一个植物半胱氨酸蛋白酶多克隆抗体的制备及其应用

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棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(6): 958−964/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@基金项目: 国家自然科学基金项目(30471104); 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2002CB111303); 教育部新世纪优秀人才项目(NCET-04-0500); 教育部111引智计划(B08025)作者简介: 佘义斌(1981−), 男, 江苏人, 硕士, 从事作物遗传育种研究; 朱一超(1980−), 男, 江苏人, 在读博士, 从事棉花遗传学研究。

** 同等贡献。

*通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍。

E-mail: moelab@Received(收稿日期): 2007-08-15; Accepted(接受日期): 2008-01-15.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00958棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA 的克隆、表达及染色体定位佘义斌** 朱一超** 张天真郭旺珍*(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京210095)摘要: 腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。

通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA 文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA 序列。

该cDNA 序列长1 598 bp, 利用5′RACE 技术得到上游318 bp 的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp 的cDNA 序列, ORF 为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点p I ＝5.69, 分子量MW ＝53.2 kD 。

该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。

根据Southern 杂交结果推测GhSAHH 基因在陆地棉基因组中为单拷贝。

不同NDV株V蛋白多克隆抗体的制备和初步应用

不同NDV株V蛋白多克隆抗体的制备和初步应用傅强;仇旭升;陈素娟;谭磊;宋翠萍;于圣青;丁铲;彭大新【摘要】新城疫病毒(NDV)的V蛋白是一种干扰素拮抗蛋白,该蛋白表达量的差异对NDV细胞嗜性的影响是目前的热点问题.为制备NDV V蛋白多克隆抗体,本研究以Class Ⅰ NDV 9a5b株和Class Ⅱ NDV ZJl P基因为模板扩增V蛋白PNT结构域和V蛋白半胱氨酸富集区(CTD)结构域,分别克隆至pET-28a(+)载体和pCold TF载体中,获得表达V蛋白或其CTD结构域的重组表达质粒.将重组质粒转化大肠杆菌诱导表达;纯化重组蛋白,并分别免疫小鼠,制备针对Class Ⅰ和ClassⅡNDV V 蛋白的多克隆抗体.利用该多克隆抗体,western blot检测NDV 9a5b、La Sota、ZJ1、Herts/33株感染HeLa和DF1细胞后V蛋白的表达量变化.结果显示制备的多克隆抗体可以用于NDV V蛋白的检测,V蛋白在易感宿主禽源细胞中的表达量明显高于哺乳动物细胞.研究表明NDVV蛋白的表达水平与宿主细胞的种属差异相关.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2013(035)009【总页数】5页(P702-706)【关键词】新城疫病毒;V蛋白;蛋白表达;多克隆抗体;细胞嗜性【作者】傅强;仇旭升;陈素娟;谭磊;宋翠萍;于圣青;丁铲;彭大新【作者单位】扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;扬州大学兽医学院,江苏扬州225009【正文语种】中文【中图分类】S852.65新城疫(Newcastle disease，ND)是由 ND病毒(NDV)引起的一种高度接触性传染病，给养禽业造成了严重损失[1]。

单克隆及多克隆抗体制备

单克隆抗体制备
七、抗体纯化
• 硫酸铵沉淀法：简易价廉、浓度高，但纯度不高 • 辛酸沉淀法：纯化IgG类抗体，价廉，但纯度不高 • DEAE柱层析法：起始抗体PH只高于抗体等电点，抗体与 DEAE结合，用离子强度逐渐增强的缓冲液洗脱。 • 蛋白A、蛋白G柱纯化抗体免疫亲和层析：从多克隆血清中纯化特异性抗体方法
• 免疫亲和层析法：
（1）用抗原免疫亲和柱纯化：对多克隆血清，纯化特异性
抗体唯一方法（2）用抗Ig免疫亲和柱纯化抗体：分离大鼠单克隆抗体
八、抗体的保存
• 血清、组织或培养上清、腹水保存：0.02%NaN3;分装保存
• 纯化抗体保存：PH值调整，PBS或其他等渗溶液，浓度不宜过低，如果不用于标记可在低浓度抗体中加1%BSA 以提高蛋白浓度，加NaN3;分装冻存。
抗体制备
多克隆抗体制备一、免疫动物
• 动物选择：种类多。哺乳类或禽类。选择适龄、健壮的动
物
• 原则：需要血清量、抗原从何种种属动物分离获得，需要单抗时，有多少抗原可使用。 • 常用种类：兔、小鼠、大鼠、豚鼠、中国仓鼠 • 商品用动物：猪、马、牛、羊 • 多抗制备常用兔（得到500ml血清！）
动物选择
• 小鼠：首次50-100ug/次；大鼠：100ug-1mg/次，兔0.51mg/次 • 加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5 • 高度特异性抗血清：策略为低剂量抗原短程免疫法 • 高效价的抗血清：策略为大剂量抗原长程免疫法。
三、佐剂的应用
• 颗粒性抗原或全细胞抗原不需要佐剂 • 可溶性抗原须用佐剂，以增强抗原的免疫原性或改变免疫反应的类型，刺激机体产生较强的免疫应答 • 佐剂种类：弗氏（Freund’s）佐剂、脂质体佐剂、氢氧化铝佐剂，SAF-1和RAS • IFA：羊毛脂1份，石蜡油5份，每毫升IFA中加入1-20mg 卡介苗即为CFA。

抗体的制备与应用

体。
优点: 克服了HAMAR的问题分子量小、渗透性高，靶向性增加 ScFv可保留较高活性
类型
（1）二硫键稳定的单链抗体(dsFv）（2）由连接肽连接的单链抗体（ScFv）
1.dsFv（二硫键稳定的单链抗体）
利用基因突变技术在VH和VL上加入半胱氨酸，利用两者形成的二硫键将VH和VL连接在一起。
杂交瘤细胞（HGPRT+, TK+ , 能生长, 且能永生化）
4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化
筛选：免疫荧光 ELISA等
克隆化：有限稀释法单个细胞显微操作法软琼脂培养法
5.杂交瘤细胞的冻存与复苏
配制方案: 杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液 (30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液， 10%DMSO ) “慢冻”: 分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 “快融”: 取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏
• 激活补体 Immune complex（IC）激活补体经典途径
• 与细胞表面FcR结合 1）调理作用（opsonization)；
IgG 或IgM的Fc段与吞噬细胞表面FcR结合促吞噬；
2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)
3.杂交瘤细胞的筛选
采用筛选培养基: HAT培养基 H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶
只有融合成功的细胞（杂交瘤）才能在HAT培养基上长期生长，原因在于只有杂交瘤能成功合成DNA。
DNA合成途径
内源性途径（主要途径）利用谷氨酰胺（Gln）或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还
原酶的催化下合成DNA (氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 因此能有效阻

Caspase半胱氨酸蛋白酶家族蛋白介绍

◆Caspase-3广泛分布于各种不同类型的细胞，是Caspase家族中最主要的凋亡执行者之一，激活的Caspase-3能使许多与细胞周期及DNA修复等相关蛋白或激酶失活，从而使细胞凋亡。分子量为：32KDa.
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
Caspase-6(CT)半胱氨酸蛋白酶蛋白-6（C端）
◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600
◆Caspase-6（NT）与Caspase-3有38%的同源性，属胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族。在凋亡执行阶段起中心作用，可被Caspase-7、-8、-10剪贴。它是唯一一个可以剪贴核纤维层蛋白的Caspase.分子量为：34KDa。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
CD4（Mouse Anti-Human CD4 Monoclonal Antibody）
S-0551M
◆小鼠抗人CD4单克隆抗体
◆200ul/800.00 1ml/2200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体
◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600 ICM=ICM=1:100-200
◆小鼠抗人CD3单克隆抗体（Mouse Anti-Human CD3 Monoclonal Antibody）经亲和纯化，溶于PBS（pH7.4）中，含BSA等稳定剂，识别17-19KDε链，可与人CD3抗原的ε链和T细胞抗原受体(CD3/TCR)复合体反应。类别：IgG2a,κ。CD3抗原在60-80%正常人外周血淋巴细胞和60-70%的人胸腺细胞上表达。在T细胞发育的早期，CD3抗原主要在胞浆中表达，晚期出现在膜上。在抗原识别中，CD3抗原起着信号传递的重要作用。有报道，CD3抗原在NK细胞的胞浆中(非膜上)表达，为研究T细胞和NK细胞的发育关系和共同的前体细胞提供了一种手段。抗CD3抗体在微量时对T细胞有强的致分裂原效应(在可溶性或固相条件下)，大剂量时有免疫抑制作用。

西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1克隆及其生物信息学分析

西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1克隆及其生物信息学分析阳永学;程维舜;曾红霞;张娜;施先锋;孙玉宏【摘要】[目的]克隆西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1,并对其进行生物信息学分析.[方法]以西瓜花蕾cDNA为模板,借助西瓜全基因组数据库,采用RT-PCR方法对西瓜半胱氨酸蛋白酶基因进行克隆并进行生物信息学分析.[结果]克隆得到一个开放阅读框长度为960bp的序列,命名为ClCP1.该基因编码319个氨基酸.ClCP1基因的保守结构域分析结果表明,ClCP1属于木瓜蛋白酶家族基因,与已知其他植物半胱氨酸蛋白酶在氨基酸序列上有56％～ 85％的相似性.聚类分析结果显示,ClCP1与同为葫芦科的黄瓜CP基因亲缘关系较近.[结论] ClCP1属于西瓜木瓜蛋白酶家族新基因,为进一步研究西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1的表达和功能奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)028【总页数】4页(P11286-11288,11319)【关键词】西瓜;ClCP1;基因克隆;生物信息学【作者】阳永学;程维舜;曾红霞;张娜;施先锋;孙玉宏【作者单位】武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345;武汉市农业科学研究所,湖北武汉430345【正文语种】中文【中图分类】S651半胱氨酸蛋白酶(CPs)作为一类重要的蛋白酶家族，广泛参与植物的许多生理过程，如种子贮存蛋白的分解，对逆境的反应及参与植物细胞程序化死亡［1］。

近些年来，植物中发现的半胱氨酸蛋白酶主要有papain(木瓜蛋白酶)(C1)家族、天冬氨酸蛋白内切酶)(C13)家族、caspase(天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶)(C14)和calpain(钙依赖半胱氨酸蛋白酶)(C2)家族，其中papain家族(C1A)研究得最为详尽。

多克隆抗体的制备技术

多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。

具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。

抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。

2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。

这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。

3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。

一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。

4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。

5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。

接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。

6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。

7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。

通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。

一种Tulp2多克隆抗体及其制备方法和应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011279339.1(22)申请日 2020.11.16(71)申请人扬州大学地址 225000 江苏省扬州市大学南路88号(72)发明人郑英　徐文华　葛婷婷　(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204代理人王艳(51)Int.Cl.C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C07K 14/47(2006.01)C07K 16/18(2006.01)C07K 16/06(2006.01)G01N 33/68(2006.01)A61K 39/395(2006.01)A61P 15/08(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称一种Tulp2多克隆抗体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种重组表达载体、重组菌、Tulp2原核蛋白及其制备方法，本发明还公开了一种Tulp2多克隆抗体及其制备方法和应用。

本发明还公开了Tulp2原核蛋白、Tulp2蛋白多克隆抗体在制备诊断或治疗男性不育症试剂或药物中的应用。

该Tulp2多克隆抗体能特异性识别小鼠及人组织中的Tulp2蛋白，可应用于小鼠及人多种组织ELISA、Western Blot、组织免疫荧光等技术分析，具有特异性高，适用广泛等特点。

权利要求书1页说明书7页序列表4页附图6页CN 112553233 A 2021.03.26C N 112553233A1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达质粒是将Tulp2基因插入到原核表达载体中得到重组表达载体。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述原核表达载体为大肠杆菌表达载体。

3.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求1或2所述的重组表达载体导入宿主菌中，筛选得到重组菌。

免疫组化医学知识专题讲座

既可定性、定位，又可定
形态、功能和代谢三结合
缺陷：干扰多，易出现假阳性
四、免疫组织化学染色操作环节
（一）组织处理与切片选择（二）免疫染色旳前处理
试剂准备（示踪，放大，标识）消化阻断 *（三）免疫组化染色原理、优缺陷、流程（四）免疫染色旳后处理增强、衬染、封固
*（五）成果判断与对照设置措施众多敏感不同程序雷同按需选用
关键环节：特异抗体-----桥联抗体----标识抗体种系必需匹配
（第一抗体）（第二抗体）（第三抗体）
第一节抗原和抗体
一、抗原：
凡能刺激机体产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应免疫应答物（抗
体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特
免疫试剂，自 1975 年 Kohler 和
Milstein发明了单克隆抗体制备旳杂交瘤技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供给旳特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体。
三、技术特点（优点）
1.特异性强 2.敏感性高 3.定位精确量
4.三位一体
远离半抗原旳抗原决定簇；高结合率（结合半抗原数目至少20个以上）
抗原决定簇(表位)：抗原分子中决
定抗原特异性旳活性化学基团，其性
质、数量、空间构型决定抗原旳特异性。
---免疫组化旳精确性、特异性
交叉反应：抗原（或抗体）除与其
相应抗体（或抗原）特异结合外，有时可与其他抗体（或抗原）发生反应。
免疫组化医学知识专题讲座
学习本章节旳总体要求
*1. 熟悉免疫组织化学技术特点及其原理 *2.掌握免疫组织化学染色旳操作流程 *3.熟悉免疫化学反应有关术语及其所用免疫试剂旳起源和质量控制 4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求 5.了解单克隆抗体制备原理和环节

植物半胱氨酸氧化酶和硫化氢在拟南芥低氧胁迫应答反应中的功能及其机制研究

植物半胱氨酸氧化酶和硫化氢在拟南芥低氧胁迫应答反应中的功能及其机制研究植物半胱氨酸氧化酶和硫化氢在拟南芥低氧胁迫应答反应中的功能及其机制研究低氧胁迫是植物生长和发育中常见的环境压力之一。

对于水生植物以及生长在淹水环境中的陆生植物来说，低氧胁迫特别常见。

因此，植物需要一种有效的机制来应对这种压力。

近年来的研究表明，植物半胱氨酸氧化酶和硫化氢在植物低氧胁迫应答中发挥了关键的功能。

植物半胱氨酸氧化酶（cysteine oxidase，CDO）是一种含有半胱氨酸残基的酶，在植物细胞中起到氧化半胱氨酸生成巯基的作用。

硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是一种具有活性的小分子气体，在植物细胞中参与多种生理过程的调控。

研究发现，低氧胁迫会导致拟南芥的内源H2S水平升高，并且半胱氨酸氧化酶的活性也显著增加。

这表明，CDO和H2S可能在拟南芥低氧胁迫应答中起到重要的作用。

在拟南芥中，低氧胁迫会导致多种基因的表达发生变化，例如氧气亏缺响应基因（oxygen deprivation responsive，ODR）和低氧胁迫相关基因（low oxygen stress related，LOS）。

研究发现，CDO基因的表达在低氧胁迫条件下显著上调，并且过表达CDO基因能够增加拟南芥对低氧胁迫的耐受性。

此外，H2S也能够诱导ODR和LOS基因的表达，进一步增强拟南芥对低氧胁迫的适应能力。

进一步的研究发现，CDO和H2S在拟南芥低氧胁迫应答中的机制可能涉及到多种信号通路。

一方面，H2S可能通过调控活性氧物种（reactive oxygen species，ROS）的产生和清除来影响植物对低氧胁迫的应答。

研究表明，H2S能够抑制超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）的活性，减少ROS的水平，从而减轻低氧胁迫对植物的损害。

另一方面，CDO可能通过调控转录因子的活性来调节拟南芥低氧胁迫应答。

一个植物半胱氨酸蛋白酶多克隆抗体的制备及其应用

一个植物半胱氨酸蛋白酶多克隆抗体的制备及其应用彭琪琪;羊健;廖乾生;张恒木【摘要】半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase,CysP)是一类重要的蛋白酶家族,广泛参与植物多种生理过程.为了分析植物CysP的特性,本实验首先通过RT-PCR技术从本氏烟中扩增获得了一个编码CysP的基因(Nb-CysP)序列并连接至pEASYTM-T5 Zero载体,测序验证后亚克隆至原核表达载体pGEX-6P1,命名为pGEX-NbCysP;将其导入大肠埃希菌BL21plysS中诱导表达;重组表达的NbCysP 融合蛋白经过亲和层析纯化,免疫兔子制备多克隆抗体,Western印迹分析显示,该抗体能和重组NbCysP蛋白发生强烈的免疫学反应且条带单一,表明所获得的CysP 抗体具有良好的特异性.上述结果为进一步鉴定植物CysP的功能特性奠定了基础.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2018(030)006【总页数】5页(P881-885)【关键词】半胱氨酸蛋白酶;原核表达;多克隆抗体【作者】彭琪琪;羊健;廖乾生;张恒木【作者单位】浙江理工大学生命科学学院,浙江杭州310018;浙江省农业科学院病毒与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江理工大学生命科学学院,浙江杭州310018;浙江省农业科学院病毒与生物技术研究所,浙江杭州310021【正文语种】中文【中图分类】Q78半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase，CysP) 是一类维持生物体内蛋白代谢平衡的重要蛋白酶家族，广泛参与生物体的多种生理过程。

近年来，研究人员相继从拟南芥[1]、烟草[2]、番茄[3]、水稻[4]、月季[5]和油菜[5]等植物中克隆到多种半胱氨酸蛋白酶基因。

这些半胱氨酸蛋白酶大多属于papain(木瓜蛋白酶)，其催化三联体主要由半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、天冬氨酸或天冬酰胺(Asp/Asn)组成，它们在肽链中的排列顺序依次为Cys-His-Asn/Asp[6]。

植物抗体制备

植物抗体制备
植物抗体制备是一种生物技术方法，用于从植物中收集和纯化特定目标蛋白的抗体。

下面是一种常见的植物抗体制备方法：
1. 选择表达载体：选择适合在植物中表达目标蛋白的表达载体，并将目标蛋白的编码序列插入该载体中。

2. 转化植物细胞：将表达载体导入植物细胞中，可以通过基因枪法、农杆菌介导法等方法进行。

3. 筛选转化植株：通过对转化植株进行筛选，例如利用抗生素选择性培养基，筛选出携带目标蛋白表达载体的转化植株。

4. 扩大培养：将筛选得到的转化植株进行扩大培养，使其生长成成熟植株。

5. 收获植物材料：收获植物材料，包括根、茎、叶等组织，用于提取目标蛋白。

6. 蛋白提取：利用蛋白提取缓冲液等方法，将目标蛋白从植物材料中提取出来。

7. 抗体纯化：利用亲和层析、凝胶过滤、电泳等方法，对提取的目标蛋白进行纯化，得到纯化的目标蛋白。

8. 免疫原制备：将纯化的目标蛋白用于免疫动物（如小鼠）以制备抗体。

9. 抗体收集：从免疫动物中收集得到的抗体，可以通过抗体纯化和浓缩等步骤进行进一步纯化和处理。

10. 抗体检测：利用收集到的抗体，可以进行免疫组化、免疫印迹、ELISA等方法对目标蛋白进行定量和定位分析。