蛋白质提取
提取蛋白质的具体步骤
提取蛋白质的具体步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：提取蛋白质是生物科学研究中非常重要的一个步骤，它能够帮助研究人员深入了解蛋白质的结构和功能。
下面将为您介绍一些常用的提取蛋白质的具体步骤，希望能对您有所帮助。
1. 选择样本：在进行蛋白质提取前，首先需要选择合适的样本。
样本可以是动植物组织、微生物、细胞等。
在选择样本时，需要考虑到所需提取的蛋白质种类和含量。
2. 细胞破碎：将样本破碎是提取蛋白质的第一步。
通过机械或化学方法破碎细胞壁，释放出蛋白质。
常用的方法包括超声波破碎、研钵研磨、高压破碎等。
3. 细胞裂解：将破碎后的细胞溶液进行裂解是提取蛋白质的下一步。
裂解可使蛋白质从细胞内释放出来。
常用的裂解方法包括离心、温度变化、酸碱处理等。
4. 蛋白质沉淀：裂解后的细胞溶液含有大量的蛋白质和其他杂质，需要进行沉淀分离。
常用的方法包括盐析、醇沉、酸沉淀等。
5. 蛋白质纯化：通过进一步的分离和纯化步骤，可以得到纯度较高的蛋白质。
常用的方法包括柱层析、凝胶电泳、亲和纯化等。
6. 蛋白质鉴定：最后一步是对提取得到的蛋白质进行鉴定和分析。
常用的鉴定方法包括质谱分析、Western blotting等。
以上就是提取蛋白质的具体步骤。
通过这些步骤，研究人员可以有效地提取并纯化蛋白质，为后续的实验和研究提供重要的支持。
希望以上内容对您有所帮助，谢谢！第二篇示例：蛋白质是生物体中重要的基本分子，具有多种生物学功能，包括结构支持、酶催化、信号传导等。
提取蛋白质是生物学研究中常用的实验方法之一。
下面我将介绍提取蛋白质的具体步骤。
1. 样品的制备首先要准备待提取的生物样品，可以是细胞、组织或者生物体。
样品的制备包括收集、洗涤、离心等步骤，确保样品的纯度和完整性。
2. 细胞破碎对于细胞样品，需要先将细胞破碎以释放蛋白质。
常用的细胞破碎方法包括超声波破碎、高压破碎、冻融破碎等，选择适合样品的方法进行破碎。
3. 蛋白质溶解破碎后的细胞溶液需要进行蛋白质溶解，这可以通过添加盐溶液、表面活性剂或有机溶剂等方法来实现。
分离提纯蛋白质的方法
分离提纯蛋白质的方法
蛋白质是营养中很重要的一类物质，它们可以参与营养的过程，也可以参与多种有机反应，因此，提纯蛋白质是很有必要的。
提纯蛋白质的方法一般有硅胶沉淀法、沉淀抽提法、膜分离法等。
一、硅胶沉淀法
硅胶沉淀法是一种常用的提纯蛋白质的方法，它可以将大分子质量，体积小的分子排除在外，只提取蛋白质，这种方法的优点是操作简单，实验时间短，并且耗材成本也较低。
操作时，将样品稀释到所需的浓度，将稀释液中加入适量的硅胶，冷却混匀，经过适当的时间，硅胶就会沉淀在液体中，沉淀物吸附在硅胶上，把沉淀后的液体收集起来，经过一定的漂洗操作，就可以得到纯的蛋白质。
二、沉淀抽提法
沉淀抽提法是一种常用的提取蛋白质的方法，它可以对样品中的蛋白质进行极限沉淀，然后通过抽提的方式分离蛋白质和其他组分。
操作时，将样品加入硫酸钾溶液，然后搅拌均匀，再添加一定量的酒精，使大分子量的蛋白质极限沉淀，抽提上层液体，将抽提的液体经过一定的处理，利用蒸馏抽提的方法，就可以提取出纯净的蛋白质。
三、膜分离法
膜分离法是一种利用滤膜的选择性孔径对物质的分离。
蛋白质提取注意事项
蛋白质提取是实验室常用的操作之一，以下是一些注意事项：
选择适当的细胞/组织来源：根据实验要求选择合适的细胞或组织来提取蛋白质。
确保所选样品含有足够的目标蛋白质。
样品的处理和保存：为了保持蛋白质的完整性，在提取前应该避免冻融过程、待提取样品的长时间暴露在室温下。
样品可以冷藏在蛋白质提取缓冲液中以防止蛋白质降解。
提取缓冲液的选择：根据实验设计和样品的特性选择适当的提取缓冲液。
提取缓冲液的组成可以包括洗涤剂(Detergent)、盐(NaCl)、缓冲盐(Tris)等。
不同的样品可能需要不同的提取缓冲液，并且需要进行优化。
样品的破碎：破碎细胞/组织是提取蛋白质的关键步骤。
常用的方法包括机械破碎、超声波破碎、化学溶解等。
选择合适的方法来破碎样品，并确保破碎效果充分。
提取过程的冷却：为了防止蛋白质的降解，蛋白质提取过程中应该保持低温。
可以在提取过程中使用冷冻离心管、冷藏离心机等设备，或者在提取缓冲液中添加冷冻保护剂。
防止蛋白质的降解：在提取过程中应该尽量减少蛋白质的降解。
可以通过添加蛋白酶抑制剂、进行快速操作、避免强酸碱等方式来保护蛋白质的完整性。
裂解时间和温度的选择：根据不同样品的需要，选择合适的裂解时间和温度，以确保蛋白质的最大提取量。
蛋白质提取后的处理：提取蛋白质后，可以进行后续的实验操作，如测定蛋白质浓度、SDS-PAGE电泳、Western blot等。
记住，蛋白质提取是一个复杂的过程，可能需要进行优化来适应不同样品和实验的需求。
根据具体情况调整实验条件，并遵守实验室安全操作规范。
蛋白质的十种提取方法
蛋白质的十种提取方法蛋白质是构成生物体重要组成部分的大分子有机化合物，对于生物研究和工业生产具有重要意义。
目前，蛋白质的提取方法多种多样，根据不同的目的和实验要求可以选择合适的提取方法。
下面将介绍蛋白质的十种常用提取方法。
1.溶液渗透法：该方法利用溶液渗透作用，通过梯度离心或薄膜渗透，将蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法适用于体积较小且溶解度高的蛋白质。
2.超声波破碎法：通过使用超声波的机械波作用，使得细胞膜破碎，释放出蛋白质。
这种方法操作简单，操作快速，适用于处理小体积的样品。
3.离心法：通过离心来分离混合物中的蛋白质。
根据蛋白质的分子量和比重差异，可以利用离心的力把蛋白质沉淀到离心管的底部。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
4.水解法：通过将蛋白质与水或酸性溶液共同处理，使蛋白质发生水解反应，从而分离出目标蛋白质。
这种方法对于含有多种蛋白质的混合物有效。
5.超滤法：利用超滤膜的渗透性，将蛋白质从混合物中分离出来。
根据蛋白质的分子量大小，可以选择合适孔径的超滤膜。
这种方法可以快速、高效地提取蛋白质。
6.毛细管电泳法：利用毛细管对溶液中的蛋白质进行分离。
该方法可以根据蛋白质的电荷、大小和形状来分离不同蛋白质。
这种方法操作简单、实验时间短。
7.离子交换法：利用离子交换树脂或离子交换膜，根据蛋白质的电荷特性来分离蛋白质。
这种方法可以选择不同类型和大小的离子交换树脂，以实现对不同蛋白质的选择性提取。
8.吸附法：通过特定配体与蛋白质之间的亲和作用，将蛋白质吸附到固相材料上，并通过洗脱来分离蛋白质。
这种方法可以用于高效地纯化蛋白质。
9.柱层析法：利用固定相和流动相之间的亲和力或互斥力分离蛋白质。
依据蛋白质的大小、形状和电荷特性，选择不同类型的柱层析材料，实现对蛋白质的选择性提取。
10.电泳方法：通过电场驱动蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来分离蛋白质。
这种方法可以分离不同分子量和电荷的蛋白质，并可用于纯化和定量分析。
蛋白质提取的方法和原理
蛋白质提取的方法和原理蛋白质提取是生物化学研究中一项非常重要的工作，它是通过化学或物理方法将目标蛋白质从混合物中提取出来，并获得纯度较高的蛋白样品。
蛋白质提取的方法和原理可以根据不同的需求和样本特点而有所区别，下面我将从样品处理、细胞破碎、蛋白质分离、纯化等方面详细介绍蛋白质提取的常用方法和原理。
一、样品处理样品的类型有很多，包括动物组织、细胞、血液等，每种样品的提取方法都有一定差异。
一般来说，细胞或组织样本在提取之前需要冷冻保存，并进行快速破碎以避免蛋白质降解。
对于血液样本，需要血样离心分离血浆或红细胞，再进行提取。
二、细胞破碎细胞破碎是蛋白质提取的关键步骤，目的是破坏细胞膜和细胞器，并释放蛋白质。
常见的细胞破碎方法有机械破碎、超声波破碎和化学法。
1. 机械破碎机械破碎是最常用的细胞破碎方法之一，可以通过碾磨、研磨、切割等方式破坏细胞。
例如，将样品置于液氮中冷冻后，使用研钵和研杵进行研磨，将细胞研磨成粉末状。
2. 超声波破碎超声波破碎是利用高频高能量的超声波震荡来破碎细胞，通常是在冷冻样品和显微量水中进行。
超声波的震荡可以高效破坏细胞和细胞器，并释放蛋白质。
3. 化学法化学法通常是通过加入化学试剂来破坏细胞。
例如，使用洗涤剂（如SDS、Triton X-100）可以溶解细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
三、蛋白质分离蛋白质提取后，需要对蛋白质进行分离，去除杂质和其他成分。
1. 离心离心是最常用的蛋白质分离方法之一，通过不同速度的离心来分离蛋白质。
一般来说，较重的细胞碎片、细胞器和沉淀物会沉积在离心管的底部，而较轻的蛋白质上清液则在上方。
2. 电泳电泳是利用电场将带电蛋白质分离的技术。
常见的电泳方法有SDS-PAGE和凝胶过滤层析等。
SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小和电荷来分离，凝胶过滤层析则可以根据蛋白质的分子量和渗透性进行分离。
四、蛋白质纯化蛋白质分离后，还需要进行纯化以获得较高纯度的蛋白样品。
蛋白质提取的方法和原理
蛋白质提取的方法和原理
1、蛋白质提取方法
1.1 热处理法
热处理是一种简单而有效的蛋白质提取方法，通过高温高压或烧
焦来破坏细胞壁和细胞膜，并释放出蛋白质。
如热溶液法、微波法、
热压法等。
1.2 酸碱法
酸碱法是一种常用的蛋白质提取方法，通过改变蛋白质的电荷性质，使其带有正负电荷，从而在特定的pH下沉淀出来。
如硫酸钾法、
亚硫酸盐法、三氯乙酸法等。
1.3 有机溶剂法
有机溶剂法是一种常见的蛋白质提取方法，常用有机溶剂如甲醇、丙酮、氯仿等，通过溶解细胞膜并使蛋白质溶于有机溶剂中，经离心
分离得到蛋白质。
如甲醇法、氯仿法、醋酸纤维素膜法等。
1.4 冻融法
冻融法是一种新兴的蛋白质提取方法，通过冻结细胞后迅速回温，使细胞壁破裂并释放出蛋白质。
该方法不需要使用有机溶剂或酸碱处理，可避免蛋白质的降解和失活。
2、蛋白质提取的原理
蛋白质提取的原理是利用特定的化学物质或物理条件，破坏细胞
膜和细胞壁，从而释放出蛋白质。
蛋白质在细胞内可以存在于细胞膜、细胞壁、细胞质或细胞核中，提取蛋白质需要根据不同的生物学样品
及其组分情况采用不同的方法。
其中，热处理法是利用高温高压或烧焦等方式破坏细胞壁和细胞膜，从而释放出蛋白质；酸碱法是通过改变蛋白质的电荷性质，在特
定的pH值下使其沉淀出来；有机溶剂法是利用有机溶剂溶解细胞膜，
并使蛋白质溶于有机溶剂中；冻融法则是通过冻结细胞后迅速回温，
使细胞壁破裂并释放出蛋白质。
在蛋白质提取过程中，需要注意避免蛋白质的降解和失活，以及
尽量减少对蛋白质的污染。
蛋白质提取方法
方法一：碱溶酸沉法利用蛋白质可溶于稀碱，当pH接近等电点时沉淀析出的原理，先用碱性溶液来溶解蛋白质，分离出澄清溶液，再将溶液的pH降到蛋白质的等电点使蛋白质沉淀析出，接下来分离沉淀下来的蛋白质。
碱溶酸沉法是目前操作最成熟、应用最多的蛋白质提取方法，常用的碱是氢氧化钠溶液。
碱溶酸沉法具有操作简便、易于控制、成本低廉的优点，缺点是提取操作时间长，蛋白质提取率低，易导致蛋自质变性，对某些原料提取出的蛋白质色泽深等碱溶酸沉法提取蛋白质的影响因素包括碱液浓度、碱液用量、提取温度和提取时间等提取时需要辅助适当的搅拌，以利于蛋白质的溶出。
方法二：盐溶酸沉法盐溶酸沉法的原理是蛋白质可溶于低浓度的盐溶液中，调整溶液pH至蛋白质等电点时，蛋白质则沉淀析出。
浓度较低的中性盐溶液有促进蛋白质溶解、保护蛋白质活性的作用;浓度高则会导致蛋白质发生盐析作用。
常用的盐溶液是氯化钠溶液和六偏磷酸钠溶液。
和传统的碱溶酸沉法相比，盐溶酸沉法的蛋白质提取率较高，蛋白质变性差，但纯度低。
方法三：水酶法该方法适用于提取油脂含量较高的植物蛋白，在获得高品质油脂的同时得到高质量的蛋白质。
在高油植物种子中，油脂存在于细胞内，常与蛋白质或碳水化合物等大分子结合在一起，形成脂多糖或脂蛋白等复合体，必须将油料组织的细胞结构和油脂复合体破坏，才能提出里面的油脂和蛋白质。
水酶法以机械和酶解为手段，来降解细胞壁，分离出蛋白质。
操作时先借助研磨、粉碎等辅助操作将种子组织破碎，再采用对细胞壁以及对脂多糖、脂蛋白等复合体有降解作用的酶(如纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等)来进行处理，使细胞壁断裂，脂多糖、脂蛋白等复合体破坏，从而使蛋白质和油脂容易从细胞中释放出来，再经离心处理即可将蛋白质与油脂分离，得到蛋白质[381。
水酶法的特点是可同时提取油脂和蛋白质，反应条件温和，蛋白质不易变性，提取率高;缺点是酶的成本较高，用量大。
水酶法操作的关键是酶的选择，根据原料细胞结构和化学成分选取恰当的酶，才能保证提取的高效率。
蛋白提取方法
蛋白质提取的方法总汇 2005-4-15 23:00:00 来源：生命经1、植物组织蛋白质提取方法1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！2、植物组织蛋白质提取方法三氯醋酸—丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！3、组织：肠黏膜目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min离心：12000 g，10min，4度，弃上清加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）振荡，置室温20min离心： 7500g，5 min，4度，弃上清重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次沉淀中加入100％乙醇 2ml充分振荡混匀，置室温20 min离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀1％SDS溶解沉淀离心：10000g，10min，4度取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。
蛋白质的提取与纯化
蛋白质的提取与纯化一，蛋白质的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。
提取蛋白质的4种方法
提取蛋白质的4种方法
1. 离子交换：离子交换是最常用的蛋白质提取方法，它使用含有
有机硫酸盐的磷酸盐溶液来提取pH4-9之间的膜蛋白。
它使用有机硫
酸盐作为极性试剂，使蛋白质从其离子溶液中沉淀出来并固定到树脂上，从而被提取。
2. 垂直层析：垂直层析是蛋白质提取的另一种方法，它使用流动
相来垂直运动横穿膜，从而把低浓度的蛋白质从其结晶盐溶液中提取
出来。
它是一种有效的后处理方法，能有效地改善提取的蛋白质的细节、稳定性和纯度。
3. 高通量流精密：高通量流精密设备可以将流体和分散体相分离，包括沉淀物和蛋白质。
它使用高压水流将杂质和悬浮物从蛋白质溶液
中清除，然后用不同的层析方法将蛋白质从其分散体中提取出来。
4. 柱单柱层析：柱单柱层析是另一种蛋白质提取技术，它使用多
种不同的树脂来分离蛋白质从其离子溶液中。
它将溶液通过固定式柱，并使用柱中所含的不同类型的树脂来把具有不同电荷性质的蛋白质从
溶液中提取出来。
蛋白质的纯化提取原理
蛋白质的纯化提取原理
蛋白质的纯化提取原理基于其在溶液中的特殊性质与相互作用。
主要包括以下几个步骤：
1. 细胞破碎：将含有目标蛋白质的细胞或组织破碎，以释放蛋白质。
可以使用机械方法（如超声波破碎器、搅拌破碎等）或化学方法（如溶解剂、蛋白酶等）进行细胞破碎。
2. 去除不溶物：通过离心或过滤等方法，将细胞碎片、细胞器、细胞膜等不溶物从溶液中去除。
3. 分离目标蛋白质：根据目标蛋白质的一些特性，如电荷、大小、亲水性等差异来进行分离。
常用的方法包括离子交换色谱、凝胶过滤层析、亲和层析等。
4. 蛋白质纯化：通过各种纯化技术进一步纯化目标蛋白质。
这些技术可以根据目标蛋白质的特性选择，如凝胶电泳、高效液相色谱、透析等。
5. 结晶或冻干：某些蛋白质可以通过结晶或冻干的方式进一步纯化和稳定。
总的来说，蛋白质的纯化提取原理主要是通过利用蛋白质本身的特性与相互作用，结合不同的物理、化学或生物学方法，逐步分离和纯化目标蛋白质。
蛋白质的提取及测定
蛋白质的提取及含量测定蛋白质的提取1.藻细胞破碎方法1.1反复冻融法：将藻细胞在20℃以下冰冻，再在4℃左右融解，反复3-4次，利用细胞内冰粒的形成和细胞液盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
在显微镜下观察计数细胞破碎率可达90%以上，将破碎的的藻细胞悬浊液于4000 r/min离心20 min，弃沉淀，上清液加入一定量的壳聚糖，浓度为10g/L，充分搅拌后，4℃静置12 h，离心，取上清液。
该法操作简单、方便，适用于实验室少量藻体材料的处理。
1.2溶胀法：直接用蒸馏水或低盐溶液浸泡藻体细胞，使其溶胀、破裂，释放出藻胆蛋白。
用15 g/ L N a N O3或1 0 m m o l / L CaCl2的浸泡效果好。
余九九等比较了液氮冻融法和超声波法后，认为采用蒸馏水或低浓度CaCl2溶液40℃条件下浸泡螺旋藻的提取方法效果较好。
但溶胀法提取周期较长，用蒸馏水要浸泡10 d，用低浓度CaCl2溶液也需浸泡3~4d。
1.3超声波法：运用超声波破碎藻体细胞的细胞壁，使藻胆蛋白溶出。
在80w的超声清洗仪中超声30min，以破坏藻细胞的细胞壁。
该法常作为藻胆蛋白提取中的辅助方法。
单纯用超声波来破碎藻体细胞壁是不够的，还必须与其它方法合用，以最大限度地破碎藻体细胞。
1.4组织捣碎法：将材料配成稀糊状液，用高速组织捣碎机来破碎藻体细胞。
实际操作中，上述几种方法经常混合使用，以最大限度地破碎藻体细胞，使藻胆蛋白溶出。
2.粗提方法2.1盐析法：取上述藻蛋白粗体液，加入25%梯度饱和硫酸铵溶液，4℃静置12 h，离心，离心，取上清液，追加至55%饱和度，4℃静置12 h，离心。
将2次盐析得到的粗体液置于5%硫酸铵饱和梯度中，4℃静置12 h，离心，取上清液，追加至35% 饱和度，4℃静置12h，离心。
将4次盐析得到的粗体液置于23%硫酸铵饱和梯度中，4℃静置12 h，离心，取上清液，追加35%饱和度，4℃静置12h，离心。
蛋白质提取的几种简单方法
蛋白质的提取方法选择材料及预处理以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。
另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
蛋白质提取方法
蛋白质提取方法---- 列举10 种方法一、植物组织蛋白质提取方法（summer ）1、根据样品重量（1g 样品加入 3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4 C或11100rpm20min4 °C4、提取上清夜，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl （PH8）45ml2、甘油（Glycerol ）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone ）6g 这种方法针对SDS-PAGE ，垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法（summer）三氯醋酸—丙酮沉淀法1 、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20C的条件下过夜，然后离心（4C8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的3■巯基乙醇），摇匀后离心（4C 8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15C 8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4C待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80 C备用。
药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的3-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml）,使用前再加入1M 的DTT65ul/ml 。
这种方法针对双向电泳, 杂质少,离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用, 只是电泳的条带会减少！三、组织：肠黏膜（newinbio ）目的：WESTERN BLOT 检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE 提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml 每1mlTRIPURE 用量）倒转混匀,置室温10min 离心：12000 g, 10min, 4 度,弃上清,加入0.3M 盐酸胍/95％乙醇：（2ml 每1mlTRIPURE 用量）振荡,置室温20min离心：7500g, 5 min , 4 度,弃上清重复0.3M 盐酸胍/95％乙醇步 2 次沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀,置室温20 min 离心：7500g, 5min, 4 度,弃上清吹干沉淀, 1％SDS 溶解沉淀离心：10000g, 10min , 4 度取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT ）存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解,还是很大的一块, 4 度离心后又多了白色沉定, SDS 结晶？测浓度,含量才1mg/ml 左右。
蛋白质提取的方法和原理
蛋白质提取的方法和原理蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它在细胞组织的结构、功能和代谢过程中起着重要的作用。
蛋白质的提取是研究细胞生物学、生物化学以及生物技术的关键步骤之一。
本文将介绍蛋白质提取的方法和原理。
一、理论基础蛋白质提取的理论基础主要涉及细胞破碎、蛋白质溶解和蛋白质分离这三个方面。
1. 细胞破碎：为了使蛋白质从细胞内释放出来，首先需要破碎细胞壁或细胞膜。
细胞破碎的方法包括机械破碎、化学破碎和生物破碎等。
其中，机械破碎是最常用的方法，常见的机械破碎设备有高压均质器和超声波破碎器。
2. 蛋白质溶解：破碎后的细胞主要是细胞器和蛋白质，需要选用合适的缓冲液或溶液将蛋白质从细胞组织中溶解出来。
常用的溶解液包括生理盐水、甘氨酸缓冲液等。
3. 蛋白质分离：蛋白质分离是将混合的蛋白质从溶液中分离出来的过程。
常用的蛋白质分离方法包括沉淀法、离心法、柱层析法和电泳法等。
二、常用方法1. 高压均质法高压均质法是一种常用的细胞破碎方法。
它通过将细胞悬浮液经过高压力和剪切力的作用，实现细胞破碎和蛋白质释放。
高压均质器的工作原理是利用高压力将细胞组织迫使通过狭窄的通道，使细胞破碎，并将蛋白质释放到溶液中。
这种方法适用于较大量的样品和需快速处理的情况。
2. 超声波破碎法超声波破碎法是利用超声波高频振荡的机械效应，使细胞破碎和蛋白质释放。
超声波的高频振动可以导致细胞膜的振荡和破裂，从而使细胞内的蛋白质释放到溶液中。
这种方法适用于少量样品和对细胞膜结构破坏要求较高的情况。
3. 酶解法酶解法是利用特定的酶作用于细胞壁或细胞膜，使其发生裂解和蛋白质释放。
酶解法适用于含有高纤维素或硬脂质的细胞组织，常见的酶包括纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等。
4. 离心法离心法是通过离心将细胞破碎后的混合溶液分离成上清液和沉淀物。
分离出的上清液中含有蛋白质，可以通过进一步的柱层析或电泳等方法实现蛋白质的纯化。
5. 柱层析法柱层析法是利用柱状吸附材料对蛋白质进行分离的方法。
蛋白质的提取
2、薄膜的浸润与选择正确膜面是电泳成败的关键之一。 3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 4. 手尽量不要触及薄膜，用镊子夹取。 5、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷
影响电泳区带分离效果。垂直点样。 6、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 7、电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。如必需进行，要先关闭电
细胞，使血 红蛋白流失
3g柠檬酸钠
吸出血浆 5倍体积生理盐水
血液 低速离心 血 浆
100mL
2 min
红细胞
红细胞
缓慢搅拌10min
重复洗涤3次，直至上清液没有 黄色
2. 血红蛋白的释放
原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放血红蛋白
3.分离血红蛋白溶液
分离过程：
红细胞 混合液
脂类物质 沉淀物
甲苯层
高速离心 10min
2）电泳结果分析 如果出现一个条带：样品中含有一个分子质量级别多肽；
如果出现两个条带：样品中含有两个分子质量级别多肽。
3）缓冲溶液－－洗脱剂 作用：
抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。
配制： 由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等
是由外来的锅炉蒸汽直接进行蒸馏。通 常在筛板下锅底部位装有一条开小孔的环形 管，锅炉来的蒸汽通过小孔直接喷出。通过 筛板的筛孔进入原料层加热原料。由锅炉来 的蒸汽是具有一定蒸汽压力，温度较高而含 湿量又较低的饱和蒸汽，能很快加热料层， 因此，对干料加热蒸馏时，干料必须在装锅 前预先湿透。直接蒸汽蒸馏，其蒸馏速度快， 温度高，可缩短蒸馏时间，高沸点的成分可 蒸出，出油率高。
蛋白质提取方法
蛋白质的提取方法有多种，主要包括以下五种：
1.水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂。
提取时需要均匀搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成分性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5℃以下）操作。
为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
2.有机溶剂提取法：一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性和亲脂性，在溶解度范围内（度为10～20%），能避免变性，并起到保护酶的作用。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广（pH3～10），也适用于动植物及微生物材料。
3.超声波破碎法：通过使用超声波的机械波作用，使得细胞膜破碎，释放出蛋白质。
这种方法操作简单、操作快速，适用于处理小体积的样品。
4.溶液渗透法：该方法利用溶液渗透作用，通过梯度离心或薄膜渗透，将蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法适用于体积较小且溶解度高的蛋白质。
5.离心法：通过离心来分离混合物中的蛋白质。
根据蛋白质的分子量和比重差异，可以利用离心法将蛋白质从混合物中分离出来。
提取蛋白的方法
提取蛋白的方法
以下是 8 条关于提取蛋白的方法：
1. 沉淀法呀！就像那细沙在水中慢慢沉淀一样。
比如说，在做豆腐的时候，不就是通过一些物质让豆浆里的蛋白质沉淀下来嘛！这可是个很常用的法子哟！
2. 离心法呢！这不就像把东西使劲甩出去找到我们要的那个部分嘛。
你看，提取血液中的某种蛋白就经常用这个办法呀！
3. 层析法哇！这就如同在一个复杂的迷宫里准确找到我们要的宝贝蛋白。
比如说，从一堆混杂的物质里分离出特定的蛋白质，用这个准没错啦！
4. 电泳法嘿！可以想象成让蛋白们在特定的赛道上赛跑，然后我们就把目标蛋白给揪出来啦。
像检测一些蛋白的存在不就常用它嘛！
5. 亲和层析法呀！就好像蛋白们之间有独特的吸引力，我们利用这一点就能把要的蛋白抓住了呢。
比如提取和某种抗体结合的蛋白，这办法好用得很嘞！
6. 超滤法呢！类似用一个很精细的滤网把小分子筛掉留下蛋白质。
在浓缩蛋白溶液的时候不是常常会用到嘛！
7. 盐析法哇！就如同给蛋白的世界来点特别的调味，让它们乖乖地显现出来。
很多蛋白质的初步提取都离不开它呀！
8. 酸沉淀法哟！感觉像是给蛋白的环境来个小挑战，让它们沉淀下来等着我们去获取。
像从某些植物里提取蛋白就可能会用到呢！
我觉得提取蛋白的方法好多呀，每一种都有它独特的魅力和用途，关键是要根据具体情况选择最合适的那个！。
蛋白组学过程
蛋白组学过程
蛋白组学是研究蛋白质在生物体内的组成、结构和功能的科学领域。
蛋白组学过程可以分为样品处理、蛋白质提取、蛋白质分离、蛋白质鉴定和蛋白质定量几个主要步骤。
1. 样品处理：首先需要准备好待研究的生物样品，如细胞、组织或血清等。
在处理样品之前，可能需要进行预处理步骤，如去除杂质、冻干等。
2. 蛋白质提取：将样品中的蛋白质从其他组分中提取出来。
这个步骤可以使用各种提取方法，如细胞破碎、超声波处理、离心等。
提取的目的是获得纯净的蛋白质样品。
3. 蛋白质分离：将提取得到的蛋白质样品进行分离，常用的方法有凝胶电泳、液相色谱等。
通过分离可以将混合的蛋白质样品分解成单个或少数几个蛋白质组分。
4. 蛋白质鉴定：对分离得到的蛋白质进行鉴定，确定其氨基酸序列和特征。
常用的方法有质谱分析，包括质谱图谱分析、蛋白质测序等。
5. 蛋白质定量：确定蛋白质样品中的蛋白质含量。
常用的方法有比色法、免疫测定法等。
以上是蛋白组学的一般过程，具体的步骤和方法根据研究的目的和需求有所不同。
蛋白组学的发展和应用在生物医学研究、疾病诊断和药物开发等领域具有重要意义。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质提取、纯化及分析技术（适应于微生物、生化等专业）实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、原理与目的多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。
多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。
PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。
多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。
本实验将采用马铃薯为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。
通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组100-200g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M 巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置时配（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机三、操作步骤1：粗酶提取：水果肉组织按1：1（W/V）比例与003M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm 离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
2：盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。
四、实验结果获得PPO粗酶液。
实验二PPO粗酶液的纯化一、原理1.葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析利用大分子不能进入凝胶颗粒内部最先流出柱外，而小分子物质进入凝胶颗粒内部，流速慢而最后流出柱外，凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。
（G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质）2.利用离子交换法，选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料，因为PPO是带有阳离子的蛋白质，在层析时会吸附在柱材料上，而杂蛋白会洗下。
后用NaCl梯度洗脱PPO，（NaCl为强离子交换剂，能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来）。
粗酶液从而得到纯化。
二、材料与试剂试剂：0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纤维素DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G-200;兰葡萄糖－40、70、100等；实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A 大容量低速冷冻离心机三、操作步骤1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡（1）柱材处理称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
（2）装柱将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。
层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。
（3）平衡在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。
其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。
在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝胶。
2．上样：将粗酶液上柱。
3．洗脱：用0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
4．DEAE－纤维素的处理及装柱（1）处理本实验采用的是DEAE－纤维素DE 52 是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。
（2）装柱将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2cm处，停止装柱。
层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。
（3）平衡在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。
其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。
在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，预先将DE-52柱进行平衡。
5．上样：将洗脱酶液上样，用0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白。
6．洗脱：用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001M EDTA)进行梯度洗脱。
7．测定酶活性和蛋白质浓度实验三PPO活性测定一、原理与方法PPO催化各种酚与O2氧化为醌。
本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M 柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm 处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。
在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位（U）。
二、仪器与试剂（1）样品：多酚氧化酶粗酶液硫酸铵沉淀组分DE-52洗脱组分葡聚糖凝胶洗脱组分（2）底物：邻苯二酚：O.01M邻苯二酚溶液（3）反应体系：0.2M邻酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8（4）器皿与仪器：试管、恒温水浴等分光光度计三、酶蛋白的比活性比活性＝酶活单位（U）/mg蛋白质四、实验结果与分析1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）结果列表试管号蛋白质浓度PPO酶活试管号蛋白质浓度PPO酶活空白0 0 3 0.16 0.09粗酶液0.20 0.14 4 0.03 0.031 0.00 0.01 5 0.03 0.012 0.13 0.09 6 0.02 0.02分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。
2. DE-52的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）结果列表试管号蛋白质浓度PPO酶活试管号蛋白质浓度PPO酶活空白0 0 3 0.03 0.05粗酶液0.22 0.16 4 0.09 0.051 0.00 0.00 5 0.07 0.022 0.03 0.02 6 0.03 0.00分析:酶活性高低不一定与蛋白含量高低成正比,3和4试管中含较多所需蛋白。
实验四胰酶分离提取一、原理与目的提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。
经此多次提取，最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。
胰酶在PH3.0时最稳定，可在低温下储存较长的时间而不失活；低与此PH酶易变性；高于PH5时，酶易自溶而失活。
因此提取制备胰酶的全部操作过程应在低温和低PH下进行。
胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。
胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我环化成为有活性的酶。
猪胰蛋白酶原分子量约24000－25000，而猪胰酶分子量为23400。
在酶原活化的过程中，酶原N端Lys与Ile之间的一个肽链被断裂，丢失一个6肽，分子构象发生改变，PI变成10.8。
本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。
同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。
二、材料与试剂1．仪器紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、PH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盆、乳钵、大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、PH试纸，滤纸、玻璃器皿等。
2．材料：新鲜猪胰脏3．试剂及溶液配制pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M，用时稀释一倍）、Tris、硫酸铵。
0.8M pH9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8M四硼酸钠溶液，混合后用PH计校正。