实验七 平板菌落计数与接种
平板菌落计数法
平板菌落计数法农资101 1031240125 周瑶实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验方法1、样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml 无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。
放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不准确，结果误差较大。
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。
通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
平板菌落计数法实验报告
平板菌落计数法实验报告摘要：平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，用于测定液体样品或表面样品中微生物的数量。
本实验旨在通过平板菌落计数法确定给定液体样品中的微生物菌落的数量。
实验过程包括制备不同稀释度的样品，将样品平铺在琼脂平板上，培养并计数菌落数量。
实验结果显示不同稀释度的样品中菌落的数量，从而计算出原液中微生物的浓度。
材料和方法：1. 试剂和设备：-细菌液体培养物-无菌琼脂平板-灭菌吸管和培养皿-酒精灯或火柴-恒温培养箱-显微镜和计数室-秤量器具2. 实验步骤：1. 准备一系列不同浓度的样品，通过逐步稀释原液来获得不同稀释度的样品。
2. 取一块无菌琼脂平板，将其置于消毒柜中加热至溶化状态。
3. 将一份稀释液均匀地倒入平板上，并轻轻旋转平板，使液体均匀覆盖整个平板表面。
4. 等待琼脂凝固，将平板盖上，反转后放置在恒温培养箱中。
5. 在适当的培养温度下培养一段时间（通常为24至48小时）。
6. 取出培养好的平板，使用显微镜和计数室对菌落进行计数。
7. 根据计数结果和稀释倍数计算原液中的菌落数量和浓度。
结果：以下是实验结果的示例表格：讨论：通过平板菌落计数法，我们成功确定了给定液体样品中的微生物菌落的数量。
实验结果表明，随着稀释倍数的增加，菌落数量逐渐减少，原液中的微生物浓度也相应减少。
这种计数方法的优点是简单易行，但也存在一些限制，例如某些微生物可能不适合在琼脂平板上生长，或者某些微生物形成聚集菌落，使得计数困难。
结论：平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，通过稀释液体样品、平铺在琼脂平板上、培养和计数菌落数量，可以确定原液中微生物的浓度。
这种方法可以应用于食品、环境和医药等领域的微生物数量测定，为微生物研究和质量控制提供了重要的手段。
平板菌落计数法计算公式 例题
平板菌落计数法计算公式例题平板菌落计数法计算公式例题一、引言平板菌落计数法是微生物学实验室中常用的一种微生物计数方法，通过在琼脂平板上培养微生物，并根据菌落的形成情况来进行微生物数量的估算。
在本文中，我将介绍平板菌落计数法的计算公式，并通过一个具体的例题来加深理解。
二、平板菌落计数法的计算公式在进行平板菌落计数法时，通常使用以下计算公式来计算微生物的数量：N = n/d * 1/V其中，N 代表菌落总数（CFU/g或CFU/mL）n 代表在某一平板中被计数的菌落数d 代表对数稀释倍数V 代表每次接种的体积（mL）这个计算公式是通过对每个平板上的菌落数进行统计，并根据稀释倍数和接种体积来进行微生物数量的推算。
三、例题分析假设我们在实验室中进行了一次细菌计数实验，以确定某一食品样品中的细菌数量。
我们首先进行了系列的稀释，并将不同稀释倍数的样品接种在琼脂平板上。
在我们观察到的一张平板上，我们发现了以下菌落数：- 在1:10稀释倍数下，菌落数为30- 在1:100稀释倍数下，菌落数为18- 在1:1000稀释倍数下，菌落数为5假设每次接种的体积为1mL，则根据上述数据，我们可以进行如下的计算：N = (30/10) * 1/1 + (18/100) * 1/1 + (5/1000) * 1/1= 3 + 0.18 + 0.005= 3.185根据计算，我们可以认为在此食品样品中的细菌数量为3.185 CFU/mL。
四、总结与回顾通过这个例题的分析，我们加深了对平板菌落计数法的理解。
通过对不同稀释倍数下的菌落数进行计数，并根据计算公式进行推算，我们可以较为准确地确定样品中微生物的数量。
在实际操作中，我们需要注意稀释倍数和接种体积的准确控制，以避免出现较大误差。
五、个人观点和理解平板菌落计数法作为一种常用的微生物计数方法，在实验室中具有重要的应用价值。
通过对菌落的形态和数量进行观察，我们可以快速、准确地了解样品中微生物的数量，为食品安全、药品生产等领域提供了有力的数据支持。
《药学微生物》2-2-3 实训 平板菌落计数法
3、取样
平板菌落计数法
用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、 10-5和10-6的稀释菌悬液各lmL， 对号放入编好号的无菌平皿中。
各取1ml
4、倒平板
平板菌落计数法
尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右 的牛肉膏蛋白胨培养基约15mL/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培 养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。
五、实训结果
平板菌落计数法
1．结果 2．将培养后菌落计数结果填入下表
稀释度
10-4
10-5
10-6
1
2
3
平 均
1
2
3
平 均
1
2
3
平 均
菌落数
每mL样品 活菌数
六、思考题
平板菌落计数法
1、为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板? 试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及 应用。 2、当平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时， 问题出在哪里? 3、用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不 同?为什么要培养较长时间(48H)后观察结果?
待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。
5、计数
平板菌落计数法
培养24h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均 数，并按下列公式进行计算。
每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀 释倍数
一般选择每个平板上长有30～300个菌落的稀释度计算每毫升的含 菌量较为合适。
谢 谢！
实训 平板菌落计数法
一、实训目的
学习平板菌落计数的基本原理和方法。
平板菌落计数法
平板菌落记数法的原理
平板菌落记数法的原理平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，它通过对菌落在平板上的生长情况进行观察和计数，来估算菌液中菌落的数量。
该方法的原理基于菌落在平板上生长的特性和规律，具有简便、快捷、精确的优点，被广泛应用于微生物学研究和实验室工作中。
平板菌落计数法的原理可以概括为以下几个步骤：1. 制备琼脂平板：首先，需要制备一种含有琼脂的培养基，琼脂是一种来源于海藻的多糖，具有凝胶状的特性。
将琼脂和适当的营养成分溶解在适量的水中，加热至溶解后，冷却并倒入培养皿中，使其凝固成为平板。
2. 均匀涂布菌液：将待测的菌液均匀地涂布在凝固的琼脂平板表面，可以使用铁环或平板计数器等工具来帮助涂布。
涂布时要尽量避免气泡的产生和过度涂布，以保证菌落的分散和生长。
3. 培养和生长：将涂布好的平板放置在适当的温度和湿度条件下，使菌落在琼脂平板上生长。
不同的菌种对于温度和湿度有不同的要求，因此需要根据具体菌种的生长特性来进行培养条件的调控。
4. 观察和计数：经过一段时间的培养后，菌落开始在琼脂平板上形成。
通常情况下，菌落会具有明显的形态特征，如大小、形状、颜色等，可以用肉眼或放大镜进行观察。
菌落计数时需要注意避免重复计数或漏计，可以使用计数板或计数器等工具来辅助计数。
通过以上步骤，我们可以得到菌液中菌落的数量。
根据菌落的数量和涂布的体积，可以计算出单位体积的菌液中菌落的数量，从而估算出整个菌液的菌落数量。
平板菌落计数法的优点在于操作简单、结果可靠、成本低廉。
相比于其他计数方法，如涂布计数法和过滤膜计数法，平板菌落计数法不需要特殊的设备和试剂，适用于大多数微生物的计数。
而且由于菌落在平板上生长的特性，每个菌落代表一个活菌，因此可以很好地估计菌液中活菌的数量。
然而，平板菌落计数法也存在一些局限性。
首先，该方法只适用于能够在琼脂平板上生长的菌种，对于一些特殊的菌种可能不适用。
其次，菌落的形成需要一定的时间，因此不能实时监测微生物的数量。
平板菌落计数法
平板菌落计数法平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。
方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu ：colony-forming units），而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
培养皿菌落计数方法---平板法
培养⽫菌落计数⽅法---平板法（⼀）⽬的要求学习平板菌落计数的基本原理和⽅法。
（⼆）基本原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微⽣物充分分散成单个细胞，取⼀定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞⽣长繁殖⽽形成⾁眼可见的菌落，即⼀个单菌落应代表原样品中的⼀个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的⼀个单菌落也可来⾃样品中的2～3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使⽤菌落形成单位(colony-forming units，cfu)⽽不以绝对菌落数来表⽰样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养⼀段时间才能取得，⽽且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数⽅法的最⼤优点是可以获得活菌的信息，所以被⼴泛⽤于⽣物制品检验(如活菌制剂)，以及⾷品、饮料和⽔(包括⽔源⽔)等的含菌指数或污染程度的检测。
（三）器材1．菌种⼤肠杆菌菌悬液。
2．培养基⽜⾁膏蛋⽩胨培养基。
3．仪器或其他⽤具1mL⽆菌吸管，⽆菌平⽫，盛有4.5ml⽆菌⽔的试管，试管架，恒温培养箱等。
培养基（四）操作步骤l．编号取⽆菌平⽫9套，分别⽤记号笔标明10-4、10-5、10-6。
(稀释度)各3套。
另取6⽀盛有4.5mL⽆菌⽔的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
微⽣物培养基2．稀释⽤lmL⽆菌吸管吸取lmL已充分混匀的⼤肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5mL⾄10-1的试管中，此即为10倍稀释。
将多余的菌液放回原菌液中。
将 10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。
另取⼀⽀lml吸管插⼊10 1试管中来回吹吸菌悬液三次，进⼀步将菌体分散、混匀。
吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸⼈管底，吹时离开液⾯，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。
抗菌实验
粉末抗菌试验
粉末样品和 对照样品加 入菌液中并 持续振荡
2014-8-7
静置、取菌液进 行稀释并接种于 含琼脂的培养皿 中进行菌落培养
菌落计算
参照GB/T 21510-2008
4
3.试验结果与分析
样品 C C/TiO2 C/TiO2/Ag C/Ag
Ag含量=5%
Xs
样品 Xs
膜1
膜2
膜3
膜4
2014-8-7
6
有效性评定
评价标准： 参照GB-15979-2002：通过计算样品的抑菌率来评定样品的抗 菌性。
A-B Xs 100% A
Xs-抑菌率；A-培养前平均菌落数； B-培养后平均菌 落数； 被测样品和对照样品抑菌率的差值大于26%，则产品 具有抗菌作用
2014-8-7
5
3.试验结果与分析
试验结果
抗菌实验(平板菌落计数法）
目录
1.平板菌落计数法的原理 2. 实验过程
3.试验结果与分析 4.结论
2014-8-7
2
1.平板菌落计数法的原理
对样品进行适当稀释
微生物在培养基表面繁殖生长
形成肉眼可见的菌落
对菌落数目计数
样品含菌数=一定稀释度的菌落数目×稀释倍数
2014-8-7 3
2.实验过程
膜抗菌试验
微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数
交叉划线法
连续划线法
平板菌落计数法根据微生物在固体培养基上所形成的 菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理进行。即一长成的菌 落代表一个活的细胞。计数时先将待测样品作一系列稀释， 使其中的微生物充分分散成单个细胞，再吸取一定量的稀 释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基 内，经培养单个细胞繁殖形成菌落，统计菌落数目即可计 换算出样品的含菌数。
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应 按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例4）。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按 稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例5）。 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之 间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例6）。
－ －
3.78 ×104 2.71 ×104
5.13 ×105 2.70 ×102 采用科学计数 法；取两位小 数
６
无法计数
305
12
－
3.05 ×104
“无法计数”——指因稀释倍数掌握不好或其它原因造成不能计数， “0”——指平板上无微生物菌落生长。
五、作业
1、将每一个稀释度的三个平板上的菌落数填入下表，并计算结果
菌落计数原则（六条）
1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个 平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应 以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌 落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其 余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的 菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该 稀释度的平均菌落数。
（5）涂布平板 无菌操作，用胶头滴管分别移取10-4、 10-5、 10-6稀释菌液各200 uL于相应编号的培养皿中， 用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀。（注意： 涂布棒火焰灼烧，冷却后再涂布，否则温度太高导致 菌体死亡） （6）培养及计数。将涂布好的平皿放入37℃培养箱中 倒置培养。 2、菌落计数 培养48 h后取出培养皿，算出同一稀释度的三个平 皿中平均菌落数，再按公式计算每毫升样品中活菌数。
平板菌落计数法实验报告结果分析
平板菌落计数法实验报告结果分析实验结果分析1.不同培养基和不同菌株的差异通过实验结果可以看出，不同培养基和不同菌株会对菌落计数结果产生影响。
在LB、NA和TSA培养基中，各菌株的菌落数均有所不同，其中TSA培养基能够提供最适宜的生长环境，因此在其中生长的菌落数最多，二氧化碳依赖菌的菌落数在MRS培养基中比在其他培养基中多了很多。
这说明菌落数受培养基种类的影响相应不同的菌株的适应范围也不同，因此合理选择培养基和菌株是十分重要的。
2.平板数量和加样量的关系实验结果显示，在同一培养基中，对于同一菌株，平板数量与加样量成正比，平板数量的增多意味着可检测到细菌的区域增多，因此能检出更多的细菌。
但是，当平板数量增多到一定程度时，检测的增加将非常有限。
所以在操作中，不能太多样品一起处理，一定要逐一进行。
3.不同培养条件对菌落计数的影响实验结果表明不同培养条件对菌落计数有很大影响，其中温度和时间是最为关键的因素。
在合适的温度下生长，细菌能够在适宜的营养条件下获得最大的生长速率。
在实验中，25℃、30℃、37℃，不同温度条件下生长后的菌落数量明显不同。
同时在不同时间下生长，能看出菌落数量的差异。
因此，菌落计数需要根据菌株的特性和培养条件，针对性地进行调整。
4.实验误差在实验中，可能存在一些误差，如洗手或操作不当，或平移菌液的数量加减不准确，都可能对结果产生一些误差。
因此，在实验中要严格遵守操作规范，减少误差的产生，确保结果可靠性。
结论通过本次实验，我们了解了平板菌落计数法的检测原理、步骤和注意事项。
在实验操作中，要合理选择培养基和菌株，确定适宜的温度和时间，严格按照操作规范进行操作，从而减少误差的产生和保证结果的可靠性。
实验七微生物的分离纯化与平板菌落计数一培养基的配制和灭菌
各组需要配置的培养基和需要灭 菌的玻璃器皿
1,干热灭菌
培养皿10付(1罐),1ml吸管6支至烘箱中进行 干热灭菌(1600C 2h);
2,制备培养基
(1) 每组制备普通营养琼脂培养基,每组 400ml分装于10支试管(灭菌后摆斜面)及2个 锥形瓶;
(2) 每组制备EMB培养基,每组400ml装于2 个锥形瓶,另10支9ml试管自来水(用10ml移 液管准确量取）
一、目的要求
1.了解培养基配制原理，掌握其制备过 程。
2．了解高压蒸汽灭菌器的原理，掌握使 用方法。
二、基本原理
1,培养基 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖和积累代谢产
物所需要的营养基质。 其中含有碳源、氮源、能源,无机盐、生长因子以及水分。 微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内
2.溶化：在量杯中加入所需水量（一般用自来水，特殊需 用蒸馏水），搅匀，加热溶解。
3.补水:按配方定容至所需体积。
4.调pH值：用pH试纸测pH，并用1mol/L NaOH或 1mol/L HCl调节至所需pH范围.
5.过滤：一般不过滤，特殊情况下需过滤，可用滤纸，纱 布或脱脂棉等。
6.分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装 入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。棉塞 的总长度的3/5应在口内，2/5口外。注意不要使培 养基沾染在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。
（1）液体：分装高度以试管度的1/4左右
（2）固体：分装试管，其量为管高的1/5，灭菌后 制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积 之一半为宜。
（3）半固体：分装试管一般以试管高度的1/3为宜， 灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。
7.灭菌
培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸， 便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进 行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。
平板菌落计数法
平板菌落计数法（一）目的要求学习平板菌落计数的基来源根基理和方法。
（二）基来源根基理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不容易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地论述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来暗示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操纵较繁，结果需要培养一段时间才干取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包含水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。
（三）器材1．菌种大肠杆菌菌悬液。
2．培养基牛肉膏蛋白陈培养基。
3．仪器或其他用具1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
（四）操纵步调l．编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。
(稀释度)各3套。
另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2．稀释用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释。
将多余的菌液放回原菌液中。
将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。
另取一支lml吸管拔出10 1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。
吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。
平板菌落计数法
平板菌落计数法（一）目标请求进修平板菌落计数的基起源基础理和办法.（二）基起源基础理平板菌落计数法是将待测样品经恰当稀释之后,个中的微生物充分疏散成单个细胞,取必定量的稀释样液接种到平板上,经由造就,由每个单细胞发展滋生而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞.统计菌落数,依据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数.但是,因为待测样品往往不轻易完整疏散成单个细胞,所以,长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞.是以平板菌落计数的成果往往偏低.为了清晰地阐述平板菌落计数的成果,如今已偏向应用菌落形成单位(colony-forming units,cfu)而不以绝对菌落数来暗示样品的活菌含量.平板菌落计数法固然操纵较繁,成果须要造就一段时光才干取得,并且测定成果易受多种身分的影响,但是,因为该计数办法的最大长处是可以获得活菌的信息,所以被普遍用于生物成品磨练(如活菌制剂),以及食物.饮料和水(包含水源水)等的含菌指数或污染程度的检测.（三）器材1．菌种大肠杆菌菌悬液.2．造就基牛肉膏蛋白陈造就基.3．仪器或其他器具1mL无菌吸管,无菌平皿,盛有4.5ml无菌水的试管,试管架,恒温造就箱等.（四）操纵步调l．编号取无菌平皿9套,分离用记号笔标明10-4.10-5.10-6.(稀释度)各3套.另取6支盛有4.5mL无菌水的试管,依次标是10-1.10-2.10-3.10-4.10-5.10-6.2．稀释用lmL无菌吸管汲取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品),准确地放0.5mL至10-1的试管中,此即为10倍稀释.将过剩的菌液放回原菌液中.将10-1试管置试管振荡器上振荡,使菌液充分混匀.另取一支lml吸管拔出10 1试管中往返吹吸菌悬液三次,进一步将菌体疏散.混匀.吹吸菌液时不要太猛太快,吸时吸管伸人管底,吹时分开液面,以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢.用此吸管汲取10-1菌液lmL,准确地放0.5mL至10-2试管中,此即为100倍稀释.其余依次类推.放菌液时吸管尖不要碰着液面,即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液,不然稀释不准确,成果误差较大.3．取样用三支1mL无菌吸管分离汲取10-4.10-5和10-6的稀释菌悬液各lmL,对号放入编好号的无菌平皿中,每个平皿放0.2mL.不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼,如许轻易加大统一稀释度几个反复平板间的操纵误差.4．倒平板尽快向上述盛有不合稀释度菌液的平皿中倒入熔化后冷却至45℃阁下的牛肉膏蛋白胨造就基约15mL/平皿,置程度地位敏捷旋动平皿,使造就基与菌液混杂平均,而又不使造就基荡出平皿或溅到平皿盖上.因为细菌易吸附到玻璃器皿概况,所以菌液参加到造就皿后,应尽快倒入熔化并于已冷却至45℃阁下的造就基,立刻摇匀,不然细菌将不轻易疏散或长成的菌落连在一路,影响计数.待造就基凝固后,将平板倒置于37℃恒温造就箱中造就.5．计数造就48h后,掏出造就平板,算出统一稀释度三个平板上的菌落平均数,并按下列公式进行盘算,每毫升中菌落形成单位(cfu)=统一稀释度三次反复的平均菌落数×稀释倍数×5一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度盘算每毫升的含菌量较为适合.统一稀释度的三个反复对比的菌落数不该相差很大,不然暗示实验不准确.现实工作中统一稀释度反复对比平板不克不及少于三个,如许便于数据统计,削减误差.由10-4.10-5.10-6三个稀释度盘算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不该相差太大.平板菌落计数法,所选择倒平板的稀释度是很主要的.一般以三个持续稀释度中的第二个稀释度倒平板造就后所消失的平均菌落数在50个阁下为好,不然要恰当增长或削减稀释度加以调剂.平板菌落计数法的操纵除上述倾泻倒平板的方法以外,还可以用涂布平板的方法进行.二者操纵基底细同,所不合的是后者先将牛肉膏蛋白胨造就基熔化后倒平板,待凝固后编号,并于37℃阁下的温箱中烘烤30min,或在超静工作台上恰当吹干,然后用无菌吸管汲取稀释好的菌液对号接种于不合稀释度编号的平板上,并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布平均,平放于实验台上20～30min,使菌液渗入造就基表层内,然后倒置37℃的恒温箱中造就24～48h.涂布平板用的菌悬液量一般以0.1mL较为合适,假如过少菌液不轻易涂布开,过多则在涂布完后或在造就时菌液仍会在平板概况流淌,不轻易形成单菌落.。
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2、制备土壤稀释液：
称取土壤1g，制备10－2 土壤稀释液，再取4只 无菌 试管稀释制备10－3 、10－4菌液。
3、倒平皿与平板涂布：
取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿中， 冷却凝固。分别吸取 0.1 ml上述制备的10－3或10－4菌液 玻棒涂布，室温静置5－10 min，使菌液吸附进培养基， 倒置于37 0C恒温培养24 h。
37 0C恒温培养。
图4－8 穿刺接种：（a）水平穿刺接种；（b）垂直穿刺接种
五、实验任务
1、2人一组: 6只平皿稀释平板计数，做2个稀释度。24 h观察并计数。
2、每人： 做1支斜面接种（接放线菌或霉菌），1支 液体接种（接细菌），1支半固体穿刺接种 （接细菌）。
六、思 考 题
1. 结果 （1）将培养后菌落计数情况填如下表：
试管拔塞后过火灭菌和取菌
斜面划线法（a）和不同细菌直线接种长出的菌苔形态（b）
（2）液体接种法（1支试管/人）
使用牛肉膏蛋白胨液体培养基。
用接种环从平皿上挑取细菌单菌落，接入液体培养基。
放下环后，再将棉塞旋紧，在试管斜面上距试管口2～ 3cm处贴上标签。 37 0C恒温培养。
（在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种， 同时要求无菌操作。）
左手平托两支试管，拇指按住试管底部。外侧使是菌种试 管，内侧是待接的空白斜面。（两支试管的斜面同时向 上），右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。 右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可 能伸入试管的其余部位也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌心将 两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让 试管口缓缓过火焰。
2. 为什么融化后的培养基要冷却至45 0C左右才能倒平板？
3. 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
结
束
4、观察细菌菌落形态以及计数菌落： 培养24 h后，取出培养皿数菌落数，算出同一稀释度 三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算： 每ml 中菌落形成单位（cfu）＝同一稀释度三次重复的平
均菌落数×稀释倍数×10
5、计算出每g土壤中细菌的数量： 即用某一培养皿内细菌的菌落数乘以该培养皿接种液 的稀释倍数即得。
将已灼烧过的接种环伸入外侧的菌种试管内。先冷却，而 后再用环沾取一定量的菌苔，将沾有菌苔的接种环抽出试 管。 迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部， 轻轻向上划线（直线或曲线）。 接好种的斜面试管口再次过火焰，棉塞底部过火焰后立即 塞入试管内。 将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼， 使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，使菌体爆 溅，造成污染。 放下环后，再将棉塞旋紧，在试管斜面上距试管口2～ 3cm处贴上标签。 280C恒温培养。
（3）穿刺接种（1支试管/人）
使用牛肉膏蛋白胨半固体培养基。用接种针从平皿上挑取 细菌单菌落，接入半固体培养基。
用接种针经火焰灭菌后，沾取少量菌种，垂直地穿入试管 固体培养基中心至底部，然后沿着原接种线将针拔出，要 做到手稳、动作轻巧迅速，最后塞上棉塞。再将接种针上 残留的菌体在火焰上烧掉。 在试管斜面上距胞。统计菌落数，根据其
稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。 为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已趋向使 用菌落形成单位(cfu)，而不以绝对菌落数来表示样品的活 菌含量。
三、实验材料
样品：取土 试剂和仪器： 无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、记号 笔、接种环、接种针、酒精灯、标签纸、水浴锅 2人/组：
微生物学实验七——
平板菌落计数与接种
一、目的要求 二、实验原理 三、实验材料 四、实验过程 五、实验任务 六、思考题
一、目的要求
学习平板菌落计数的基本原理和方法
练习微生物接种和培养的基本技术，掌握无
菌操作技术
二、实验原理
将待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成 单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养， 由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单
稀释平板计数用：6只平皿、2根三角玻棒、2支装9ml无 菌水的试管、 4根无菌吸管、牛肉膏培养基；
接种用： 2支液体牛肉膏蛋白胨培养基、2支半固体牛 肉膏蛋白胨培养基、2支黄豆饼粉固体斜面培养基。
四、实验过程
（一）平板菌落计数 （二）微生物的接种
（一）稀释平板菌落计数
1、 编号与稀释: 每组取无菌平皿6只，一个稀释度做3只。标明10－3 和10－4各3只。
图－1
菌液逐级稀释过程示意图
（二）微生物的接种
接种方法： 常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、 试管深层固体培养基的穿刺接种法。
接种工具：
常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接
种铲或接种锄、玻璃涂棒等。
（1）斜面接种法（1支试管/人）
使用黄豆饼粉斜面培养基，用接种环从平皿上挑取放线菌 或霉菌单菌落。