L_异亮氨酸型配体交换固定相对DL_氨基酸的拆分研究
L_异亮氨酸聚合物手性配体交换固定相的制备及对DL_氨基酸的拆分
研究论文L 2异亮氨酸聚合物手性配体交换固定相的制备及对DL 2氨基酸的拆分马桂娟a 龚波林a,b 3 阎 超b(a 宁夏大学能源化工重点实验室 银川750021;b 上海通微分析技术有限公司 上海201203)摘 要 单分散亲水交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯2甲基丙烯酸乙二醇双酯树脂(P G MA /E D MA )和手性配体L 2异亮氨酸反应,再与铜离子进行配位,得到一种新型的L 2异亮氨酸聚合物键合高效手性配体交换固定相。
在流动相为012mol/L Na Ac +011mmol/L Cu (Ac )2水溶液和检测波长为254n m 条件下,固定相拆分了12种DL 2氨基酸对映体,分离因子在1123～2133之间。
详细考察了流动相pH 、流速及柱温等色谱条件对DL 2氨基酸对映体拆分的影响,并探讨了拆分过程热力学。
结果表明,以单分散亲水性聚合物为基质的新型手性配体交换色谱固定相制备简单、操作方便、成本低廉,柱性能稳定。
在配体交换模式下,固定相对12种DL 2氨基酸对映体进行了良好的拆分。
关键词 手性配体交换色谱固定相,单分散树脂,L 2异亮氨酸,DL 2氨基酸,对映体分离中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:100020518(2009)022*******2008201219收稿,2008204209修回科技部国际合作重点项目(2006DF A33690)、教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET 20420986)和上海市博士后科研基金(06R214202)资助项目通讯联系人:龚波林,博士,教授;E 2mail:gongbl@nxu .edu .cn;研究方向:色谱固定相的制备及应用在DL 2氨基酸对映体的色谱拆分方法中,高效配体交换色谱法(ligand 2exchange chr omat ography,LEC )具有样品毋需衍生,对映体选择性高,且色谱柱再生容易等优点,是最佳的色谱拆分方法之一[1～3]。
生物转化和手性拆分技术制备D_氨基酸研究进展_于平
２００５年第４０卷第９期生物学通报３由于植物抗盐性及抗盐机理的复杂性，使植物通过常规育种方法培育抗盐品种进展缓慢。
到目前为止，尚未分离到结构研究清楚、农业上可直接利用的抗盐基因。
中国拥有４００余种盐生植物，占世界盐生植物总数的１／４。
目前利用野生盐生植物资源，提取其总体ＤＮＡ，利用花粉管通道引入法育种已获得一些突破。
今后应加强抗盐机理研究，发掘利用抗盐植物资源，在进行引种和驯化的同时，建立基因库，用基因工程手段培育出具有实际应用价值的抗盐新品种。
参考文献１廖红，严小龙．高级植物营养学．北京：科学出版社，２００３．２李小燕等．植物的盐胁迫生理．西北师范大学学报（自然科学版）．２００４，３（４０）：１０６—１０９．３马雅琴等．植物耐盐相关基因克隆的研究进展．植物遗传资源学报．２００４，５（１）：８１—８６．４陶晶等．植物盐胁迫研究进展．吉林林业科技，２００３，５（３２）：１—５．５高永生．植物盐适应性调节机制的研究进展．草业学报，２（１２）：１—６．（ＢＦ）众所周知自然界中存在２０种基本氨基酸，除甘氨酸外都有２种互成镜像的对映体Ｄ型和Ｌ型，历来认为生命物质只存在Ｌ型氨基酸，并曾将Ｌ型冠以“天然”，而Ｄ型就成了“非天然”。
与Ｌ－氨基酸相比，Ｄ－氨基酸种类少，只占自然界已发现的３００多种氨基酸的１０％左右，但其价格十分昂贵。
随着分析方法的发展，人们相继在海洋动物、陆生动物、脊椎和无脊椎动物、种子植物和人体中发现了各种Ｄ－氨基酸之后，Ｄ－氨基酸才引起人们的高度重视，并意识到它们在医药、农药和食品等的重要组成中起着重要作用。
人体的一些疾病与体内Ｄ－氨基酸的含量有关，诸如白内障晶体浑浊、早老年痴呆症以及某些肾脏疾病的病人，其体内某些组织中Ｄ－氨基酸含量均高于正常人，Ｄ－氨基酸还会阻断一些重要生物物质的合成，从而抑制了动物的生长。
Ｄ－氨基酸对研究某些疾病和衰老机制十分重要，此外Ｄ－氨基酸已被用于!－内酰胺类抗生素和生理活性肽的生物合成。
硅胶键合手性配体交换固定相键合量对α-氨基酸拆分的影响
收稿日期：!""#$#"$%"作者简介：祝馨怡，女，#&’(年生，博士研究生，)$*+,-：./0-.!0+122342*3通讯联系人：陈立仁，男，研究员，博士生导师，电话：（"&%#）5!’6’&7，传真：（"&%#）5!’’"553基金项目：中国科学院重点基金资助项目（批准号：89&6$:#$!"6）3硅胶键合手性配体交换色谱固定相键合量对!!氨基酸拆分的影响祝馨怡，韩小茜，齐邦峰，李永民，蒋生祥，陈立仁（中国科学院兰州化学物理研究所，甘肃兰州’%""""）摘要：合成了两种不同键合量的;$脯氨酸硅胶键合手性配体交换固定相，装柱后利用配体交换色谱法分离了一系列的!$氨基酸。
实验结果表明键合量不同的固定相对!$氨基酸的拆分能力差别较大。
关键词：配体交换色谱；;$脯氨酸；手性固定相；对映体分离；键合量；!$氨基酸中图分类号：<(65文献标识码：=文章编号：#"""$5’#%（!""!）"%$"!!%$"7"##$%&’#&($)’*+,*-./’0*&1’#2(,3456,-4*+"7%(4*-$2(3’/4&’-3!48(,%9&4&,’*43:;(41$1’*&($"*4*&,’1$8434&,’*’#./,*’.%,+1>?@A ,B $0,，?=CA ,+2$D ,+B ，E F G +B H $I J B H ，;F92B H$*,B ，K F =C L:1J B H $/,+B H，M ?)C;,$N J B （!"#$%&’(#)*+*’*,&-.%,/+0"12%3)+0)，4%,.%+#,),50"6,/3&-70+,#0,)，!"#$%&’89::::，.%+#"）.<1&34%&：;$O N 2-,B J 41,N +-P Q +Q ,2B +N 0O 1+P J PR ,Q 1S +N ,2T P U 2B V ,B H +*2T B Q P I 2N -,H +B V J /41+B H J 41N 2$*+Q 2H N +O 10R J N J O N J O +N J VU 0Q N J +Q ,B H P ,-,4+H J -R ,Q 1%$H -04,V 2/0O N 2O 0-Q N ,*J Q 12/0P ,-+B J +B VU 2B V ,B H ;$O N 2-,B J 3W 1JU 2B V ,B H +*2T B Q P 2I;$O N 2-,B J 41,N +-P Q +Q ,2B +N 0O 1+P JR J N J 42B Q N 2--J VJ I I J 4Q ,S J -0+B V 41+N +4Q J N ,.J V U 0F X +B V J -J *J B Q +-+B +-0P ,P 3:2*J Y ;$+*,B 2+4,V P R J N J P J O +N +Q J V +B V Q 1J ,B I -T J B 4J P 2I Q 1J U 2B V ,B H +*2T B Q P 2B Q 1J J I I ,4,J B 402I N J P 2-T Q ,2B 2IY ;$+*,B 2+4,V P U 0-,H +B V J /41+B H J 41N 2*+Q 2$H N +O 10R J N J U N ,J I -0V ,P 4T P P J V +B V J /O -+,B J V U 0Q 1J*J 41+B ,P *2I Q 1J P J O+N +Q ,2B 3=$:>’3+1：-,H +B V J /41+B H J 41N 2*+Q 2H N +O 10；;$O N 2-,B J ；41,N +-P Q +Q ,2B +N 0O 1+P J ；J B +B Q ,2P J O +N +Q ,2B ；U 2B V ,B H +*2T B Q ；!$+*,B 2+4,V 配体交换色谱法（;)M ）是目前拆分!$氨基酸的最简便有效的方法，与传统的分离方法相比，它具有快速高效、分离成本低、选择性高、操作简便、无需柱前衍生等优势［#］。
手性氨基酸的制备及生物活性研究进展
手性氨基酸的合成及生物活性研究进展专业：物理化学学号：M110393 姓名：秦锦摘要：综述了近年来手性氨基酸的制备方法及其生物活性，包括化学拆分法、不对称合成法、结晶法、微生物法、酶法、配位萃取法、膜拆分法以及色谱法等制备方法，还介绍了手性氨基酸作为手性药物的生物活性作用，并对其研究的前景进行了展望。
关键词：手性,氨基酸,制备,拆分,生物活性随着人们对手性氨基酸的深入研究，发现有些物质的D－(－)－异构体和L －(＋)－异构体在生物体中的活性差异很大。
对这一问题的探讨，有助于了解生命过程中药物作用的化学基础与生物基础。
本文综述了近年来手性氨基酸的制备方法及其生物活性作用，并展望了其研究的前景。
1 手性氨基酸化合物的制备方法1.1 化学拆分法DL-对羟基苯甘氨酸可用化学拆分剂进行拆分，常用的拆分剂有溴化樟脑磺酸a－苯基乙胺，酒石酸，脱氢枞胺等。
Yamada S．等用溴化樟脑磺酸(d－BCS)作为拆分剂，对DL-对羟基苯甘氧酸进行拆分，D－对羟基苯甘氨酸的收率可达92％。
但此法反应步骤长、收率低，关键是选择使用周期长、回收容易的拆分剂。
严兆明等应用嗜热菌蛋白酶通过酶促由DL-苯丙氨酸－I－C与Z－L－广丙氨酸合成Z－L-Ala－L－Phe－OMe(1－C)二肽，藉此达到消旋苯丙氨酸的拆分，然后将二肽用嗜热菌蛋白酶在N－甲基吗啉缓冲溶液中进行酶促水解反应，从而获得L－苯丙氨酸。
Umemura等开发了由麦芽假丝酵母不对称降解DL-丙氨酸生产制备D－丙氨酸的实用工艺。
最适降解条件为3O摄氏度、pH6.0、通风量1.0vvm和振荡(1200r ／min)。
此工艺在200g／L DL-丙氨酸规模下，L－丙氨酸在40h内完全降解，剩余的D－丙氨酸可很容易地从反应混合液中分离出来，最终可得99．0％的化学纯和99．9％旋光纯度的D－丙氨酸90g。
Yokoaeki等以醛为原料，经Bucherer反应合成DL-5－取代乙内酰脲，然后用恶臭假单胞菌的二氢嘧啶酶催化选择性水解为N－氨甲酰D－氨基酸，再经化学法或酶法脱氨甲酰基得D－氨基酸，拆分DL-5－对羟基苯乙内酰胺生产D－对羟基苯甘酸，由30 g／L DL-5氨－对羟基苯乙内酰胺生产D－对羟基苯甘氨酸，收率达92％。
发酵液中L-异亮氨酸提取工艺研究
ｌｍ ｎ 活性 炭 添加量 为 ２ 脱 色温度 为 ６ ℃ 、 色时间 为 ２ ｒｉ、 色 时的最佳 ｐ 为 ４７ 在此 工 艺条 Ｏ ｉ、 ％、 ０ 脱 ５ ｎ脱 ａ Ｈ ．。
件 下 ， 一 亮氨酸提 取 收率 为 ９ ． ， Ｌ 异 ４３ 产品 纯度 高达 ９ ．％ 。 ％ ６５ 关键 词 ： 一 亮氨 酸 Ｌ 异 分 离提 取 工 艺 活性 炭 脱 色
了初 步研 究。 别考察 了蛋 白去 除温 度及 时 间、 分 活性 炭 用量 、 色时 间、 色温度 、 脱 脱 发酵 液 ｐ 值 对 Ｌ 异 Ｈ 一
亮氨 酸 分 离提 取 效 果 的 影 响 。 最 终确 定 了提 取 的 工 艺条 件 ． 即蛋 白去 除 温度 及 时 间 分 别 为 ９ ℃和 ０
１ ％ ００
酸 ， 导致 食 欲不 振 、 质 下 降 、 将 体 贫血 及 其 它功 能 障碍 。因此 ， 其用 量逐 年增 长【， １１ ， 。目前 ， ２ ３ 在工业 生
产上 主要应 用发 酵法 生产 Ｌ 异亮 氨 酸 。 一 生产 上 分 离提 取 氨基 酸 的方法 有 很 多种 ， 如 离 子交换 法 、膜分 离技 术等 。本 文采 用加 热除 蛋 白 、 电点 有机 溶剂 法从 发 酵液 中提 取 Ｌ 异亮 氨 等 一 酸 。确立 了最 适蛋 白去 除温 度及 时 间 、活性 炭 用 量 、 色 时间 、 色温 度 、 酵液 ｐ 脱 脱 发 Ｈ值 对 Ｌ 异 亮 一 氨 酸分离 提取 的影 响 。
的发 酵液 ，分别在 ６ ℃、０ 、０ ９ ℃、Ｏ ￣下 Ｏ ７ ℃ ８ ℃、Ｏ Ｉ０Ｃ 加热 ｌ ｍｉ Ｏ ｎ除蛋 白， 比较结 果如 表 １ 所示
表 １ 加 热 温 度 对 去 除 蛋 白量 的 影 响
单分散树脂键合手性配体交换色谱固定相拆分DL-氨基酸
ｂ ｓ ｇ０ １ｍｏ ａ ｃｗｉ ． ｙｕ ｉ ． ＶＬ Ｎ Ａ ｔ ０ １ｍｍｏ ｕ Ａ ） ｏｕｉｎ ａ ｂｌ ｐ ａ ｅａ ｄ ｄ ｔｃｉｎａ ｎ ｈ ＶＬ Ｃ （ ｃ ２ ｌｔ ｓｍｏ ｉ ｈ ｓ ｎ ｅｅ ｔ ｔ ｓ ｏ ｅ ｏ
２ ４ ｎ ． Ｔｈｅ ｅ ｕ ｉ ｎ ｏｒ ｅ ｆＤ—ｓ ｍ ｅ ｆ ｒ —ｓ ｍ ｅ ａ ｂｓ ｒ ｄ ｆ ｒａ ｌｔ ． ｍ ｉ ｃ ｄ ５ ｍ ｌ ｔｏ ｄ ｒ ｏ ｉ ｏ ｒｂｅ ｏ ｅ Ｌｉｏ ｒｗ ｓ ｏ ｅ ｖｅ ｌ ｈｅ ＤＬ ａ ｎｏ ａ ｉ ｓ ｏ ｒ ｓ ｌ ｅ ｘｃ ｐ — ｒ ｉ ｅ ｏ ｖ ｄ ｅ ｅ ｔ ＤＬ ｐ ｏｌ ｎｅ． Ｆｏｒ ＤＬ ｐｒ ｉ ｈｅ ｅ ｕ ｉ ｎ ｏ ｄ ｒ Ｗ ａ ｆｅ ｅ ｒ — ｏｌ ｎｅ ｔ ｌ ｔｏ ｒ ｅ ｓ ｄｉｆ ｒ ｎｔ ｆｏｍ ｈ ｔ ｒ — ｔ ｅ ｏ ｈｅ ｓ ｂｅ
对 Ｄ 一 基 酸 对 映 体 拆 分 的 影 响 。 结 果 表 明 ， 固定 相 在 配体 交 换 色 谱模 式下 可 对 多 对 Ｄ 一 基 酸 进行 良好 的 拆分 。 Ｌ氨 该 Ｌ氨
关 键 词 ： 性 配体 交换 色 谱 固定 相 ； 分 散 树 脂 ；一 氨 酸 ； Ｌ氨 基 酸 ； 映 体 分 离 手 单 Ｌ脯 Ｄ一 对
中 图分 类 号 ： ６ ８ ０ ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ０ ８ １ （ ０ ７ ０ —７ ３０ １ ０ — ３ ２ ０ ） ５０ ２ —５ ７ 栏 目类 别 ： 究 论 文 研
Ｌｉ ａｎｄ Ｅｘｃ ｎｇ ｇ ｈａ ｅ Ｃｈｒ ｏｍ ａｔ ｒ ｏｇ ａｐｈｉ ｐａ ａｔ ｏｎ ｃ Ｓｅ ｒ ｉ ｏｆ ＤＬ— Ａｍ ｉ ｎｏ Ａ ｃ ｄｓ Ｂａｓ ｏｎｏｄｉ ｐｅ ｓ ｉ ｅｄ ｏｎ Ｍ ｓ ｒ ｅ Ｒｅｓ ｎ— ｉ Ｂｏｎｄ ｅｄ Ｃｈｉ ａ ａｔ ｏｎａ ｙ ｒ ｌ Ｓｔ ｉ ｒ Ｐｈａ ｅ ｓ
_氨基酸在L_脯氨酸手性配体交换色谱固定相上的分离
第22卷第4期分析测试学报Vol.22No.42003年7月FENXI CES HI XUEBAO(J ou rn al of In stru mental An al y si s)J ul.2003_氨基酸在L_脯氨酸手性配体交换色谱固定相上的分离祝馨怡,蔡迎春,陈立仁,柳春辉,李永民(中国科学院兰州化学物理研究所色谱中心,甘肃兰州730000)摘要:合成了L_脯氨酸硅胶键合手性配体交换色谱固定相,并用于 _氨基酸的直接光学分离,详细考察了流动相p H值、金属离子浓度、流速、柱温以及进样量等因素对分离效果的影响,从而进一步优化了色谱分离条件。
关键词: _氨基酸;L_脯氨酸;手性固定相;对映体分离;配体交换色谱中图分类号:O657.72;O629.71文献标识码:A文章编号:1004-4957(2003)04-0017-04配体交换色谱法(LEC)是目前分离 _氨基酸最简便有效的方法之一[1]。
根据手性配体是存在于固定相中或者是流动相中,配体交换色谱法可分为:手性固定相(CSPs)配体交换色谱法和手性流动相(CMPs)配体交换色谱法。
其中CSPs配体交换色谱法根据载体的不同,主要分为以聚合物为载体和以硅胶为载体两类。
Davankov等[2]首先将L_脯氨酸键合到苯乙烯二乙烯苯树脂上,形成铜离子配合物,用配体交换色谱法(LEC)分离氨基酸的对映体。
其后许多聚合物被用作手性配体交换色谱固定相(LEC_CSP)的载体,如交联聚丙烯酰胺[3]、交联聚丙烯酸酯[4]和交联聚乙酰胺[5,6]。
但以聚合物为载体的手性固定相机械强度较硅胶差,难以满足高效液相色谱的需求。
适用于HPLC的硅胶键合LEC_CSP是由G bitz[7,8]等发展起来的,与聚合物为载体的手性固定相相比,它具有耐压高效等优势,但交换容量要低于前者。
手性配体交换色谱法分离 _氨基酸受多方面因素的影响,如:流动相pH值、金属离子浓度、流速、柱温以及进样量等。
13_异亮氨酸
第十三章异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵第一节分支链氨基酸的生物合成途径和代谢调节机制在L型异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val）的分子中，都具有由甲基侧链形成的分枝结构（见表13-1），故称上述三种氨基酸为分枝链氨基酸（branched chain amino acids）。
分枝链氨基酸是合成蛋白质的素材，可以作为生物体的能源，也作为生物体成分的前体。
但是，高等动物不能合成这三种氨基酸，故Ile、Leu、Val称为必需氨基酸。
目前，分枝链氨基酸主要用作氨基酸输液的原料。
表13-1 分枝链氨基酸的结构名称结构式分子式分子量异亮氨酸（Ile）C6H13O2N 131.18亮氨酸（Leu）C6H13O2N 131.18缬氨酸（Val）C5H11O2N 117.15Ile分子内有两个不对称碳原子，因而，Ile存在着D、L、D别、L别四种光异构体（表13-2）。
很难用化学合成法，或用化学合成法与酶法相组合的方法，廉价制造纯度高的L型Ile。
Leu与Val分别只有两个光学异构体，能够用化工合成、酶法分割的方法，较廉价地制造。
要廉价生产高纯度的L型Ile，只有采用发酵法，因此，Ile发酵就成了分枝链氨基酸发酵的中心问题。
然而，从自然界中，只找到了分泌Leu或Val的菌株，却找不到分泌Ile的菌株。
直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成系反馈调节机制的全部搞清，可以通过选育目的氨基酸代谢拮抗物抗性株的方法，从遗传上解除原菌株的反馈调节机制，从而可以利用这种抗性菌株，由糖直接发酵生产Ile（Leu或Val）。
表13-2 Ile的四种光学异构体L-Ile D-Ile D-别Ile L-别Ile 1960年，经过用粗糙链孢霉、大肠杆菌的营养缺陷型突变株，及用放射性同位素标记的前体，进行研究的结果，确定了Ile、Leu及Val的生物合成途径（图13-1）。
出于V aI和Leu的所有碳原子，都来自于丙酮酸，所以，V al及Leu亦称丙酮酸族氨基酸。
发酵法生产L_异亮氨酸的研究进展
发酵法生产L 2异亮氨酸的研究进展3李光霞 李宗伟 陈林海 汪杏莉 李宗义 秦广雍(郑州大学离子束生物工程省重点实验室,郑州,450052)摘 要 L 2异亮氨酸作为必需氨基酸之一,广泛应用于医药、食品和饲料等领域。
发酵法是目前生产L 2异亮氨酸最主要的方法。
文中分别从L 2异亮氨酸的生产方法、生物合成及其代谢调控、代谢调控育种、发酵工艺的控制、提取精制方法、国内外生产现状等6个方面,对发酵法生产L 2异亮氨酸的研究进展进行了综述。
关键词 发酵法,L 2异亮氨酸,生物合成,代谢调控,工艺控制 第一作者:硕士研究生(陈林海为通讯作者)。
3国家973课题(2004C B719604)资助 收稿日期:2005-09-30 异亮氨酸(22amino 232methylvaleric acid )由Ehrlich于1904年首次从甜菜糖浆中分离出来,其化学组成虽与亮氨酸相同,但理化性质各异,故命名为异亮氨酸。
异亮氨酸有4种光学异构体,自然界中存在的仅为L 2异亮氨酸。
哺乳动物体本身不能合成L 2异亮氨酸,所以,作为人体必需的8种氨基酸之一,成年人每天需要从外界摄取20mg/kg (体重)的L 2异亮氨酸。
L 2异亮氨酸是合成人体激素、酶类的原料,具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果,在人体生命活动中起着重要作用,因此,在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。
食品方面,主要用于食品强化,使各种氨基酸平衡,提高食品的营养价值。
在医药方面,3种支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)组成的复合氨基酸输液以及大量用于配置治疗型特种氨基酸的药物,如肝安、肝灵口服液,对治疗脑昏迷、肝昏迷、肾病等具有显著疗效,并可取代糖代谢而提供能量,是比较昂贵的氨基酸原料药之一[1]。
近年来的研究表明,L 2异亮氨酸是一种高效的β2防御素表达的诱导物,在诱导上皮防御素表达上起着重要作用,作为一种免疫刺激物,对粘膜表面的防御屏障在临床上将起到重要的支持作用[2]。
L_异亮氨酸发酵条件的研究
收稿日期:2003-06-16作者简介:王菲(1978-),女(汉),河南焦作人,在读硕士,Tel :(022)28193579,E -mail :annefeifei611@sohu 1com 。
文章编号:1006-2858(2004)01-0065-05L 2异亮氨酸发酵条件的研究王 菲,陈 宁,宋文军,刘淑云,张克旭(天津科技大学食品科学与生物工程学院,天津 300222)摘要:目的获得L 2异亮氨酸最佳发酵条件。
方法根据代谢控制发酵原理,采用二次回归正交旋转组合设计考查了发酵培养基中几种主要成分对L 2异亮氨酸发酵的影响,通过MA TLAB 软件获得最佳发酵培养基配比,并研究了各种发酵条件对黄色短杆菌生物合成L 2异亮氨酸的影响。
结果在优化条件下,L 2异亮氨酸产率可达21112g ・L -1。
结论发酵条件的优化控制对微生物发酵生产L 2异亮氨酸十分重要。
关键词:L 2异亮氨酸;二次回归正交旋转组合设计;发酵;MA TLAB 中图分类号:TQ 46417 文献标识码:A L 2异亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一,又是3种支链氨基酸之一,因其特殊的结构和功能,在人类生命代谢中具有特别重要的地位。
L 2异亮氨酸可用于配制一般营养型复合氨基酸输液、要素膳、以及治疗型特种氨基酸输液如肝安、肾安氨基酸输液等,其用量逐年增长[1]。
由于L 2异亮氨酸生物合成途径的特殊性,发酵条件尤其是培养基配比对其有较大的影响。
作者利用二次回归正交旋转组合设计[2,3],借助于SPSS[4]和MAT 2LAB 软件[5]考察了发酵培养基主要组分对产酸的影响并获得了最佳发酵培养基;同时考察了各种发酵条件对黄色短杆菌合成L 2异亮氨酸的影响。
1 材料与方法111 供试菌株黄色短杆菌B revibacteri um f lav um ISW330(Met -+Eth r +α2AB r +AEC r ),天津科技大学代谢控制发酵实验室保藏菌种。
氨基酸手性拆分研究进展
氨基酸手性拆分研究进展摘要：氨基酸广泛应用于医药、食品及化妆品等行业。
大多数氨基酸含有手性中心，存在D型和L型对映异构体。
这两种异构体的生理作用多数情况下是不同或完全相反的。
人工合成的氨基酸大多为外消旋体，必须手性拆分。
本文综合国内外最新研究成果，对氨基酸拆分技术做了较系统综述。
关键词：氨基酸；手性拆分；研究进展引言自20世纪20年代L一谷氨酸钠开始应用以来,人们对氨基酸的利用开发日新月异,特别是近10多年来,氨基酸产品倍受人们关注,其应用更加广泛。
为了更好的借助氨基酸对映体了解生命过程中药物作用的化学基础与生物基础,氨基酸的手性拆分已经引起了国内外广大专家学者的广泛关注,成为了对映体拆分的研究热点。
目前,针对外消旋体的拆分已开发了优先结晶法、形成非对映体立体异构体结晶法、酶促法、色谱法、毛细管电泳法、膜拆分法和萃取法等。
膜拆分法由于具有易于放大、可连续操作和能耗低等特点,所以被认为是一种极具潜力的大规模拆分手性物质的方法。
关于手性拆分的膜分离技术,按膜的形态可分为液膜拆分技术和固膜拆分技术,而手性液膜由于均存在稳定性差的缺点,所以其应用受到了很大限制。
为了获得更稳定的手性拆分系统,人们把更多的注意力投向了固膜拆分技术。
本文研究的正是一种吸附选择型手性拆分固膜,可以用于氨基酸对映体的拆分,同时实现高选择性和高处理量的手性拆分过程,在获得单一光学纯度手性分子的研究中具有重要科学价值和理论意义。
1 氨基酸的手性拆分方法1.1 间接法手性衍生化试剂法（Chiral derivatize tionreagents，CDR），又可被称为间接法。
该方法主要是利用含有手性中心的衍生化试剂对需要拆分的手性化合物进行衍生化，使手性分析物转变成非对映异构体，从而可在非手性柱上实现分离。
常用的手性衍生化试剂包括：异氰酸酯和异硫氰酸酯类、以苯并噁唑和苯并呋喃为母体类、萘衍生物类、三氟甲基磺酸酯类等。
手性衍生化试剂分子中一般含有发色团（紫外、荧光），因此间接法通常灵敏度高。
手性氨基酸的制备及生物活性研究进展
手性氨基酸的合成及生物活性研究进展专业:物理化学学号:M110393 姓名:秦锦摘要:综述了近年来手性氨基酸的制备方法及其生物活性,包括化学拆分法、不对称合成法、结晶法、微生物法、酶法、配位萃取法、膜拆分法以及色谱法等制备方法,还介绍了手性氨基酸作为手性药物的生物活性作用,并对其研究的前景进行了展望。
关键词:手性,氨基酸,制备,拆分,生物活性随着人们对手性氨基酸的深入研究,发现有些物质的D-(-)-异构体和L -(+)-异构体在生物体中的活性差异很大。
对这一问题的探讨,有助于了解生命过程中药物作用的化学基础与生物基础。
本文综述了近年来手性氨基酸的制备方法及其生物活性作用,并展望了其研究的前景。
1 手性氨基酸化合物的制备方法1.1 化学拆分法DL-对羟基苯甘氨酸可用化学拆分剂进行拆分,常用的拆分剂有溴化樟脑磺酸a-苯基乙胺,酒石酸,脱氢枞胺等。
Yamada S.等用溴化樟脑磺酸(d-BCS)作为拆分剂,对DL-对羟基苯甘氧酸进行拆分,D-对羟基苯甘氨酸的收率可达92%。
但此法反应步骤长、收率低,关键是选择使用周期长、回收容易的拆分剂。
严兆明等应用嗜热菌蛋白酶通过酶促由DL-苯丙氨酸-I-C与Z-L-广丙氨酸合成Z-L-Ala-L-Phe-OMe(1-C)二肽,藉此达到消旋苯丙氨酸的拆分,然后将二肽用嗜热菌蛋白酶在N-甲基吗啉缓冲溶液中进行酶促水解反应,从而获得L-苯丙氨酸。
Umemura等开发了由麦芽假丝酵母不对称降解DL-丙氨酸生产制备D-丙氨酸的实用工艺。
最适降解条件为3O摄氏度、pH6.0、通风量1.0vvm和振荡(1200r/min)。
此工艺在200g/L DL-丙氨酸规模下,L-丙氨酸在40h内完全降解,剩余的D-丙氨酸可很容易地从反应混合液中分离出来,最终可得99.0%的化学纯和99.9%旋光纯度的D-丙氨酸90g。
Yokoaeki等以醛为原料,经Bucherer反应合成DL-5-取代乙内酰脲,然后用恶臭假单胞菌的二氢嘧啶酶催化选择性水解为N-氨甲酰D-氨基酸,再经化学法或酶法脱氨甲酰基得D-氨基酸,拆分DL-5-对羟基苯乙内酰胺生产D-对羟基苯甘酸,由30 g/L DL-5氨-对羟基苯乙内酰胺生产D-对羟基苯甘氨酸,收率达92%。
异亮氨酸的所有立体异构 解释说明
异亮氨酸的所有立体异构解释说明1. 引言1.1 概述在生化领域中，异亮氨酸是一种重要的氨基酸，具有多种生理功能和应用价值。
异亮氨酸分子具有立体异构现象，即同一分子在空间中可以存在不同的立体构型。
这些不同的立体异构形式对异亮氨酸的性质、生物活性以及化学反应特性等方面产生重要影响。
1.2 文章结构本文将首先介绍异亮氨酸的简介，包括其化学结构和一般特性。
然后解释立体异构的概念，并详细探讨异亮氨酸可能存在的主要立体异构形式。
接下来，将重点关注立体异构对异亮氨酸性质的影响，包括生物活性差异分析、生物合成途径研究以及化学反应特性比较等方面。
此外，还将探讨缺乏某种立体异构对异亮氨酸所带来的原因和影响，并评估其在应用前景中的作用。
最后，在总结部分总结本文内容，并提出存在问题及改进建议，并展望后续研究方向。
1.3 目的本文旨在全面探讨异亮氨酸的立体异构现象，阐明不同立体异构形式对其性质和应用的影响。
通过深入了解异亮氨酸的立体异构，可以为进一步研究其生理功能、生物合成途径以及开发相关应用提供参考。
此外，本文旨在引起读者对于立体化学在生物领域中的重要性以及其潜在应用的关注，并为未来的研究提供借鉴和指导。
2. 异亮氨酸的立体异构：2.1 异亮氨酸简介：异亮氨酸（Isoleucine）是一种重要的氨基酸，在蛋白质合成和生物代谢中扮演着重要角色。
它具有两个手性碳原子，因此可以存在多种立体异构体。
2.2 立体异构概念解释：立体异构指的是分子结构相同但空间排列不同的化学物质。
对于异亮氨酸而言，其两个手性碳原子上的基团可以以不同的方式连接，形成不同的立体异构体。
2.3 异亮氨酸的主要立体异构形式：异亮氨酸主要存在以下几种立体异构形式：a) L-异亮氨酸：这是天然界广泛存在且生物活性最高的形式。
L-异亮氨酸在蛋白质合成中起到重要作用。
b) D-异亮氨酸：这是与L-异亮氨酸结构镜像对称的形式。
虽然在自然界中很少发现，但D-异亮氨酸在合成药物和肽类药物研究中具有重要价值。
L-异亮氨酸及其衍生物代谢工程研究进展
DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025599引用格式:芦楠,李宇虹,陈宁,等.L -异亮氨酸及其衍生物代谢工程研究进展[J].食品与发酵工业,2021,47(9):307-313.LUNan,LI Yuhong,CHEN Ning,et al.Advances on metabolic engineering of L -isoleucine and its derivatives[J].Food and Fer-mentation Industries,2021,47(9):307-313.L -异亮氨酸及其衍生物代谢工程研究进展芦楠,李宇虹,陈宁,张成林∗(天津科技大学生物工程学院,天津,300457)摘㊀要㊀L -异亮氨酸属于分支链氨基酸,是一种生糖兼生酮氨基酸,为人体8种必需氨基酸之一,广泛应用于医药㊁化妆品㊁食品等诸多领域㊂工业化生产L-异亮氨酸主要采用谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌发酵法合成㊂该文分析比较了谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调控机制;尽管二者代谢途径相同,但关键酶多样性及其调控方式存在差异;在此基础上,从解除关键酶反馈抑制作用㊁切断或弱化支路代谢途径㊁修饰转运系统以及增强辅助因子的供应4个层面综述了L-异亮氨酸及衍生物代谢工程改造策略,旨在为其生产菌株的选育提供参考㊂关键词㊀L -异亮氨酸;生物合成;代谢改造;谷氨酸棒杆菌第一作者:硕士研究生(张成林副教授为通讯作者,E-mail:zcl@)㊀㊀基金项目:国家自然科学基金项目(31300069,31770053);中国博士后科学基金项目(2017M611170,2018T110662)收稿日期:2020-09-07,改回日期:2020-10-09㊀㊀L -异亮氨酸(L -isoleucine)又称 异白氨酸 ,因具有分支的甲基基团,故与L -缬氨酸和L -亮氨酸通称为 分支链氨基酸 [1]㊂L -异亮氨酸属于高附加值氨基酸,具有修复肌肉的功能,常被制成氨基酸输液或口服液,用于治疗肝硬化㊁肥胖症㊁昏迷等病症[2-4]㊂近年来,L -异亮氨酸作为抗血糖药物4-羟基异亮氨酸的合成前体受到广泛关注[5-6]㊂L -异亮氨酸的生产方法主要包括化学合成法㊁毛发提取法和发酵法[7-9],目前发酵法是其工业化生产的主要方法,生产菌株通常为谷氨酸棒杆菌,大肠杆菌亦有研究报道[10]㊂本文从L -异亮氨酸的生物合成途径及其代谢调控机制㊁L -异亮氨酸及其衍生物的代谢工程改造策略进展进行了综述,旨在为其代谢工程研究提供参考㊂1㊀L -异亮氨酸的生物合成途径及其代谢调控机制1.1㊀L -异亮氨酸的生物合成途径由于L -异亮氨酸㊁L -苏氨酸㊁L -甲硫氨酸㊁L -赖氨酸等氨基酸均来源于L -天冬氨酸,故合称为天冬氨酸族氨基酸[2]㊂L -异亮氨酸的生物合成途径涵盖了中心代谢和分支代谢途径:葡萄糖进入细胞后经糖酵解途径(Embden-Meyerhof-Parnas pathway,EMP)和磷酸戊糖途径(hexose monophophate pathway,HMP)生成磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸,在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或(和)丙酮酸羧化酶的作用下发生羧化反应,生成草酰乙酸;后者在转氨酶的作用下生成L -天冬氨酸;L -天冬氨酸经10步催化反应生成L -异亮氨酸,其中涉及5个限速酶(天冬氨酸激酶㊁高丝氨酸脱氢酶㊁高丝氨酸激酶㊁苏氨酸脱氢酶和乙酰羟基酸合成酶);合成的L -异亮氨酸经运输载体输出至胞外,具体合成和运输途径如图1所示㊂由图1可知,合成1mol L -异亮氨酸的需要1mol L -天冬氨酸㊁1moL 丙酮酸㊁2mol 腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)和4mol 还原力还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide ade-nine dinucleotide phosphate,NADPH)㊂1.2㊀L -异亮氨酸代谢调控尽管谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的L -异亮氨酸合成途径相同,但其相关酶及其编码基因具有多样性(表1)㊂如前所述,草酰乙酸是合成L -异亮氨酸的前体物质,但谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的草酰乙酸来源有所差异:大肠杆菌中草酰乙酸主要来源于三羧酸循环及乙醛酸循环,但亦可通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的回补反应获得;而在谷氨酸棒杆菌中草酰乙酸主要通过丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的回补反应获得,其中丙酮酸羧化酶为主要羧化酶[11]㊂值得注意的是,丙酮酸羧化酶以生物素为辅酶㊂因此,在L -异亮氨酸发酵过程中常需要添加玉米浆㊁酵母粉等富含生物素的有机图1㊀L -异亮氨酸的生物合成途径及代谢调控机制Fig.1㊀Biosynthesis pathway and metabolic regulation metabolism of L -isoleucine注:Glucose,葡萄糖;Glucose-6-P,葡萄糖-6-磷酸;PEP,磷酸烯醇式丙酮酸;Pyr,丙酮酸;OAA,草酰乙酸;Asp,天冬氨酸;Asp-P,天冬氨酸磷酸;ASA,天冬氨酸-β-半醛;Hom,高丝氨酸;Hom-P,高丝氨酸磷酸;Thr,苏氨酸;α-KB,α-酮基丁酸;AHB,α-乙酰基-α-羟基丁酸;DMV,α-β-二羟基-β-甲基戊酸;KMV,α-酮基-β-甲基戊酸;AL,α-乙酰乳酸;DIV,α-β-二羟基异戊酸;KIV,α-酮基异戊酸;Ile,异亮氨酸;Val,缬氨酸;Leu,亮氨酸;Lys,赖氨酸;Met,甲硫氨酸;PHBV,3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯;ppc ,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因;pyc ,丙酮酸羧化酶编码基因;lysC ,天冬氨酸激酶编码基因;asd ,天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因;hom ,高丝氨酸脱氢酶编码基因;thrB ,高丝氨酸激酶编码基因;thrC ,苏氨酸合成酶编码基因;ilvA ,苏氨酸脱氢酶编码基因;ilvBN ,乙酰羟基酸合成酶编码基因;ilvC ,二羟酸还原异构酶编码基因;ilvD ,二羟酸脱水酶编码基因;ilvE ,支链氨基酸转氨酶编码基因;leuA ,α-异丙基苹果酸合成酶编码基因;leuB ,β-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因;leuCD ;α-异丙基苹果酸异构酶编码基因;ATP,腺嘌呤核苷三磷酸;ADP,腺嘌呤核苷二磷酸;NADPH,还原型辅酶Ⅱ;NADP +,烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸;propionyl-coA,丙酰辅酶A;phaABC ,PHBV 合成途径中的基因簇(下同)表1㊀大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中L -异亮氨酸分支合成途径相关酶Table 1㊀Enzymes involved in L -isoleucine biosynthesis in Escherichia coli and Corynebacterium glutamate酶编码基因大肠杆菌谷氨酸棒杆菌功能天冬氨酸激酶thrA ㊁metL ㊁lysClysC 天冬氨酸ң天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛脱氢酶asd asd 天冬氨酸磷酸ң天冬氨酸-β-半醛高丝氨酸脱氢酶thrA ㊁metL hom 天冬氨酸-β-半醛ң高丝氨酸高丝氨酸激酶thrB thrB 高丝氨酸ң高丝氨酸磷酸苏氨酸合成酶thrC thrC 高丝氨酸磷酸ң苏氨酸苏氨酸脱氢酶tdcB ㊁ilvA ilvA 苏氨酸ңα-酮基丁酸乙酰羟基酸合成酶ilvBN ㊁ilvGM ㊁ilvIHilvBN 2丙酮酸ңα-乙酰乳酸(ilvBN ∗Eco )α-酮基丁酸+丙酮酸ңα-乙酰基-α-羟基丁酸(ilvBN Cgl ㊁ilvIH )二羟酸还原异构酶ilvC ilvC α-乙酰基-α-羟基丁酸ңα-β-二羟基-β-甲基戊酸二羟酸脱水酶ilvD ilvD α-β-二羟基-β-甲基戊酸ңα-酮基-β-甲基戊酸支链氨基酸转氨酶ilvEilvEα-酮基-β-甲基戊酸ңL -异亮氨酸㊀㊀注:∗,ilvBN Eco 和ilvBN Cgl 分别为来源于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的ilvBN氮源以保证丙酮酸羧化酶的高效催化活性,同时降低L -丙氨酸㊁乳酸等以丙酮酸为前体的副产物[12]㊂除L -异亮氨酸外,L -天冬氨酸还可用于合成L -赖氨酸等多种氨基酸,这些氨基酸无疑与L -异亮氨酸的合成竞争代谢流㊂天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)是L -异亮氨酸分支合成途径中的第一个关键酶酶,该酶催化的反应需要ATP㊂在大肠杆菌中,存在该酶的3种同工酶,分别为AK I㊁AK II 和AK III(分别由thrA ㊁metL 和lysC 基因编码);其中AK I 和AK II 为双功能酶,同时具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性,且AK I起主要作用㊂此外,在大肠杆菌中thrA与高丝氨酸激酶编码基因thrB及苏氨酸合成酶编码基因thrC共同组成thrABC操纵子,该操纵子上游含有弱化子编码基因thrL㊂当环境中或胞内L-苏氨酸或(和)L-异亮氨酸的浓度过高时,ThrL对thrABC操纵子有弱化作用[13]㊂AK I和AK III受到L-苏氨酸和L-赖氨酸的协同反馈抑制,而AK II受L-甲硫氨酸的反馈阻遏[10]㊂然而,在谷氨酸棒杆菌中,仅含有1个天冬氨酸激酶(由lysC基因编码),该酶受到L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制[9]㊂高丝氨酸脱氢酶是L-异亮氨酸分支合成途径第2个关键酶,该酶需要还原力NADPH㊂大肠杆菌中含有由thrA和metL编码的高丝氨酸脱氢酶㊂而在谷氨酸棒杆菌中,仅含1个高丝氨酸脱氢酶编码基因hom,与高丝氨酸激酶编码基因thrB构成hom-thrB基因簇㊂该基因簇受到L-苏氨酸的反馈抑制作用和L-甲硫氨酸的反馈阻遏[14]㊂有报道称,thrB(A20G)可解除L-苏氨酸反馈抑制作用[15]㊂苏氨酸脱氢酶和乙酰羟基酸合酶(aceto-hydroxyacid synthase,AHAS)是L-异亮氨酸合成途径中最关键的2个酶㊂其中苏氨酸脱氢酶催化L-苏氨酸合成α-酮基丁酸,往往受到L-异亮氨酸的反馈抑制[16]㊂大肠杆菌含有ilvA㊁tdcB编码的2个同工酶,而谷氨酸棒杆菌中仅含1个有由ilvA编码的苏氨酸脱氢酶㊂由图1所示,L-异亮氨酸和L-缬氨酸合成均需AHAS㊁二羟酸还原异构酶㊁二羟酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶㊂AHAS受L-异亮氨酸的反馈抑制作用㊂在大肠杆菌内共含有AHAS的3个同工酶(AHAS I㊁AHAS II和AHAS III,分别由ilvBN,ilvGM和ilvIH所编码)㊂其中AHAS I对丙酮酸的特异性较α-酮基丁酸强,因此更有利于L-缬氨酸和L-亮氨酸的合成㊂而编码AHAS II的ilvGM基因存在移码突变,故该酶不表达㊂AHAS III对α-酮基丁酸的特异性高于丙酮酸,故研究者认为该酶更有利于L-异亮氨酸的合成[10]㊂而在谷氨酸棒杆菌中仅含有1种ilvBN编码的乙酰羟酸合酶[4],ilvBN与二羟酸还原异构酶编码基因ilvC组成ilvBNC操纵子㊂α-酮基丁酸对该操纵子有诱导作用,故当α-酮基丁酸积累时ilvBNC操纵子启动转录[17]㊂此外,ilvBNC操纵子上游还含有弱化子,该弱化子能够感受L-异亮氨酸㊁L-缬氨酸和L-亮氨酸浓度,当其积累时,弱化子对ilvBNC操纵子的转录起到弱化作用[18],其弱化调控机制如图2所示㊂图2㊀谷氨酸棒杆菌ilvBNC基因的表达调控机制Fig.2㊀Regulation mechanism for ilvBNCexpression in C.glutamicum在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中仅含1种ilvC编码的二羟酸还原异构酶,该酶需要还原力NADPH㊂此外,在大肠杆菌中二羟酸脱水酶编码基因ilvD和支链氨基酸转氨酶编码基因ilvE以及ilvGM和ilvA 组成操纵子ilvGMEDA;而在谷氨酸棒杆菌中ilvD和ilvE独立存在㊂L-异亮氨酸的摄入和输出均需要运输载体㊂在大肠杆菌中,其输出载体为ygaZH编码的YgaZH,其摄入载体分别为livJ和brnQ编码的LivJ和BrnQ[2]㊂而谷氨酸棒状杆菌中L-异亮氨酸的摄入和输出载体分别为brnQ和brnFE编码的BrnQ和BrnFE㊂除L-异亮氨酸外,BrnFE还可识别并输出L-缬氨酸和L-亮氨酸[19]㊂brnFE的转录受亮氨酸应答调控蛋白(leu-cine responsive regulatory protein,Lrp)和上述3种氨基酸的调控,当其中1种氨基酸积累时,该氨基酸可介导Lrp激活brnFE的转录㊂2㊀L-异亮氨酸合成途径的代谢工程改造依据L-异亮氨酸的生物合成途径及其代谢调控机制,其代谢工程改造策略主要包括:(1)解除代谢物对关键酶的反馈作用;(2)切断或弱化支路代谢途径;(3)修饰转运系统;(4)增强辅助因子的供应(表2)㊂2.1㊀解除代谢物对关键酶的反馈作用天冬氨酸激酶㊁高丝氨酸脱氢酶㊁高丝氨酸激酶㊁苏氨酸脱氢酶及乙酰羟基酸合成酶是L-异亮氨酸合成途径的关键酶,受相应代谢物的反馈抑制或(和)反馈阻遏㊂故欲过量积累L-异亮氨酸,首先应解除代谢物对关键酶的反馈作用,以疏通其合成代谢流㊂表2㊀L-异亮氨酸代谢途径改造策略汇总Table2㊀Summary of L-isoleucine metabolic pathway modification strategies底盘细胞方法发酵规模(周期)L-异亮氨酸产量/(g㊃L-1)转化率/%生产强度/[g㊃(L㊃h)-1]参考文献C.glutamicum 过表达lysC A279T㊁hom G378S-thrB㊁ilvBN P176S/D426E/L575W㊁ilvA F383V摇瓶(72h) 3.5-0.049[9]过表达ilvA V323A和hom G378E3L罐(78h)14.313.70.183[20]敲除Δala基因㊁过表达thrABC操纵子3L罐(72h)15.4-0.214[21]过表达ilvBN I47Y㊁ppnK P57/P117S㊁lrp及brnFE5L罐(72h)32.118.10.446[24]过表达全局调控因子Lrp及输出载体BrnEF3L罐(72h)26.912.20.374[28]敲除ΔbrnQ㊁过表达brnFE5L罐(60h)29.024.00.483[29]过表达核糖体延伸因子FusA和循环因子Frr编码基因3L罐(72h)28.513.90.360[30]过表达gnd㊁fbp㊁pgl基因3L罐(96h)29.013.80.302[32]E.coli过表达thrABC㊁ilvA㊁ilvIH㊁ygaZH㊁ilvCED及lrp 6.6L罐(60h)9.514.00.158[10]过表达thrABC㊁lysC㊁ilvGMEDA基因摇瓶(24h)12.0-0.500[42]㊀㊀注:-,未见报道㊀㊀天冬氨酸激酶受L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制,1mmol L-苏氨酸可抑制酶活力41%㊁1mmol L-赖氨酸可抑制酶活力45%,当二者同时存在时可抑制酶活力82%[9]㊂lysC突变体(lysC A279T)可解除该反馈抑制作用,过表达突变体可使L-苏氨酸的产量增加80%[9]㊂此外,亦有文献报道通过减弱L-赖氨酸的积累部分解除其对天冬氨酸激酶的反馈抑制作用[20]㊂高丝氨酸脱氢酶受L-苏氨酸反馈抑制,目前已报道多个解除该反馈抑制作用的高丝氨酸脱氢酶突变体㊂如hom G378S和hom G378E均可不同程度地解除反馈抑制作用,过表达hom G378S和hom G378E使L-苏氨酸产量由0.09g/L和0g/L分别提高至3.62g/L和4.6g/L[9,20]㊂WANG等[21]利用L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW过表达来源于大肠杆菌解除反馈抑制作用的thrABC操纵子后,L-异亮氨酸产量达到13.8g/L,提高5.3%㊂GUILLOUET等[22]通过过表达解除反馈抑制的高丝氨酸激酶和苏氨酸脱氢酶使得L-异亮氨酸产量达到2.2g/L,提高5倍㊂苏氨酸脱氢酶受L-异亮氨酸的反馈抑制,目前已报道的多个突变体ilvA V140M㊁ilvA F383A㊁ilvA V140M/F383A 均可不同程度地解除其反馈抑制,过表达这些突变体可使L-异亮氨酸产量(0.55㊁0.63和0.73g/L)分别提高17%㊁34%㊁55.3%[16]㊂过表达ilvA V323A突变体使L-异亮氨酸提高到1.18g/L[20]㊂此外,异源表达苏氨酸脱氢酶也可解除L-异亮氨酸的反馈抑制作用㊂GUILLOUET等[23]在谷氨酸棒杆菌中过表达来源于大肠杆菌tdcB基因,当反应体系中L-异亮氨酸浓度达到26.2g/L时仍保留60%的初始酶活,L-异亮氨酸产量达到2.5g/L,较出发菌株提高50倍㊂乙酰羟基酸合成酶受L-异亮氨酸反馈抑制作用,已发现的突变体ilvBN I47Y和ilvBN P176S/D426E/L575W均可不同程度地解除其反馈抑制作用㊂过表达ilvBN I47Y和il-vBN P176S/D426E/L575W可使L-异亮氨酸产量分别达到22.7和4.17g/L,提高10%和67.5%[24-25]㊂2.2㊀切断或弱化支路代谢途径天冬氨酸族氨基酸生物合成途径中,代谢流在经天冬氨酸-β-半醛和L-高丝氨酸后分别流向L-赖氨酸和L-甲硫氨酸等分支途径㊂切断或弱化L-赖氨酸和L-甲硫氨酸等分支途径,可有效提高L-异亮氨酸产量和转化率并降低副产物的积累㊂敲除L-丙氨酸合成基因alaT可降低L-丙氨酸的积累并促使丙酮酸流向草酰乙酸㊂WANG等[21]敲除该基因使得L-异亮氨酸产量达到15.4g/L,提高17.6%,L-丙氨酸浓度有所降低[24]㊂ZHANG等[24]敲除该基因L-异亮氨酸产量达到18.8g/L,提高1.6%㊂DONG等[26]敲除二氢二醇脱氢酶编码基因ddh后使得L-赖氨酸积累量降低30%,L-异亮氨酸产量达3.81g/L,提高8%㊂2.3㊀修饰转运系统当胞内L-异亮氨酸积累达到一定浓度后,由输出载体运输至胞外㊂L-异亮氨酸合成的最后一步转氨反应为可逆反应,因此将积累的L-异亮氨酸及时输出可促进该转氨反应,并可解除其对关键酶的反馈抑制作用[27]㊂此外,摄入载体BrnQ可将胞外的L-异亮氨酸运输至胞内,不利于其高效积累[19]㊂YIN等[28]通过在谷氨酸棒杆菌中过表达转录调控因子Lrp和输出载体BrnFE编码基因使得L-异亮氨酸产量达到26.9g/L,增加63%㊂XIE等[29]过表达brnFE使得L-异亮氨酸产量达到25.9g/L,提高24.9%,在此基础上敲除摄入载体编码基因brnQ使得L-异亮氨酸产量达到29.0g/L,提高28%㊂然而,ZHANG等[24]敲除brnQ基因后L-异亮氨酸产量达到20g/L,提高6%㊂PARK等[10]在大肠杆菌内中过表达输出载体编码基因ygaZH,使得L-异亮氨酸产量达到1.11g/L,较出发菌株(0.322g/L)提高2.45倍㊂另外,研究表明核糖体延伸因子(由fusA编码)和循环因子(由frr编码)可促进转运蛋白合成㊂单独过表达或共表达这2种因子后,L-异亮氨酸产量分别达到10.4(过表达fusA)㊁10.1(过表达frr)和10.9 g/L(过表达fusA-frr),较出发菌株提高了40.5%㊁36.4%㊁47.2%[30]㊂2.4㊀增强辅助因子的供应合成1mol L-异亮氨酸需要4mol NADPH,该途径中hom㊁asd㊁ilvC和ilvE等基因编码的酶均需要NADPH作为辅酶㊂增加NADPH的供应常用策略是增强NADPH相关合成酶的表达水平,如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(由zwf编码)和NAD激酶(由ppnk编码)等㊂SHI等[31]分别单独过表达及共表达zwf和ppnk,发现均能提高胞内NADPH的浓度和L-异亮氨酸产量,而二者共表达效果最佳,使得L-异亮氨酸产量达到4.10g/L,提高85.9%㊂ZHANG等[24]通过过表达ppnk使得L-异亮氨酸产量达到21.6g/L,提高4.9%㊂MA等[32]通过过表达HMP途径关键酶编码基因gnd㊁pgl和fbp增强该途径代谢流以增加NAD-PH的供应,经发酵L-异亮氨酸产量达到28.97g/L,提高24.9%㊂3㊀L-异亮氨酸衍生物的生物合成常见L-异亮氨酸衍生物包括4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)和3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate,PHBV),目前均已实现其生物合成㊂3.1㊀4-HIL的生物合成4-HIL具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌的活性,对I型和II型糖尿病动物均具有治疗效果[33]㊂此外,4-HIL还具有增强肌细胞对血糖吸收㊁促进脂肪代谢㊁降血脂以及保护肝功能等作用[34]㊂4-HIL生物合成是以L-异亮氨酸㊁α-酮戊二酸和O2为底物,由异亮氨酸羟化酶(isoleucine dioxygenase, IDO,由ido基因编码)催化生成[35]㊂KIVERO等[36]将ido转化至大肠杆菌并在发酵过程中添加L-异亮氨酸,实现前体物添加法合成4-HIL,优化条件下产量为163.0mmol/L㊂SHI等[37-38]利用谷氨酸棒杆菌过表达ido,在优化条件下经144h发酵,最高产量达到95.7mmol/L㊂ZHANG等[39]在L-异亮氨酸生产株C.glutamicum YI内构建4-HIL合成途径,通过增强羧化途径和三羧酸循环代谢流,并弱化乙醛酸循环以及丙酮酸和谷氨酸合成代谢流,显著提高了4-HIL的产量㊂同时,采用基于L-异亮氨酸浓度的α-酮戊二酸脱氢酶活性动态调控策略调节三羧酸循环代谢流量,实现了α-酮戊二酸和L-异亮氨酸代谢的动态平衡以及4-HIL的高效合成㊂经64h发酵后4-HIL产量㊁单位菌体产量㊁转化率及发酵强度分别达到34.21 g/L㊁1.87g/g DCW㊁15%和0.53g/(L㊃h)㊂3.2㊀PHBV的生物合成PHBV由3-羟基戊酸辅酶A和3-羟基丁酸辅酶A缩合而成,具有短时间内可降解性,被公认为 绿色塑料 ㊂其中3-羟基戊酸辅酶A前体物丙酰辅酶A 主要来源于L-异亮氨酸合成前体α-酮基丁酸[40]㊂MA等[41]通过在L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum WM001中表达关键酶编码基因phaA㊁phaB和phaC 构建了PHBV合成途径㊂获得的重组菌株WM001/ pDXW-8-phaCAB实现L-异亮氨酸和PHBV联产,产量分别为15和29.8g/L㊂4㊀展望L-异亮氨酸作为8种必需氨基酸之一,在医药㊁化妆品㊁食品等领域应用广泛,其衍生物种类和应用也在不断拓展㊂尽管L-异亮氨酸已实现大规模生产,但与L-色氨酸等必需氨基酸相比成本较高,限制了其在饲料等领域的应用㊂究其原因主要是菌种产量和转化率低㊁发酵周期长㊁菌株遗传稳定性差㊁发酵过程控制精细程度不高等问题㊂针对上述问题,今后的工作应聚焦于以下方面:(1)采用适应性进化或常压室温等离子体诱变结合高通量筛选等技术,选育稳定性和环境耐受性强等性状优良的底盘细胞;(2)基于多组学手段分析L-异亮氨酸代谢流量,根据系统生物学及合成生物学理论和技术,筛选解除反馈抑制且活性无损失或低损失的关键酶突变体,挖掘和运用底物或(中间)产物偶联的基因回路动态调节关键节点,实现高效产酸和生长的平衡;(3)基于代谢流定量分析,结合生产菌株代谢特性,进一步挖掘影响L-异亮氨酸合成的限制因子,优化L-异亮氨酸发酵条件和过程控制,同时深入了解L-异亮氨酸发酵参数和生理状态的联系,实现发酵过程的智能控制,提高发酵的稳定性㊂参考文献[1]㊀陈宁.氨基酸工艺学[M].第二版.北京:中国轻工业出版社,2020.CHEN N.Amino acid technology[M].Second 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[40]㊀JEON J M,KIM H J,BHATIA S K,et al.Application of acetyl-CoAacetyltransferase(AtoAD)in Escherichia coli to increase3-hydroxyvalerate fraction in poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy-valerate)[J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2017,40(5):781-789.[41]㊀MA W J,WANG J L,LI Y,et al.Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)co-produced with L-isoleucine in Corynebacteriumglutamicum WM001[J].Microbial Cell Factory,2018,17(1):93.[42]㊀HASHIGUCHI K,MATSUI H,KURAHASHI O.Effects of a feed-back-resistant aspartokinase III gene on L-isoleucine production inEscherichia coli K-12[J].Bioscience Biotechnology and Biochemis-try,1999,63(11):2023-2024.Advances on metabolic engineering of L-isoleucine and its derivativesLU Nan,LI Yuhong,CHEN Ning,ZHANG Chenglin∗(College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China) ABSTRACT㊀L-Isoleucine belongs to the branched chain amino acids.It is also a glucogenic and ketogenic amino acid.As one of the eight essential amino acids for human,it has been widely used in medicine,cosmetics and food industries.L-Isoleucine is industrially produced via fermentation method by Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli.In this study,the biosynthesis pathway and meta-bolic regulation mechanisms of L-isoleucine in C.glutamicum and E.coli were compared.Despite the similarity of the two pathways, there are differences in the diversity and regulation modes of key enzymes.Furthermore,metabolic engineering strategies for production of L-isoleucine and its derivatives were overviewed on removing the feedback inhibition of key enzymes,blocking or weakening the branched pathways,modifying the transport system and enhancing the supply of co-factors,aiming to provide references for breeding production strain.Key words㊀L-isoleucine;biosynthesis;metabolic engineering;Corynebacterium glutamicum。
异亮氨酸的立体异构_概述及解释说明
异亮氨酸的立体异构概述及解释说明1. 引言1.1 概述在有机化学领域中，立体异构是指两个或多个分子拥有相同的分子式和连接方式，但空间结构不同的现象。
异亮氨酸作为一种重要的氨基酸，在生物体内发挥着关键的生理功能。
其立体异构现象引起了广泛的研究兴趣，并且具有重要的理论和实际意义。
1.2 文章结构本文将分为五个部分进行阐述。
首先，在引言部分将对异亮氨酸的立体异构进行概述，明确研究目的和文章结构。
接下来，将在第二部分介绍异亮氨酸的基本概念以及其立体异构的原理和影响因素。
第三部分将解释说明异亮氨酸立体异构现象，包括手性及手性分子的定义与性质，以及对异亮氨酸不对称碳原子上引入基团所产生的立体效应。
在第四部分，我们将回顾相关研究进展，并展望基于异亮氨酸立体异构在药物设计与开发等领域中的应用前景。
最后，在结论部分对异亮氨酸的立体异构进行总结归纳，并提出未来研究方向的展望。
1.3 目的本文旨在系统地介绍和解释异亮氨酸的立体异构现象，探讨其在生物体内的重要性以及在药物设计与开发等领域中的潜在应用。
通过全面了解立体异构对异亮氨酸性质和功能的影响，期望能够为进一步的研究和应用提供参考和启示。
此外，本文还将展望未来可能涉及到异亮氨酸立体异构研究的其他领域，并希望能够激发更多学者对该领域进行深入探索。
2. 异亮氨酸的立体异构：2.1 异亮氨酸的基本概念：异亮氨酸是一种非极性氨基酸，属于蛋白质的组成单元之一。
它包含一个不对称碳原子，该碳原子上连接有四个不同的基团，因而具有立体异构的能力。
2.2 立体异构的原理和影响因素：原理：异亮氨酸的立体异构是指其空间结构在三维空间中存在多种排列方式。
这源于其不对称碳上四个不同基团的排布情况。
影响因素：立体异构主要受到分子内键角度、非共价相互作用和环境条件等因素的影响。
2.3 异亮氨酸立体异构在生物中的重要性：异亮氨酸的立体异构对于生物系统中许多生理过程和功能至关重要。
它可以影响蛋白质的折叠形态、稳定性以及相应活性。
氨基酸类饲料添加剂-L-异亮氨酸
氨基酸类饲料添加剂-L-异亮氨酸
姚玉妮;李娟
【期刊名称】《中国饲料添加剂》
【年(卷),期】2011(000)002
【摘要】【别名】2-氨基～3-甲基戊酸；异白氨酸【化学名】α-氨基-β-甲基戊酸【总页数】3页(P17-19)
【作者】姚玉妮;李娟
【作者单位】不详
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
【相关文献】
1.氨基酸类饲料添加剂-L-酪氨酸 [J],
2.氨基酸类饲料添加剂-L-脯氨酸 [J],
3.氨基酸类饲料添加剂-L-缬氨酸 [J], 李娟;张洪丽
4.氨基酸类饲料添加剂-L-半胱氨酸 [J],
5.氨基酸类饲料添加剂-L-赖氨酸硫酸盐及其发酵副产物 [J],
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手性配体交换色谱法直接拆分DL-氨基酸
１〕马建标、何炳林，高等学校化学学 ０ 报，待发表． １ 袁直、何炳林，科学通报，３ ５１ １ ５ ９
（９０ １９）．
１〕 Ｇ ２ Ｇｕ ｉ ｂｔ Ｗ ｚ Ｊｌ ｎ ｅ ａ． Ｊ ｅ ｅ ｚ ｔ ｌ ｌ ．
Ｃ ｅ ５ ５８１８） ｈｍ． ６２９（９４．
Ｇｌｎ Ｒ ｉ ｏ Ｌ ｓｅ ｅ ａ Ｊ ｅ ｍ ｔ ｌ ． ｈ ．
定相的 负载量。
２ ．Ａ ｄｂｒ ．Ｌｑ ｈｏ ｔｇ． ， 〕Ｒ ｕｅｅ，Ｊ ｉ．Ｃ ｒｍｏｒ ｔ ，２
１６（ ７） ０ ３１ ９． ９ ３ ＶＡＤ ｖｎ ｏ ， Ｃ Ｃ ｎ ｂｏ ｏ 〕 ．．ａ ａｋ ｖ Ｒ Ｈａｄ ｏｋ ｆ
Ｈ ＰＣ ｒ Ｓ ａ ｔｎ Ａ ｏｏ ｆ ｔ ｅ ｒｉ ｏ ｍ ｎ ｏ ｈ ｐ ａｏ ｆ ｅ
分研究论文总数的一半 〔 进入八十年代，该 ２。
色谱技术 在手性 固定相的 合成 、手性流 动相的选 择 、拆分 机理 探讨等 方 面都获 得 了长足 的发展 。 本文对此进行简要评述 。 手性固定相拆分法
碱性氨基酸往往例外。上述固定相虽然对映体选 择性强， 但疏水性太高， 氨基酸在色谱过程中传质困
物碳链骨架与固定配体之间的侧链上含有羰基或
羟基 、胺基等 基团 。这 些基团一方 面增加 了固定
面影响到固定相对ＤＬ 氨基酸的对映体选择性， － 使 Ｄ 氨基酸先于Ｌ 异构体流出色谱柱，流出顺 － － 序与固定相 和Ⅱ所得结果相反。 蛩
相的亲水性，使氨基酸的传质阻力减小；另一方
与固定相 和Ⅱ相比，固定相Ⅲ＂Ⅵ对氨基 蛳 蟆 龆 — 酸传质阻力小，能实现 ＤＬ 氨基酸的快速拆分。 － 但这些固定相的机械强度较差，难以满足高效液 相色谱对填料的要求。Ｇ ｂｚ ｕｉ 等人使手性配体与 ｔ
合成苏氨酸的研究（V）─DL－别苏氨酸的光学拆分
合成苏氨酸的研究（V）─DL－别苏氨酸的光学拆分
廖晓垣;廖雅琴
【期刊名称】《氨基酸和生物资源》
【年(卷),期】1996(18)3
【摘要】研究了用优先结晶法对ＤＬ－别苏氨酸进行光学活性拆分的问题，在相
图基础上选取适当的过饱和度，即配制成原始拆分母液。
作为晶种，既可用光活性别苏氨酸，也可用光活性苏氨酸，可用对映的一对光活性晶种，还介绍用单一晶种的拆分方法，提出了Ｌ－别苏氨酸与Ｌ－苏氨酸、Ｄ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸为“胶着对”，Ｌ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸，Ｌ－别苏氨酸与Ｄ－苏氨酸为“离散对”的观点。
【总页数】5页(P6-10)
【关键词】苏氨酸;氨基酸;合成;DL-别苏氨酸;光学活性拆分
【作者】廖晓垣;廖雅琴
【作者单位】深圳东深精细化工研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q517.03
【相关文献】
1.别苏氨酸的合成与酶拆分方法的研究 [J], 张虎波;范士明;杨毅华;刘守信
2.DL-苏氨酸的化学合成 [J], 冯美卿;康怀萍;刘红梅;翟超进
3.DL-苏氨酸合成影响因素研究 [J], 冯美卿;翟超进;康怀萍;刘红梅;张江北
4.均匀设计用于优选DL-苏氨酸合成的工艺条件 [J], 丁学杰;林海舟
5.合成苏氨酸的研究（Ⅳ）──DL－苏氨酸的光学拆分 [J], 廖晓垣
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2005年3月March 2005色谱C h inese J ou rna l of C h rom a tog raphyVo l .23N o.2172～175收稿日期:2004207228作者简介:黄晓佳,男,博士,主要从事新型分离介质制备研究,Tel:(0592)2186477,E 2mail:hxj@yanan .x mu .edu .cn .L 2异亮氨酸型配体交换固定相对DL 2氨基酸的拆分研究黄晓佳1, 王秋泉1, 王俊德2, 黄本立1(1.厦门大学化学系现代分析科学教育部重点实验室,福建厦门361005;2.中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116023)摘要:用自制的新型L 2异亮氨酸配体交换固定相在配体交换模式下对11种DL 2氨基酸进行了拆分研究,详细考察了流动相中铜离子浓度、甲醇含量、流速及温度对拆分效果的影响,并探讨了可能的拆分机理。
研究结果表明:流动相中高浓度的铜离子不利于DL 2氨基酸的拆分;增加流动相中甲醇的含量,降低流动相流速以及提高色谱柱温度均可改善拆分效果。
关键词:手性配体交换色谱;手性固定相;L 2异亮氨酸;DL 2氨基酸;对映体分离中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:100028713(2005)022*******S tu d y o f E n a n t iom e r ic S ep a ra t io n o f DL 2Am in o A c id s o nL 2Is o le u c in e 2T yp e C h ira l 2L iga n d 2E x ch a n ge S ta t io n a ry P h a s eHUAN G X iao jia 1,WAN G Q iuquan 1,WAN G J unde 2,HUAN G B en li1(1.The Key L a bora tory of A n a ly tica l Scien ce of M in is try of Edu ca tion,D ep a r tm en t of Chem is try,X iam en U n ivers i ty,X iam en 361005,Ch in a;2.D a lia n In s ti tu te of Chem ica l Phys ics,The Ch in ese A ca dem y of Scien ces,D a lia n 116023,Ch in a )A b s t ra c t:Som e unde riva tized DL 2am ino ac id enan tiom e rs w e re sep a ra ted on L 2iso leuc ine 2typ e ch ira l 2ligand 2exchange s ta tiona ry p hase (E I L E ).The effec ts of con ten ts of copp e r ion andm e thano l in m ob ile p hase,tem p e ra tu re of co lum n and flow ra te of e luen t on the effic iency and reso lu tion of DL 2am ino ac ids w e re inves tiga ted in de ta il .The resu lts show ed tha t C u (Ⅱ)ion p layed an i m p o rtan t ro le in the sep a ra tion.W hen the re w as no C u (Ⅱ)ion in m ob ile p hase,theDL 2am ino ac ids cou ld no t be enan tio 2sep a ra ted,w h ile the con ten t of C u (Ⅱ)inc reased from013m m o l/L to 112m m o l/L,the effic iency of reso lu tion and re ten tion ti m e dec reased.The in 2c reases of the con ten t of m e thano l and co lum n tem pe ra tu re a re in favo r of the reso lu tion fo r m os t of DL 2am ino ac ids.The flow ra te a lso affec ted the reso lu tion resu lts.G ood resu lts cou ld be ob ta ined in reduc ing flow ra te bu t it p ro longs the re ten tion ti m e.The m echan ism s ofd iffe ren t ch ira l sep a ra tion resu lts on the new s ta tiona ry p hase unde r d iffe ren t cond itions w e rea lso inves tiga ted.Ke y w o rd s:ch ira l 2ligand 2exchange ch rom a tog rap hy;ch ira l s ta tiona ry p hase;L 2iso leuc ine;DL 2am ino ac ids;enan tiom e ric sep a ra tion DL 2氨基酸的分离是生命科学研究的基础,在蛋白质多肽的研究、有机化学中的不对称合成以及医药、食品、卫生等领域的研究中都具有重要意义。
目前,配体交换色谱(L EC )法已成为拆分未衍生化DL 2氨基酸的最简便有效的方法[1,2]。
配体交换色谱法可分为手性固定相配体交换色谱法和手性流动相配体交换色谱法[3]。
相比之下,手性固定相配体交换色谱法具有使用方便、分离样品种类多的优势,因而受到人们的关注。
在众多的手性配体交换固定相中,所用的手性选择剂大多具有刚性环状结构,如脯氨酸、羟脯氨酸[4～6]、(S )21,2,3,42四氢232异喹啉羧酸[7,8]等,但这些固定相对DL 2氨基酸的分离时间较长,且需在50℃的高温下进行分离,这对色谱柱的使用寿命有很大的影响。
我们曾报道了以分子中不具有刚性环状结构的L 2异亮氨酸为手性选择剂,通过β2(3,42环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷键合到硅胶上制得L 2异亮氨酸型手性配体交换固定相(E I L E ),并在配体交换模式下实现了对11种DL 2氨基酸的快速拆分[9]。
本工作进一步考察了流动相中铜离子浓度、甲醇含量及流动相的流速、色谱柱的 第2期黄晓佳等:L2异亮氨酸型配体交换固定相对DL2氨基酸的拆分研究温度对拆分效果的影响,并探讨了可能的拆分机理。
1 实验部分1.1 试剂与仪器 Krom as il25μm硅球(瑞典Eka N obe l公司,孔径10nm,比表面积340m2/g),β2(3,42环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷(β2EC TS)(纯度98%,F luck公司),C uSO4・5H2O(分析纯,沈阳试剂三厂),甲醇(色谱纯,山东禹城化工厂),水(二次蒸馏,0145μm微孔滤膜过滤)。
实验中所用的DL2氨基酸均购自美国S igm a公司,其他试剂皆为分析纯。
高效液相色谱(H PLC)系统由日本岛津公司的LC210AD泵和SPD210A多波长紫外分光检测器、R heodyne7125进样阀及江申色谱工作站JS23000组成。
柱温由循环水浴控制(4S K15A2A,J ap an)。
1.2 E IL E固定相的制备 E I L E固定相的制备及表征见文献[9],最后的配体交换固定相结构式如图1所示。
2 结果与讨论2.1 流动相中C u(Ⅱ)浓度的影响 流动相中C u(Ⅱ)浓度对DL2氨基酸的手性分离有较大的影响,其结果如表1所列。
从表1中数据可见,流动相中没有C u(Ⅱ)时,D型和L型同时在较短时间内被洗脱而没有得到拆分;而当流动相中有一定浓度的C u(Ⅱ)存在时,DL2氨基酸得到了分离,这说明所制备的E I L E固定相是在配体交换模式下对DL2氨基酸进行手性拆分的。
当C u(Ⅱ)浓度从013m m o l/L升高到1.2m m o l/L时,DL2氨基酸保留时间变短,同时拆分效果变差(DL2Phe除外),在C u(Ⅱ)浓度为1.2m m o l/L时,一些DL2氨基酸没有得到拆分。
这是因为当流动相中C u(Ⅱ)浓度增加时,待拆分的DL2氨基酸进入色谱柱后,先与流动相中的C u(Ⅱ)形成配合物而难以进入固定相进行配体交换,因此保留时间变短,拆分效果下降。
图1 E IL E的结构示意图F ig.1 T h e s t ru c tu re o f L2is o le u c in e2typ e ch ira l2liga n d2e x ch a n ge s ta t io n a ry p h a s e(E IL E)表1 铜离子浓度对DL2氨基酸拆分的影响T a b le1 E ffe c t o f C u(Ⅱ)co n ce n t ra t io n s s ep a ra t io n o n e n a n t iom e r ic s ep a ra t io n o f DL2am in o a c id sSam p le c(Cu(Ⅱ))=0k LαR Sc(Cu(Ⅱ))=0.3mm o l/Lk LαR Sc(Cu(Ⅱ))=0.6mm o l/Lk LαR Sc(Cu(Ⅱ))=0.9mm o l/Lk LαR Sc(Cu(Ⅱ))=1.2mm o l/Lk LαR SDL2M e t0.42101.181.320.880.781 0 0.621 0 0.481 0 DL2Se r0.12100.681.521.060.651.521.060.531.490.790.511.470.56 DL2Th r0.13101.121.421.160.881.390.870.55100.4710DL2Phe0.48102.841.881.471.671.871.731.542.202.261.502.792.75 DL2T ry1.16107.341.611.537.691.721.536.741.681.376.461.631.23 DL2Ile0.24101.101.760.870.851.380.420.57100.4910DL2A sn0.21100.871.440.950.741.430.720.581.370.600.3910DL2Va l0.18100.781.671.050.741.580.930.621.460.850.3910DL2A sp0.38100.771.200.850.691.120.710.50100.1110DL2O ri30.28100.641.290.960.561.290.890.491.280.870.441.200.51 DL2H is0.24102.722.632.541.972.321.981.592.181.031.371.540.78 Cond itions:m ob ile p hase,0105m o l/L KH2PO4con ta in ing d iffe ren t concen tra tions of CuSO4;flow ra te,017mL/m in;co lum n tem2 p e ra tu re,20℃;de tec tion w ave length,223nm.3O ri:o rith ine m onohyd roch lo ride.2.2 流动相中甲醇含量的影响 流动相中甲醇含量对E I L E固定相拆分DL2氨基酸能力的影响如表2所示。