因子不能有效校正测定结果，在没有充分的数据支持的情况下，仍采用加校正因子的主成分自身对照法。
如某青蒿素质量标准中去氢青蒿素的定量使用相对于主成分的校正因子为0.019，该数值校正能否准确定量杂质，没有相应研究工作的论证和对比检测数据的支持显然是不够的。
4.几点思考与建议
综上可见，对于特定杂质的控制，校正因子的研究和测定是非常必要的。
评估杂质定量是否需要采用校正因子校正，校正因子能否起到有效的校准作用，首先要测定出校正因子，按照相关技术指导原则的要求评估是否需要校正，并提供相应的对比研究资料。
这些研究数据应包括杂质对照品外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法对相同多批样品杂质定量测定结果的对比数据，作为是否需要校正或能否有效校正检测结果的支持与依据。
考虑到校正因子对杂质定量的长期影响，目前阶段校正因子测定的技术要求、标准物质要求、测定方法和数据处理的要求等尚未十分明确、尚不统一普及，如校正因子需要载入质量标准，由省所进行协作标定或进行针对性技术复核具有一定必要性。
以上所述仅为个人观点，不妥之处期望讨论交流。
参考文献
1、国家食品药品监督管理局化学药物杂质研究的技术指导原则。
2005
2、ICH Harmonized Tripartite Guideline：Impurities in New drug substances,Q3A (R).2002
3、BP2011：British Pharmacopoeia Volume V-Appendices-Appendix III Chromatographic Separation Techniques
4、ICH Harmonized Tripartite Guideline：Impurities in New drug substances,Q3B (R).2003
5、张哲峰我国药物研发中杂质研究面临的挑战与思考。
药品评价，2010，18（7）：12-19
6、张哲峰化学药品质量标准制定中若干问题探讨。
药品技术审评论坛-第二届药品技术审评研讨会论文集729
7、张哲峰浅谈“色谱方法验证原则”。
药品技术审评论坛-第二届药品技术审评研讨会论文集。