变性梯度凝胶电泳在堆肥微生物研究中的应用
变性梯度凝胶电泳(DGGE)的研究进展
变性梯度凝胶电泳（DGGE）的研究进展【摘要】DGGE 技术是由Fischer等于1979年提出的一种用于检测DNA 突变的电泳技术[1]，之后Myers等首次在DGGE的引物中使用“GC夹子”，使得突变检出率大大提高，从而进一步完善了该技术。
1993年，Muyzer等将DGGE 技术应用于微生物的生态学研究，并且证实了该技术在研究自然界微生物群落的种群差异性和遗传多样性方面具有突出的优越性[2]。
与传统的菌种分离培养技术及生理生化指标检测相比，DGGE技术通过对微生物群落的核酸信息进行分析，能更准确、更快速的对菌群进行鉴定，同时可鉴定出自然状态下不可培养的菌株。
由于DGGE技术具有重现性高、可靠性强和高效快捷等优点[3]，现以用于微生物群落的复杂性分析、检测微生物种群动态变化、对比细菌的富集培养及分离培养、单基因组中rRNA的多样性分析、DNA提取方法比较等方面，在废水、海洋、森林、土壤等环境样品研究以及发酵工艺、植物内生真菌研究、种群演替规律研究等领域广泛应用。
【关键词】DGGE；微生态；纯培养1.DGGE技术的原理变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据小片段DNA分子（1kb以下）的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA 分子。
DNA片段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢[4]。
当DNA片段处在变性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分融化，达到一定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳图谱中成楼梯式排列。
通过对比熔解状态下DNA片段的多态性，就可以推测有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。
为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区—GC夹（GC clamp）；GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的连续GC碱基，这样在PCR 产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%[4]。
DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用
・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第12期DGGE 技术在环境微生物多样性研究中的应用张珍妮1,2 吴晓芙1 陈永华1,2 石卉1(1中南林业科技大学环境科学与工程研究所,长沙410004;2中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙410004) 摘 要: 微生物是污水净化的主要作用者之一。
采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electr ophresis,DGGE )方法培育和鉴定土壤微生物具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于环境科学和污染防治研究领域。
综述了基于PCR 2DGGE 技术的基本原理、关键环节及其在微生物多样性研究中的应用,同时就其自身存在的不足进行了评价并提出了解决方案。
关键词: PCR 2DGGE 微生物 多样性Appli cati on i n Research on M i crobi a l D i versityof Envi ronment by DGGE Techn i queZhang Zhenni 1,2 W u Xiaofu 1 Chen Yonghua 1,2 Shi Hui1(1Institute of Environm ent Science and Engineering,Central South U niversity of Forestry and Technology,Changsha 410004;2Institute ofB iology Environm ent Science and Technology,Central South U niversity of Forestry and Technology,Changsha 410004) Abs trac t: M icr oorganis m p lays an i m portant r ole in waste water treat m ent 1Accounted f or by its high levels of reliability and rep r o 2ducibility as well as its convenience in operati on,the denaturing gradient gel electr ophoresis (DGGE )has been widely used f or cultiva 2ti on and identificati on of m icr obial communities in the fields of envir on mental sciences with focus on polluti on contr ol 1The p rinci p le of the DGGE technique and the concerned key fact ors in its app licati on f or analysis of m icr obial communities were described in this pa 2per 1I n comparis on,the potential app licati on areas of the DGGE technique and its li m itati ons were als o discussed 1Key wo rd s: PCR 2DGGE M icr oorganis m D iversity收稿日期:2009207220基金项目:国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX072122001),国家科技部国际合作项目(20072DF A91420),湖南省博士后基金(2008RS4027),中南林业科技大学校青年基金重点项目(2008001A ),中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所开放基金,湖南省环境科学学科建设项目(2006180)作者简介:张珍妮(19852),女,在读硕士,研究方向:环境生物学;E 2mail:zhangzhenni_2003@1631com 通讯作者:吴晓芙(19532),男,教授,研究方向:水土污染控制;E 2mail:wuxiaofu530911@vi p 11631com环境中微生物的种类和数量是及其丰富的,微生物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量,它们在污染物的吸附和降解起着核心作用[1,2]。
DGGE_TGGE技术及其在微生物分子生态学中的应用
44卷 6期2004年12月微生物学报Acta Microbio logica Sinica Vol.44DecemberNo.62004基金项目:国家 973项目 (G2000026402);国家 863计划 (2003AA515030);黑龙江省自然科学基金攻关项目(GZ03C314)*通讯作者。
Tel Fax:86 451 86282008;E mail:jidx3@作者简介:宫曼丽(1979-),女,黑龙江人,博士研究生,主要从事环境微生物学、生物制氢工程技术研究。
E mail:locg66@ 收稿日期:2004 03 04,修回日期:2004 04 15DGGE TGGE 技术及其在微生物分子生态学中的应用宫曼丽 任南琪*邢德峰(哈尔滨工业大学市政环境工程学院 哈尔滨 150090)摘 要:变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是近些年微生物分子生态学研究中的热点技术之一。
由于DGGE TGGE 技术具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点,被广泛地应用于微生物群落多样性和动态性分析。
文章对DGGE TGGE 技术原理与关键环节、局限性和应用前景进行了综述。
关键词:变性梯度凝胶电泳,温度梯度凝胶电泳,微生物多样性,微生物分子生态学中图分类号:Q939 9 文献标识码:A 文章编号:0001 6209(2004)06 0845 04 在环境监测和废弃物综合治理过程中需要探明有关微生物学信息,因此揭示特定生境下的微生物群落的遗传多样性和动态性是研究的重要内容。
目前自然界中只有极少部分微生物能够被分离和纯化,若以这极少部分的微生物来代表环境和处理系统中复杂的微生物群体将导致极大的误差[1,2]。
因此,用传统的微生物培养和鉴定方法不足以代表微环境中的真实情况。
基于DNA 指纹技术的分子生物学研究手段,例如限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymor phism,RFLP)[3]、末端限制性片段长度多态性分析(T erminalRes triction Fragment Length Polymorphism,T RFLP)[3]、单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphis m,SSCP)[4]等逐步被引入到环境微生物学研究中,已经将环境微生物领域研究带入一个革命性的新时代。
变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用
物多样性的Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 检测结果的重要 因素 ， 学生通过 比较不 同提取 方 法对 Ｄ Ｎ Ａ 产量 和纯 度 的影 响 ，确 定 了针 对不 同的 实验样品（ 土壤或污泥 ） 的最佳提取方法 ， 在这一过程中加 深 了对Ｄ Ｎ Ａ 提取原理和方法的认识 。通过Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 图谱的分 析 ，学 生可 以直 观地 了解 到 污染胁 迫 等环 境 条件 下微 生物 群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程 ，更加深刻地 理 解 富集 培养技 术 在分 离特 定功 能微 生物 上 的应 用 。学生 通 过后 续 的序列 比对分 析 ，可 以学 习到相 关环 境 中常 见 的 微 生物 优势 菌 属 ，特 别 是一 些非 培养微 生 物序 列 的 出现 丰 富 了学 生对 微 生物 多样 性 的认 识 。通 常 面 向本 科 生开 设 的
、
生物 以未可培养的形式存在。Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 是一种不依赖微生物 培养 技术 的研 究方 法 ，能快 速 、准确 鉴定 环 境 中微 生物 种 群 ，在揭 示复 杂微 生物 群落 演替 规律 和 功能 基 因多 样性 方 面具 有独 特 的优越 性 ，已被 广泛 应用 于微 生 物分 子 生态 学 研 究 各领 域闭 。Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 技 术的基 本 原理 是在 聚丙 烯酰 胺凝 胶
力、 动 手能 力有 着积 极 的作用 ＿ ｌ ＿ １ 】 。 本校 非 常重 视实 验教学 改 革工 作 ，鼓励 学 生在 掌握 基 本实验技能后 ， 积极参加设计性 、 研究性实验 ， 包括院校两 级 的大学 生科 研 立项 或教 师 的研究 课题 ，并 给 予相 应 的创 新学分。 通过 该项 措施 进 一步激 发 了学 生 的学 习兴趣 ， 并 有 效提 高 了学 生 的实 验技 能 及分 析 问 题 和解 决 问题 的能 力 。 目前 微 生 物 实验 教 学 主要 包括 传 统 的微 生 物 实验 技 术 ， 随 着分 子生 物技 术 的发 展 ， 微 生 物研究 技 术 突破 了 以往 主要
DGGE_TGGE技术在微生物生态学中的应用
D GGE TGGE技术在微生物生态学中的应用陈静,马松成,毛华明(云南农业大学动物营养与饲料科学重点实验室,昆明 650201)摘要:变性梯度凝胶电泳(deaturing gradient gel electropho resis,D GGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electropho resis,T GGE)可以直接分离PCR扩增片段,作为一种分子指纹技术而逐渐被人们应用于微生态研究中。
通过D GGE T GGE对微生物组成的遗传特性进行表征,不但省去了菌种分离耗时耗力的工作量,更可鉴定出根据传统方法无法分离出来的菌种。
作者重点描述了D GGE T GGE的基本原理以及在胃肠道微生态研究中的应用。
关键词:变性梯度凝胶电泳;温度梯度凝胶电泳;胃肠道微生态;多样性中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:167127236(2006)1120047203 在分子生物学技术出现之前,人们对微生物的认识大多数是靠纯培养,或靠直接形态观察来获得部分信息。
动物胃肠道是一个复杂的生态环境,特别是反刍动物的瘤胃需要严格的厌氧环境,过去对瘤胃微生物的研究主要是一些经典的方法如亨氏滚管法(H ungate,1969)和最大可能计数法(D eho rity 等,1989)。
因为微生物形态简单,缺乏明显的外部特征,所以胃肠道中的大多数微生物由于难于模拟其生长繁殖的真实条件而不能获得纯培养。
能培养的微生物只是天然微生物中的一小部分,因此胃肠道中微生物的多样性被严重低估。
为了更好的了解胃肠道微生物多样性及其在调控发酵中的作用,需要其他的补充技术,应用分子生物技术为研究肠道微生态提供了简便而快捷的方法。
1 D GGE TGGE的基本原理变性梯度凝胶电泳(deatu ring gradien t gel electrop ho resis,D GGE)技术是由F ischer和L er m an 于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。
变性梯度凝胶电泳在微生物多样性分析中的应用及其技术发展
变性 梯 度 凝 胶 电泳 在 微 生 物 多样 性 分析 中 的应 用及 其 技 术 发 展
徐玲玲 ， 刘亚洁 ， 李 江 ， 徐蔚云
（ 华 理 工 大学 ， 两 抚 州 东 汀 ３４０ ） ４ ０ ０
摘
要： 变性 梯 度 凝 胶 电泳技 术是 目前研 究微 生物 群 落遗 传 多样 性 及 种 群 动 态 性 有 效 手段 已被 广 泛 应 用 于 土 壤 、 性 污 活
薛凯在pcrdgge研究土壤微生物多样性中应用gc发卡结构的效应期刊论文生态学报200310利用时间进程法优化活性污泥dgdgge图谱期刊论文生物技术200602红树林土壤细菌群落16srdnav3片段pcr产物的dgge分析期刊论文微生物学报200502dgdgge分析产氢发酵系统微生物群落动态及种群多样性期刊论文生态学报200507采用fishdgge和cloning对短程脱氮系统中硝化菌群的比较分析期刊论文环境科学学报2006059burrdenaturinggradientgelelectrophoresiscanrapidlydisplaybacterialdiversitycontained16srdnaclonelibraries外文期刊20060410cocolinl
泥 、 物 膜 、 物 肠 道 、 泉 、 泊 等环 境 微 生物 生 态 学研 究 。 阐述 了 变性 梯 度 凝 胶 电 泳 的 原 理 ， 析 其 在 微 生 物 多样 性 分 生 动 热 湖 分
析 方 面 的优 越 性 及 局 限 性 ； 着 重介 绍 了 Ｐ Ｒ Ｄ Ｇ 应 用 过程 中的技 术发 展 ， 并 Ｃ —Ｇ Ｅ 包括 Ｃｏｉｇ Ｄ Ｇ Ｇ — Ｇ Ｅ， ｅｔｄＰ Ｒ ｌｎｎ／ Ｇ Ｅ， Ｃ Ｄ Ｇ Ｎ ｓ Ｃ — ｅ
变性梯度凝胶电泳在瘤胃微生物多态性研究中的应用
的急剧下降， 从而使不同碱基序列的 Ｄ Ａ片段滞留在凝 Ｎ
胶 的不 同位 置。
２ ＤＧＧＥ技 术 的优缺 点
ＤＧ Ｇ Ｅ技术作为一种新的核酸分离 电泳技术 ， 对研 究瘤 胃微生物多态性有以下优势 ： 第一 ， 无需进行体外培 养， 直接利 用微生 物 样 品 中 的 Ｄ Ａ 或 Ｒ Ａ对 微 生 物群 Ｎ Ｎ 体加以区别， 这样不但避免了传统上耗时的厌氧分离 ， 更 可鉴定出传统方式难以培养的微生物种类 ； 第二 ， 检出率 很高 ， 即使微生物样品量极少 ， 经过 Ｐ Ｒ扩增后 ， Ｃ 也可以
的瓶颈 。随着 分子生 物 学技 术 突 飞猛进 的发 展 ， 多 国 很 内外 的研 究人员 在瘤 胃微生 态系统研 究方 面提 出了新 的 思 路和 方法 。 变性梯 度凝胶 电泳 （ ｅａ ｒ ｇＧａｉ ｔ ｅ Ｅｅｔ － Ｄ ｎｔ ｉ ｒ ｅ ｌ ｌ ｒ ｕｎ ｄ ｎ Ｇ ｃｏ ｐｏｅ ｓＤ Ｇ ） ｈｒ ｉ， Ｇ Ｅ 技术是 一种用 于检测 核酸 变异 的 电泳技 ｓ
（ 广西大学 动物科学技术学院， 广西 南宁 ５００ ） ３０ ４
摘
要 ： 绍了变性梯度凝胶电泳 （ Ｇ Ｅ 技 术的基本原理及优缺点， 介 ＤＧ ） 并综述 了国内外利用 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术在反 刍动物 瘤 胃
微 生物 群 落 多态性 和 动 态性 分析 方 面应 用及 其发 展 前 景 。 关键 词 ： 变性 梯 度凝 胶 电泳 ； 胃微 生 物 ； 瘤 多态性 中 图分 类 号 ：９ ８ 文 献 标识 码 ： 文章 编 号 ： ０ ８８ （０ ８ ０ — １８— ２ Ｑ３ Ａ １ １— ５ １２０ ） １ ００ ０ ０
其解链的速度和程度由其碱基序列解链温度较低的碱基
决定 ， 由于 Ｇ Ｃ碱基对比 Ａ Ｔ碱基对结合得牢 固， 因此 Ｇ Ｃ
变性梯度凝胶电泳在环境微生物生态学中的应用
变性梯度凝胶电泳在环境微生物生态学中的应用3单国彬1,2 金文标3 林佶侃1,4 邢新会233(1东莞宝丽美化工有限公司,东莞523581;2清华大学化学工程系生物化工研究所,北京100084;3哈尔滨工业大学深圳研究生院城市与土木工程学院,深圳518055;4金迪生物科技集团,东莞523581)摘 要 PCR 2变性梯度凝胶电泳(PCR 2D GGE )具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于环境生态学中微生物群落多样性、动态性分析和功能细菌的跟踪。
本文综述了PCR 2D GGE 技术的基本原理,不同DNA 提取方法的比较,不同PCR 方式的比较及其在环境生态学中研究微生物群落多样性、环境中微生物群落变化的动态监测、硝化菌2反硝化菌和硫酸还原菌(SRB )的动态分析和监测等领域中的应用,并对该技术自身存在的局限性和应用前景进行了评价。
关键词 PCR 2变性梯度凝胶电泳(PCR 2D GGE ),废水生物处理,微生物群落,活性污泥,生物膜,硝化菌2反硝化菌,硫酸还原菌中图分类号 Q938 文献标识码 A 文章编号 1000-4890(2006)10-1257-08Application of PCR 2denaturing gradient gel electrophoresis (PCR 2DGGE)in environmental microbial ecolo 2gy.SHAN Guobin 1,2,J IN Wenbiao 3,L IN Jikan 1,4,XIN G Xinhui 2(1B aolimei Chemical Engineering Com 2pany L imited ,Dongguan 523581,China ;2Institute of Biochemical Engineering ,Depart ment of Chemical Engineering ,Tsinghua U niversity ,Beijing 100084,China ;3College of U rban and Civil Engineering ,S henz hen Graduate School of Harbin Institute of Technology ,S henz hen 518055,China ;4Bio 2T reat Tech 2nology Com pany L imited ,Dongguan 523581,China ).Chinese Journal of Ecology ,2006,25(10):1257～1264.PCR 2denaturing gradient gel electrophoresis (PCR 2D GGE )has the advantages of high reliability ,good repeti 2tion and easy operation ,and been widely used in environmental ecology to analyze the diversity and dynamics of microbial communities ,and to monitor functional bacteria.Thispaper introduced the principles and meth 2ods of PCR 2D GGE ,reviewed its application in environmental ecological study ,and analyzed its potential ap 2plication prospects and limitations.K ey w ords PCR 2D GGE ,wastewater bio 2treatment ,microbial community ,activated sludge ,biofilm ,nitri 2fying 2denitrifying bacteria ,sulfate 2reducing bacteria.3国家自然科学基金重点资助项目(20336010)。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)
做DGGE注意事项 注意事项
1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的 各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污 染。 2、制胶是实验的关键，用连有聚乙烯管标有‘高浓 度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶 操作同上，在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮， 将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 3、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统 的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同 Y 形管相连。
一段富含 GC 的 DNA 片段（GC 夹子，一般 30-50 个碱基对） 可以解决双链DNA完全解链的问题,经验表明任何随机的GC序列 DNA , GC 都能达实验目的 含有GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段 序列处，它的解链温度很高，可以防止 DNA 片段在DGGE胶中 完全解链。当加了 GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处 的序列差异都能被区分开。
2）能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比 分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一 个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。 3）它可以跟踪监测细菌的富集和分离，从而评价不同培 养基及培养条件对分离菌种的影响 4）检测单个纯菌 rRNA 基因的微异质性；比较不同的 DNA 提取方法；另外，它还可以辅佐筛选克隆以 及检测 PCR 和克隆过程中的偏差
变性梯度凝胶电泳（ 变性梯度凝胶电泳（DGGE） ）
hnxide
一、原理及定义
变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是 Lerman 等 人于20 世纪 80 年代初期发明的，起初主要用 来检测 DNA 片段中的点突变，DGGE 是最灵 敏的突变检测方法，其效率可达99% （Grompe 1993）。Muyzer 等人在 1993 年 首次将其应用于微生物群落结构研究，现在该 技术已经发展成为研究微生物群落结构的主要 分子生物学方法之一
变性梯度凝胶电泳 DGGE
变性梯度凝胶电泳Denaturing Gradient Gel Electrophoresis变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)的方法应用于探究微生物的多样性，使得DGGE技术迅速成为了一项简单、可行的微生物多样性检测手段。
DGGE技术是根据长度相同但序列不同的DNA片段特点，在含有变性剂梯度的凝胶上，因其解链的变性浓度的不同而导致迁移率不同的原理而将DNA片段分离开的一种方法。
理论上DGGE能将仅存在一个碱基差异的DNA片段分开，而实际上，其分辩率较低且操作重复性差使得该方法仍然存在一些问题。
更重要的是，随着科技的突飞猛进，DGGE技术已逐渐被高通量测序所取代。
一、试剂与仪器1. 材料1.1 实验试剂表1.1 实验试剂一览表Table 1.1 The list of reagents试剂来源或生产公司EDTA Genebase®，Genebase Gene-Tech公司去离子甲酰胺分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司十二烷基磺酸钠Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Tris碱Genebase®，Genebase Gene-Tech公司APS Genebase®，Genebase Gene-Tech公司TEMED Genebase®，Genebase Gene-Tech公司N，N’甲叉双丙烯酰胺Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Gel-red染色液Biouim，美国氯化钠，二氯甲烷，甲醇等江苏永华精细化学品有限公司1.2 主要仪器设备表3.2 实验仪器一览表Table 3.2 The list of instruments and equipments仪器名称来源或出厂公司DGGE电泳仪Bio-Rad公司，美国EL 104电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司pH计梅特勒-托利多仪器有限公司-20℃低温冰箱海尔公司Milli-Q纯水系统Millipore公司，美国G-560E型旋涡混合器Eppendorf公司，德国5810D型低温冷冻离心机Eppendorf公司，德国全套微量移液器Eppendorf公司，德国1.3 相关溶剂及试剂配制(1) EDTA溶液(0.5 M，pH 8.0)：取1000 mL的烧杯加约800 mL超纯水，称取186.1 g EDTA逐量加入并用磁力搅拌器搅拌加速其溶解，随后用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后用1000 mL的容量瓶定容至1000 mL。
变性梯度凝胶电泳在微生物多样性分析中的应用及其技术发展
变性梯度凝胶电泳在微生物多样性分析中的应用及其技术发展徐玲玲;刘亚洁;李江;徐蔚云
【期刊名称】《东华理工大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2007(030)003
【摘要】变性梯度凝胶电泳技术是目前研究微生物群落遗传多样性及种群动态性有效手段,已被广泛应用于土壤、活性污泥、生物膜、动物肠道、热泉、湖泊等环境微生物生态学研究.阐述了变性梯度凝胶电泳的原理,分析其在微生物多样性分析方面的优越性及局限性;并着重介绍了PCR-DGGE应用过程中的技术发展,包括Cloning/DGGE,GC-DGGE,Nested PCR-DGGE和DG-DGGE.
【总页数】4页(P279-282)
【作者】徐玲玲;刘亚洁;李江;徐蔚云
【作者单位】东华理工大学,江西,抚州,344000;东华理工大学,江西,抚州,344000;东华理工大学,江西,抚州,344000;东华理工大学,江西,抚州,344000
【正文语种】中文
【中图分类】Q938
【相关文献】
1.变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用 [J], 卢磊;汪春蕾;刘长莉;张杰;杨洪一;赵敏
2.变性梯度凝胶电泳技术在微生物多样性研究中的应用 [J], 刘鹏飞;赵丹;宋刚;葛菁萍
3.变性梯度凝胶电泳技术在马属动物肠道微生物多样性研究中的应用 [J], 刘骁蒨;
尤凡;尹航;马智超
4.变性梯度凝胶电泳技术在马属动物肠道微生物多样性研究中的应用 [J], 刘骁蒨;尤凡;尹航;马智超
5.聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳在环境微生物中的应用 [J], 许伟;戴明忠;杨凯;陈勇;杨勇
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DGGE和T—RFLP在堆肥微生物群落结构研究中的应用
２ １ １ 原 理 方 法 ．．
ｔｏｕ Ａ． ｔｉ， １ ｆｒｄ ｓ Ｃ ． ｌ ｅｔ ｕ 和 ． ｉ ｒｍ， ｏ ｔ Ｃ ．ｅ ｉ ， １ｆ ｉ ｎ ｓｍ ｖ ｉｓ ｖｕ ｉｍ ｏ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ＤＧ （ Ｇ Ｅ 变性梯度凝胶电泳法）是在普通凝胶 电 ， 泳基 础上发 展起 来 的 Ｄ Ａ分离技 术 ：Ｎ Ｎ Ｄ Ａ分子在 解 链温度下发生变性 ， 双螺旋结构部分融解 ， 双链变 为单链 ， 碱 基 暴 露 出来 ， 们 与 变 性 剂 （ 素 ） ４种 它 尿 产 生不 同 的相互 作 用 。凝胶 中变 性剂 呈 梯度 分 布 ， 则变性 Ｄ Ａ分子在凝胶 中由于变性剂的存在 ， Ｎ 移 动 速度 发生 变化 ，最 终停 止 在 特 定 的位 置 ， 成分 形
ｏ ｉｒ ｂ ｎ ｃ ｍ ｐ ｓｉｇ ｐ ｏ ｅ ｓ ｆｍ ｃ ｏ ｅ ｉ ｏ ｏ ｔ ｒ ｃ ｓ ｎ
于改善 环境 、 效 利用 生 物 资 源具 有 重要 意 义 。堆 有
１１ 细 菌 ．
在好 氧堆 肥过程 中 ， 细菌凭 借强 大 的 比
肥就是利用 自 然界中广泛存在的微生物 ， 在人工控 制 的条件下 ，将可生 物 降解 的有 机 物转化 为肥料 的
＊通讯作者 ： 王立群（９６一）男 ， １５ ， 教授， 主要研究方向 ： 应用微生物学 ， Ｅ—ｍ ｉ ｗ ｎｌｕｄ＠１３ ｃｉ。 ａ ： ａｇｉ ｒ ６ ．ｏ ｌ ｑ ｎ
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３ ２
生 物 信 息 学
第５ 卷
２ 堆肥微生物群落结构分析
收稿 日 ： ０ —１ — ３ 修 回 日 ： ０ — ６ ２ 期 ２ ５ ２ ２； ０ 期 ２ ６ ０—４ ０
变性梯度凝胶电泳技术在发酵微生物多样性研究中应用
变性梯度凝胶电泳技术在发酵微生物多样性研究中应用摘要：研究发酵过程中微生物多样性情况对于了解微生物群落结构以及优势功能菌群的动态变化具有十分重要的意义。
文章综述了变性梯度凝胶电泳技术的基本原理、研究方法及其在发酵微生物多样性研究中的应用，为该技术能够在发酵微生物分子生态学研究中得到更广泛的应用起到推动作用。
关键词：变性梯度凝胶电泳技术；发酵；微生物中图分类号：ts201.3 文献标识码：a 文章编号：1674-0432（2012）-11-0049-2微生物发酵是利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。
微生物发酵生产水平主要取决于微生物种类、菌种本身的遗传特性和培养条件。
因此，微生物在发酵工程中起着核心作用。
在发酵的各个阶段，不同的微生物发挥着不同的作用，研究发酵过程中微生物多样性情况对于了解微生物群落结构以及优势功能菌群的动态变化具有十分重要的意义。
随着分子生物学的快速发展，环境微生物多样性免培养研究近年来逐步开展起来，该方法克服了经典培养方法的不足以及引起种群丢失等的缺陷，利用分子生物学技术准确高效地获得环境样品中各种微生物的菌落指纹和特征性核苷酸序列，确定微生物的多样性及其分类地位，揭示和丰富了生态环境的微生物资源，突破了环境微生物多样性研究的瓶颈，大大加速了微生物分子生态学的研究进程。
其中基于核糖体rna（rrna）分子标记的变性梯度凝胶电泳（denaturing dradient gel electrophoresis，dgge）技术，现已成为开展微生物物种多样性和动态变化研究的分子检测工具之一，广泛应用于微生物研究领域。
1 dgge分析技术的原理dgge分析技术最早是由fischer等[1]在1983年提出的一种检测点突变的电泳技术，muyzer等[2]于1993年首次将这种技术应用于微生物群落结构研究中。
该技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对一组特定引物所扩增出的具有相同长度的特定dna 片段进行电泳，因为特定片段碱基序列不同，这就决定了它们具有不同的解链区域，因此在进行变性梯度凝胶电泳时，长度相同而在碱基序列上存在差异的dna双链的解链需要不同的变性剂浓度。
变性梯度凝胶电泳PCRDGGE
04
灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物 品摆放的位置。
05
制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转 动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。
06
灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管 子。
DGGE制胶主体部件：
电泳
1
上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。
2
PA G E 胶 装 入 电 泳 支 架 时 注 意 用 去 离 子 水 润 滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。
注T意ouPcChRd的own
3 环P境CR，。V3区
产物扩增极 易污染。
细节决定成败！
DGGE分析
DGGE前的准备工作
01
从这一步开始，带上手套。
02
配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的 变性溶液备用，注意变形溶液中大颗粒的过滤及脱气。
03
制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以 防止氯离子污染。
3
上样时上样器要深入胶孔底部。
4
尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶
上要有marker lane。
5
将胶放入电泳槽中时注意正负极。
6
建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入
胶中之后再升电压。
剥胶与染色
停止电泳后注意把电泳仪调 零之后在关闭电源
剥胶需要细致，用好去离子 水和保鲜膜。
染色前做好胶样品顺序的标 记。
DGGE图谱的分析
DGGE图谱的聚类分 析、相似性分析
DGGE图谱的主成分分析
DGGE图谱的数字化——Quantity one
DGGE图谱的数字化后的主成分分析
Br+CSM
CSM
凝胶电泳在分子生物学领域中的应用
凝胶电泳在分子生物学领域中的应用分子生物学是研究分子层面上生物学现象的学科领域。
其主要涉及基因、蛋白质、核酸、细胞等等在生命过程中的作用及其相互作用关系。
在这过程中，凝胶电泳就成为了分子生物学领域中一项重要的技术手段。
凝胶电泳技术凝胶电泳技术是一种利用电磁场作用下，通过凝胶孔隙大小分离这些生物大分子的技术。
其中有许多种类型的凝胶被广泛应用于凝胶电泳中，如聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶等等。
因为凝胶的性质与组成不同，因此不同的凝胶在不同的情况下运用可以获得不同的分离结果。
凝胶电泳技术最常见的是通过电泳仪电极将待测DNA、RNA、蛋白等大分子送入具有网状结构的凝胶孔中，而后然后再经由电场作用，来进行不同碎片的分离和检测。
通过凝胶电泳技术，可以对基因组、DNA修饰和蛋白质表达等多个阶段进行分析，可以用于生物学、医学、食品学等广泛领域。
凝胶电泳在基因组分析中的应用在基因组学领域，蛋白质或DNA跑入凝胶孔中进行分离，将DNA分子分离，并分开不同大小的分子，可以方便的分析某个DNA区域与特定疾病或特征之间的关联。
同时，凝胶电泳技术可用于DNA扩增的检测，其在静态DNA分析上具有很高的准确性。
利用PCR技术进行PCR产物的凝胶电泳检测，在浓度确定和产物单一性检验方面有广泛的应用，同时在细胞基因组中的定位也起到了很大的作用。
凝胶电泳在蛋白质组分析中的应用在蛋白质组学领域，凝胶电泳技术主要用于从蛋白质混合中分离出单一目标蛋白质，通过对分子量、电荷量以及疏水性的分析，可以分析该蛋白质的性质和功能。
凝胶电泳技术可以分离出杂质与目标的蛋白质，以利于进一步研究和心而准确地对目标蛋白质进行分析，如进行质谱分析、晶体学分析等等。
凝胶电泳技术在医学中的应用凝胶电泳技术在医学分析领域中主要应用于细胞分析和病理学分析等多种领域。
目前最常用的是基于蛋白质组学研究的肿瘤诊断，它可以从血液或精细组织中分离出肿瘤特异性蛋白质，以及在细胞减数分裂时检测染色体异常变化等等。
凝胶电泳技术在生物分子分离中的应用
凝胶电泳技术在生物分子分离中的应用凝胶电泳技术是一种在生物分子研究中应用非常广泛的方法，它能够对生物材料进行精细的分析和分离，因此被广泛用于生物医学、制药、农业、环境等领域。
一、凝胶电泳技术的基本原理凝胶电泳技术是基于生物分子在电场中运动的原理而发展起来的一种方法。
在凝胶电泳中，生物分子首先被置于凝胶胶体中，然后用电场作用域凝胶中，不同大小和形状的生物分子在电场作用下以不同速度移动，并在不同位置上聚集。
通过这种方式，人们可以对样品中的生物分子进行精细分离和分析。
二、凝胶电泳技术在蛋白质分离中的应用凝胶电泳技术在蛋白质分离中应用广泛。
在蛋白质分离中，主要使用聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）和二维凝胶电泳（Two-Dimensional Gel Electrophoresis, 2DGE）两种方法。
1、PAGE技术PAGE技术可以将蛋白质按大小分离成不同带，从而达到分析和鉴定蛋白质的目的。
PAGE可分为垂直电泳和水平电泳两种，其中垂直电泳较为常用。
在凝胶中加入蛋白酶切片段或蛋白组分标记剂可进一步提高凝胶电泳的分辨率和特异性。
在分离后，可以通过特定方法进行蛋白质定性和定量、鉴定。
2、2DGE技术2DGE技术是一种综合应用分子生物学、生物化学、分析化学等方法的高通量分析技术，可以在一张二维凝胶图像中同时显示数千种蛋白质。
2DGE技术可以将蛋白质按照电荷和相对分子量两个维度进行分离，以获得更加准确的分析结果。
二维凝胶电泳技术通常使用等电聚焦电泳（Isoelectric Focusing Electrophoresis, IEF）和PAGE两种技术的结合。
三、凝胶电泳技术在DNA和RNA分离中的应用凝胶电泳技术在DNA和RNA分离中也有着广泛的应用。
在DNA和RNA分离中，可以使用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。
1、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种比较简单、常用的方法，主要用于准确确定DNA或RNA大小以及其纯度。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)在微生物生态学中的应用
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V ~ 由 于沿着化学梯度的不同解链行为将在凝胶的不同位置上停止迁移 } _X .% 解链行为的不同导致一个凝
该图案是微生物群落中主要种类的一个轮廓 _ 胶 带图案 3 X + + ( 使用所有生物中保守的基因片段如细菌中 的; L # -= n .% 基因片段和真菌中的 ; -= n .% 基因片段 _ 然而同其他分子生物学方法一样3 其 中 之 一 是 只 能 分 离 较 小 的 片 段3 使用于系统发 X + + (也 有 缺 陷 3 育分析比较和探针设计的序列信息量受到了限制 _在某些情况下 3 由于所用基因的多拷贝导致一个种类多 于一条带 3 因此不 易 鉴 定 群 落 结 构 到 种 的 水 平 _ 此 外 3 该技术具有内在的如单一细菌种类 ; L -= X .% 拷 贝 可导致自然群落中微生物数量的过多估计 _ 之间的异质性问题 3 不过为了减少 X 建议研究者结 X + + (是分析微生物群落的一种有力的工具 _ + + (和其它技术的缺陷 3 合X + + (和其它分子及微生物学方法以便更详细的观察微生物的群落结构和功能 _ 关键词 W M微生物生态学 MY M= X + + ( & n n .%
变性梯度凝胶电泳在环境微生物研究中的应用详解
变性梯度凝胶电泳在环境微生物研究中的应用详解王小芬1 王伟东2 高丽娟1 崔宗均1(11中国农业大学农学与生物技术学院,北京100094;21黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江大庆163319)收稿日期:20060509基金项目:国家自然科学基金资助项目(30571088)作者简介:王小芬,讲师;崔宗均,教授,通讯作者,主要从事环境微生物与生物质利用研究,E 2mail :acuizj @摘 要 结合笔者等多年积累的经验详细介绍环境微生物学研究中变性梯度凝胶电泳(D GGE )技术应用全步骤:从环境样品中直接提取总DNA ,利用5′端含GC 夹子的引物PCR 16S rDNA 的部分片段,将PCR 产物在含有浓度线形递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析,使不同来源的DNA 片段在电泳胶中分离,从胶中切出分离的DNA 片段测定碱基序列,进行分类分析。
PCR-D GGE 技术能够检测不可培养的微生物基因,而D GGE 技术与克隆等其他技术结合更能发挥其分离作用。
关键词 环境微生物;变性梯度凝胶电泳;聚合酶链式反应;方法详解;酒精沉淀法;细菌中图分类号 Q-33 文章编号 10074333(2006)05000107 文献标识码 AProtocols of applification of denaturing gradient gel electrophore sis(DGGE )in studie s of environmental microorganismWang X iaofen 1,Wang Weidong 2,Gao Lijuan 1,Cui Zongjun 1(11College of Agronomy and Biotechnology ,China Agricultural University ,Beijing 100094,China ;21College of Biological Science and Technology ,Heilongjiang August First Land Reclamation University ;Daqing 163319,China )Abstract The aim is to introduce detailed procedures for the application denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE )in the study of environmental microorganisms bas ed on our current exp erience in molecular ecology.The pro 2cedure for DGGE includes :Extracting DNA directly from environmental s amples ;PCR in the re gion of 16S rDNA using a primer with GC clamp in 5′;analyzing the PCR products in a p olyacrylamide gel with a chemical denaturing gradient which could s ep arate the different DNA fragments and then extracting bands from the gel and p erforming s equencing and phylogenetic analysis.PCR 2DGGE could detect the gene of unculturable microoganisms ,and the combination of DGGE with clone library and other molecular techniques is more appropriate to exert its predominance in s ep arating DNA.K ey words environmental microorganism ;denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE );PCR;protocol ;ethanol precipitation methods ;bacteria 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis ,D GGE )技术应用于微生物生态学已经历10多年,它对各种环境中的微生物群体研究起到了重要作用。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)
实验四变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变(20, 42, 52, 53)。
Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究 (50)。
后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE） (49)。
此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一 (49, 51)。
1．原理双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) (20, 42)。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成（图1）。
当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。
直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
（图1显示的是一个234bp长的DNA片段的解链区域，横坐标是该DNA片段的序列，依次从第一个碱基到第234个碱基；纵坐标是解链温度。
变性梯度凝胶电泳在微生物生态学中的应用
变性梯度凝胶电泳在微生物生态学中的应用
李德斌;杨洪一;卢磊
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2010(000)012
【摘要】变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是目前在微生物生态学上应用比较广泛的技术之一,具有简便、准确可靠和重复性好等优点.对DGGE的原理、流程、各项技术要点和在微生物生态学上的应用等方面进行了详细地论述,同时归纳和总结了DGGE的优缺点和局限性.
【总页数】5页(P88-92)
【作者】李德斌;杨洪一;卢磊
【作者单位】东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040
【正文语种】中文
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变性梯度凝胶电泳在堆肥微生物研究中的应用3崔宗均1 宫小燕233 李国学1(中国农业大学农业与生物技术学院 北京 100094)1(中国农业大学资源与环境学院 北京 100094)1摘要:对当前堆肥中微生物种群分布及其对有机物分解作用的研究进行分析,论述了分子生物技术中的变性梯度凝胶电泳(DGGE)的特点。
将DGGE与PCR扩增技术相结合,可用于研究自然菌种堆肥和人工培养驯化菌种堆肥过程中微生物的演替规律,为研究和筛选堆肥中的微生物提供更加有效、快速的信息,促进堆肥技术的发展。
关键词:变性梯度凝胶电泳,堆肥,微生物演替中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:025322654(2004)0520116204Application of Denaturing G radient G el E lectrophoresis on Sturdy ofMicrobe in Composting ProcessC UI Z ong2Jun1 G ONG X iao2Y an233 LI G u o2Xue1(College o f Ageonomy and Biotechnology,China Agricultural Univer sity,Beijing100094)1(College o f Resources and Environmental Sciences,China Agricultural Univer sity,Beijing100094)2Abstract:S tudies on the distribution of m icrobe and their degradation of organic material in com post are presented,andthe character of denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)method is als o discussed1C ombined with PCR technolo2gy,DGGE could be effectively applied to investigate m icrobial succession in com posting with natural m icroorganism andwith bred m icrobial community,which could provide prom pt and efficient in formation to facilitate development of com2posting technology1K ey w ords:DGGE,C om post,M icrobial succession在生产及生活中,人们产生大量的固体废弃物,随着产生量不断增长,成为严重的环境问题。
在这些弃废物中,农作物秸杆、畜禽粪便、城市生活垃圾和污水处理厂活性污泥含有大量有机物,焚烧或填埋不仅造成严重的环境污染,而且浪费了大量资源。
将这些废物进行堆肥处理,使之能够成为肥料,从而实现物质的有效循环,对于改善环境、有效利用生物资源具有重要意义[1]。
堆肥是利用自然界中广泛存在的微生物,在人工控制的条件下,将可生物降解的有机物转化为肥料的过程。
为了有效控制堆肥过程,必需了解这个过程中微生物对有机物的降解转化作用、微生物菌系的结构及其变化规律。
1 堆肥过程中微生物对有机物的分解及微生物种群的分布在堆肥原料中存在多种具有分解有机物能力的微生物,在它们的作用下,堆肥中 3国家“十五”科技攻关计划重大项目(N o12002BA516A03)33联系人 T el:010*********,E2mail:xiaoyan-g ong@sina1com1cn收稿日期:2003211217,修回日期:2004201209的有机物氧化分解,释放能量,用于微生物细胞的生长繁殖,同时堆肥的温度发生变化[2]。
目前常用堆肥方式是高温好氧堆肥,根据温度的变化,堆肥过程分为四个阶段:中温阶段,在堆肥的初期,堆肥中的主要微生物是嗜温菌,包括细菌、放线菌和真菌,分解易降解有机物和部分纤维素,生成可溶性糖和有机酸,并释放出热量,堆肥的温度迅速上升至55℃～65℃,进入堆肥的高温阶段;在高温段,微生物以耐高温细菌为主,并有少量放线菌,霉菌对高温耐受能力差而死亡,蛋白质和半纤维素被降解,纤维素、木质素部分被降解;随着易利用组分的消耗,微生物代谢活动减弱,物料温度下降,进入降温阶段,此时微生物种类增多,趋于多样化,真菌重新大量繁殖,纤维素降解速度回升,易分解物质消耗尽;随后进入腐熟期,纤维素降解停止,木质素降解产物与死亡微生物中的蛋白质结合成腐殖质,堆肥逐渐达到稳定。
2 传统分离培养方法与D GGE技术传统的堆肥过程利用堆肥原料中原有的土著微生物,对有机物进行降解和稳定化。
这种方法时间长,营养物质损失大。
为了加快堆肥进程,提高产品质量,研究者致力于堆肥中微生物特性和演替规律的研究[3,4],在此基础上通过驯化、筛选等方法,得到高效降解有机物、耐高温的微生物菌剂,施于堆肥原料中,可缩短堆肥时间[5,6]。
目前,大多数研究仍然采用传统的培养方法,分离和纯化堆肥过程中各种微生物,研究其特性和演替规律[7],同时一些新的分析方法和技术也被逐渐采用,Fang等人采用Biolog system方法,在堆肥中分离、筛选到属于专性或兼性嗜热芽孢杆菌[8]。
磷脂脂肪酸分析方法用来间接推测微生物的种类和特性,研究表明,随着堆肥的进行,微生物种群迅速发生变化[9]。
然而这些结果仅限于可以培养的微生物,而堆肥中存在着大量难以用传统方法培养的微生物,它们可能是厌氧菌或营养条件苛刻,或者菌种本身是末知的,但是这些菌种有可能在堆肥过程中发挥着重要作用,尤其对于难降解有机物的分解是必不可少的,许多研究也证明了这一点[5]。
因此,目前迫切需要新的菌种分离和鉴定技术,在种或属的水平上跟踪堆肥过程中所有重要菌群的变化、演替规律,为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)是在普通凝胶电泳上发展起来的DNA分离技术:DNA 分子在解链温度下发生变性,双螺旋结构部分融解,双链变为单链,4种碱基暴露出来,它们与变性剂(尿素)产生不同的相互作用。
凝胶中变性剂呈梯度分布,则变性DNA分子在凝胶中由于变性剂的存在,移动速度发生变化,最终停止在特定的位置,形成分离开的条带,这些条带可用DNA印迹杂交检测或被切下来提纯,进行PCR扩增,然后确定它们的DNA碱基顺序,每一条带都代表一个不同的微生物种群,仅仅分析条带就能得到有用的信息。
与普通凝胶电泳相比,DGGE技术具有更高的准确性和精确度,能够将分子大小相同,但碱基顺序不同的DNA分子进行分离,快速、灵敏,可以直接用来分析细菌染色体基因[10,11]。
16S rDNA普遍存在于原核微生物中,它记载了微生物遗传和进化的信息,既具有保守性又具有可变性,且分子量适中,因此被广泛用于微生物的鉴定。
从混合菌群中提取DNA,通过PCR扩增反应得到16S rDNA,进行变性梯度凝胶电泳,在凝胶上形成不同的条带,对条带DNA进行分析,获得微生物信息。
这种分析方法不仅适用于通过普通培养方法得到的微生物,还能够分离到难以或无法用常规方法培养的细菌或厌氧菌,以及混合微生物群落中含量很低的DNA序列,无需培养,不受培养基的影响。
从目前的发展趋势可以看出,分子生物学技术正逐步取代某些传统的研究方法而被广泛地应用于环境微生物研究[12]。
3 D GGE用于堆肥过程中微生物菌群演替规律的研究K1Ishii等人采用PCR扩增和DGGE技术,对微生物16S rDNA进行扩增、分离,得到分离的DNA条带,并对不同条带的碱基序列进行分析,利用数据库进行检索,选择同源性较近的菌株构建系统发育树,研究高温好氧堆肥过程中微生物的种类和数量变化规律[13]。
实验发现随着堆肥过程的进行,DGGE条带发生很大的变化:随着温度的升高,条带数减少,当温度降低时,条带数又逐渐增多,表明条带所代表的微生物也发生相应的变化。
在堆肥初期的中温阶段,DGGE图谱中DNA条带分别与四种革兰氏阴性发酵菌的碱基序列相似。
高温期的微生物分别与Bacillus sp1,Virdibacillus和Gracilibacillus具有很高的相似性,中温段的发酵菌消失,温度达到最高值时,B1coagulans占优势,该菌能够水解蛋白质,产生氨使pH上升。
在降温阶段,高温段中的菌消失,出现新的条带,与S1multivorum,A1otitis,Cl1fervidus,Cl1filimentosum和Alcaligenes sp1NK NT AU 相似,当易降解物质被分解后,这些菌可以降解残存的复杂组分,专性厌氧菌的出现表明堆肥中出现了适于厌氧微生物生存的厌氧环境。
在腐熟期,DGGE条带图谱更加复杂,出现了新的条带,与Arthrobacter有关的该属的绝大多数是土壤微生物,这些结果表明,堆肥末期的环境与土壤的寡营养环境相似。
堆肥初期样品中DNA顺序与DNA数据库中的相关顺序具有很高的相似性,而末期相似性较低,表明早期出现的微生物易于分离,且研究得比较透彻,降温期后、腐熟期出现的微生物难于培养和分离,对其研究较少,缺乏相关DNA顺序的数据。
4 D GGE用于纤维素降解菌系的研究崔宗均等人以纤维素(滤纸和秸秆)作为碳源,通过驯化从作物秸秆和畜禽粪便的堆肥中筛选到高效、稳定纤维素降解菌系MCl。
将菌系MCl用于作物秸秆和畜禽粪便堆肥,可以加速堆肥进程,将堆肥时间从3个月缩短为2个月[5,6]。
研究表明在纤维素的降解过程中,DGGE图谱条带的变化表明微生物菌群的种类和数量在发生变化。
在最初4天,条带B、C、D和E占主导,随后条带A和F出现并占主导,而条带B、C、D和E消失。
对条带PCR扩增产物碱基顺序进行分析,发现A属于C1thermosuccinogenes,为严格厌氧菌,这种菌存在于各种生活环境中,能够利用寡糖通过发酵产生乙酸盐、乳酸盐和氢气,然而不能利用纤维素和木聚糖进行生长。
条带C、D和E之间顺序相似,来自于同一菌株的不同操纵子,属于Brevibacillus sp1,Brevibacillus属细菌是严格好氧菌,可利用各种糖产生酸,与条带C2E相对应的细菌可能与糖的消耗和初期有机酸的产生有关,它们所利用的糖来自于稻草的降解。
B和F分别属于Bordetella sp1和P seudoxan2 thomonas。
Bordetella属细菌严格好氧或兼性厌氧,不能水解蔗糖的非发酵性细菌,不能利用葡萄糖、木糖或纤维二糖;P seudoxanthomonas属细菌是好氧菌。