琼脂糖凝胶电泳-完整整理版31页PPT
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实验六PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测PPT课件
实验目的
• 1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理 • 2.学会琼脂糖凝胶的制作和进行电泳的方法
第1页/共12页
实验原理
琼脂糖是一种线性多糖聚合物，天然聚合长链状分子， 在沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径 的大小取决于琼脂糖的浓度，浓度越高，孔隙越小，其分 辨能力就越强。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效 应和分子筛效应。
第4页/共12页
2. DNA分子进行染色的原理（以溴化乙锭为例）
观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分 子。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从 负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌 入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物，这种络合物在紫外光下发射的 荧光要比单纯的DNA分子要强的多，便于DNA的检测。
感谢您的观看！
第12页/共12页
第2页/共12页
实验原理
（1）电荷效应 DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在
电泳时向阳极移动。
第3页/共12页
（2）分子筛效益 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度主要取决
于分子筛效益，即DNA分子本身的大小和构象（共价闭环 DNA>线状DNA>开环DNA），而且其迁移速度与其相对分子 质量的对数值成反比，所以不用相对分子质量的DNA分子可 以在琼脂糖凝胶电泳中分离。
第6页/共12页
实验步骤
琼脂糖凝胶的配制
1g琼脂糖
100mlTBE缓冲液
5µl GoldView
Hale Waihona Puke 冷却到60℃第7页/共12页
• 1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理 • 2.学会琼脂糖凝胶的制作和进行电泳的方法
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实验原理
琼脂糖是一种线性多糖聚合物，天然聚合长链状分子， 在沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径 的大小取决于琼脂糖的浓度，浓度越高，孔隙越小，其分 辨能力就越强。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效 应和分子筛效应。
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2. DNA分子进行染色的原理（以溴化乙锭为例）
观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分 子。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从 负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌 入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物，这种络合物在紫外光下发射的 荧光要比单纯的DNA分子要强的多，便于DNA的检测。
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实验原理
（1）电荷效应 DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在
电泳时向阳极移动。
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（2）分子筛效益 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度主要取决
于分子筛效益，即DNA分子本身的大小和构象（共价闭环 DNA>线状DNA>开环DNA），而且其迁移速度与其相对分子 质量的对数值成反比，所以不用相对分子质量的DNA分子可 以在琼脂糖凝胶电泳中分离。
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实验步骤
琼脂糖凝胶的配制
1g琼脂糖
100mlTBE缓冲液
5µl GoldView
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实验三琼脂糖凝胶电泳ppt课件
2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6 mm，插 入适当的梳子，在室温下冷却凝固。
3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电 泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。
（二）点样
用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉 入点样孔下部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。 6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，
一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复
熔化会降低分辨效率，建议时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？ 4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？ 5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？
注意：如何判断单酶切是否完全？ 如何判断双酶切是否完全？
质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。 质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒 连在了一起）。 同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱 由于DNA Marker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！
不同波长的紫外光
短波紫外光：254nm 中波紫外光：302nm 长波紫外光：365nm
1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？
GoldViewI GoldViewII
3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电 泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。
（二）点样
用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉 入点样孔下部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。 6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，
一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复
熔化会降低分辨效率，建议时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？ 4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？ 5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？
注意：如何判断单酶切是否完全？ 如何判断双酶切是否完全？
质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。 质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒 连在了一起）。 同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱 由于DNA Marker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！
不同波长的紫外光
短波紫外光：254nm 中波紫外光：302nm 长波紫外光：365nm
1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？
GoldViewI GoldViewII
DNA琼脂糖凝胶电泳(课堂PPT)
铺胶
凝胶凝固后取出梳子
加缓冲液
准备样品
点样
电泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照相
对琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片段的有效性 的再认识
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DNA 为多元酸，在中性或弱碱性缓冲 液中带负电荷而向阳极泳动 由于不同 DNA 分子在同一凝胶中迁移速率不一样， 电泳一段时间后可将其分开。
紫外灯下观察照相凝胶冷却至凝胶冷却至5050cc加加ebeb至终浓度至终浓度05gml05gml20对琼脂糖凝胶电泳分离对琼脂糖凝胶电泳分离dnadna片段的有效性片段的有效性的再认识的再认识21dnadna为多元酸为多元酸在中性或弱碱性缓冲在中性或弱碱性缓冲液中带负电荷而向阳极泳动液中带负电荷而向阳极泳动由于不同由于不同dnadna分子在同一凝胶中迁移速率不一样分子在同一凝胶中迁移速率不一样电泳一段时间后可将其分开电泳一段时间后可将其分开
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结果
电泳后在日光下(LIGHTBLUE Dye 染色)或在紫外 灯下(溴化乙锭染色)切取含“ 单一” 目的DNA 分 子的胶条并称重，用小量胶回收试剂盒回DNA。
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25
谢谢观看
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电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相
溶胶
准备胶槽
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
状DNA>开环DNA
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（%） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
琼脂糖凝胶电泳 ppt课件
• 有热可逆性
• 机械强度差，易破碎，浓度 不能太低。
• 易被细菌污染，不易保存， 临用前配制。
• 琼脂糖支持层上的区带易于 扩散，电泳后必须立即固定 染色。
• 与PAGE相比，分子筛作用小， 区带少。
9
ppt课件
琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。
2) 分子大小相近的DNA带不 增加电泳时间，核准正确的凝胶
易分辨
浓度
DNA带缺失 3) DNA 变性
电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) DNA链巨大，常规凝胶电泳 在脉冲凝胶电泳上分析 不合适
31
注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
11
ppt课件
琼脂糖凝胶缓冲液
电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后 在冰上冷却5分钟
不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适
电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃； 经常更换电泳缓冲液
• 机械强度差，易破碎，浓度 不能太低。
• 易被细菌污染，不易保存， 临用前配制。
• 琼脂糖支持层上的区带易于 扩散，电泳后必须立即固定 染色。
• 与PAGE相比，分子筛作用小， 区带少。
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琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。
2) 分子大小相近的DNA带不 增加电泳时间，核准正确的凝胶
易分辨
浓度
DNA带缺失 3) DNA 变性
电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) DNA链巨大，常规凝胶电泳 在脉冲凝胶电泳上分析 不合适
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注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
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ppt课件
琼脂糖凝胶缓冲液
电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后 在冰上冷却5分钟
不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适
电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃； 经常更换电泳缓冲液
DNA的琼脂糖凝胶电泳分析ppt课件
❖ 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘 效应 ，中间电场比较均匀 ；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电 ห้องสมุดไป่ตู้孔内 ；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调 高电压。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
❖ 2、 50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱 （即三羟甲基氨基甲烷， Tris为弱碱，在室 温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理 论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到 9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一 般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得 该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris的pKa的影响 ）， ，加H2O800ml，待 完全溶解后，加57.1ml冰乙酸， 100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定 容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE 电泳缓冲液。
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘 效应 ，中间电场比较均匀 ；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电 ห้องสมุดไป่ตู้孔内 ；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调 高电压。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
❖ 2、 50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱 （即三羟甲基氨基甲烷， Tris为弱碱，在室 温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理 论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到 9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一 般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得 该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris的pKa的影响 ）， ，加H2O800ml，待 完全溶解后，加57.1ml冰乙酸， 100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定 容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE 电泳缓冲液。
实验琼脂糖凝胶电泳的原理与方法 PPT
六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
按电泳法分:
按超速离心法分:
乳糜微粒(CM)
乳糜微粒CM ( < 0、96 )
-脂蛋白 (-位) 极低密度脂蛋白VLDL(0、961、006)
前-脂蛋白(2-位) 低密度脂蛋白LDL (1、0191、063) -脂蛋白 (1-位) 高密度脂蛋白HDL(1、0631、21)
进行印迹转移电泳时,要注意缓冲液得离子强度要低,pH要远 离pI,使蛋白质带有较多电荷,一般用稳定性较好得Tris-缓冲体 系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高电压或 电流可以提高转移速度,但亦会增加热效应,故电压或电流不可过 高。
五、交变脉冲电场凝胶电泳
一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb得DNA。 这就是因为在琼脂糖凝胶中,DNA分子得有效直径超 过凝胶孔径时,在电场作用下,迫使DNA变形挤过筛孔, 而沿着泳动方向伸直,因而分子大小对迁移率影响不 大。如此时改变电场方向,则DNA分子必须改变其构 象,沿新得泳动方向伸直,而转向时间与DNA分子大小 关系极为密切。
D-半乳糖
3,6-脱水-L-半乳糖
琼脂糖链依分子内与分子间氢键及其它力得作 用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝 胶。
冷却
松散,随机地,盘绕地琼脂糖链
双螺旋结构区域与线性链相链接
淬火
溶胶状态
初级胶
最终得凝胶结构
琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下: (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事
按支持物得装置形式不同,区带电泳可为: ➢平板式电泳,支持物水平放置,就是最常用得 电泳方式; ➢垂直板式电泳,聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直 板式电泳; ➢垂直柱式电泳,聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即 属于此类; ➢连续液动电泳,首先应用于纸电泳,将滤纸垂 直竖立,两边各放一电极,溶液自顶端向下流, 与电泳方向垂直。
琼脂糖凝胶电泳ppt课件
5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
精选ppt
3
二、仪器设备及材料
1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、 胶床和梳子三部分组成。
2、稳压电泳仪：电压可变范围0～300～600V， 电流可变范围0～250～500mA。
3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm 3个 波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色 有机玻璃防护板。
① 称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE； ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB
0.5μg/ml，并轻轻混匀。
2、胶床准备：
①取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭 的两端贴上胶布或胶带纸，形成约5～8mm的挡墙。 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端 和床面有1mm的间隙。 ③将胶床放在调整好的水平台上。
10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带； ②摄影记录； ③凝胶成像分析系统处理。
精选ppt
11
五、注意事项：
1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定， 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 2、用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免 灌胶时有胶液漏出。
⑷ DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范 围内是分子质量的函数，分子质量越大，移 动越缓慢。因此，利用琼脂糖凝胶电泳相对 于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相 对分子质量。
精选ppt
2
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA分子大小（kb）
精选ppt
3
二、仪器设备及材料
1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、 胶床和梳子三部分组成。
2、稳压电泳仪：电压可变范围0～300～600V， 电流可变范围0～250～500mA。
3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm 3个 波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色 有机玻璃防护板。
① 称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE； ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB
0.5μg/ml，并轻轻混匀。
2、胶床准备：
①取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭 的两端贴上胶布或胶带纸，形成约5～8mm的挡墙。 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端 和床面有1mm的间隙。 ③将胶床放在调整好的水平台上。
10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带； ②摄影记录； ③凝胶成像分析系统处理。
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五、注意事项：
1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定， 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 2、用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免 灌胶时有胶液漏出。
⑷ DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范 围内是分子质量的函数，分子质量越大，移 动越缓慢。因此，利用琼脂糖凝胶电泳相对 于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相 对分子质量。
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琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA分子大小（kb）
琼脂糖凝胶电泳试验课件
0.3 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 5~60 ( kb) 0.8~10 0.5~7 0.4~6 0.2~4 0.1~3 100~2000 ( bp) 80~500 60~400 40~200 25~150 6~100
PAG
3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0
不同（空间） 不同（空间）类型核酸的凝胶电泳：
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。 传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间 进行缓冲液循环，并经常更新TAE。
缓冲液的离子强度 离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般 离子强度 在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导 电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。 缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样 值 品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带 负电荷，向正极泳动。 在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环 DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温 度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。
2）凝胶孔径大小 ）
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电 泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的 分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段。
凝胶
琼脂糖
胶浓度（ ） 线状DNA分子的有效分 胶浓度（%） 线状 分子的有效分 离范围
三、实验原理
概言之：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向
正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异， 对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳 时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射 下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng左右 的DNA）。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约 200bp~50kb。
PAG
3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0
不同（空间） 不同（空间）类型核酸的凝胶电泳：
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。 传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间 进行缓冲液循环，并经常更新TAE。
缓冲液的离子强度 离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般 离子强度 在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导 电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。 缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样 值 品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带 负电荷，向正极泳动。 在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环 DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温 度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。
2）凝胶孔径大小 ）
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电 泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的 分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段。
凝胶
琼脂糖
胶浓度（ ） 线状DNA分子的有效分 胶浓度（%） 线状 分子的有效分 离范围
三、实验原理
概言之：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向
正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异， 对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳 时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射 下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng左右 的DNA）。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约 200bp~50kb。
实验二 琼脂糖凝胶电泳PPT课件
实验二
琼脂糖凝胶电泳的制备 及核酸检测
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 1学
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳一 般分为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界面电泳 不需支持物，这类电泳目前已很少使用;而区带电泳则 需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、 醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶 -G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶 电泳其优点主要在于操作简单、快速、灵敏。
Tris 108g ，硼酸 55g ， EDTA.2H2O 7.44g,
加蒸馏水定容至1000ml ）
EB：5 µl / 100 ml TBE
电泳样品：标准分子量核酸（DL2000）
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 9学
四. 操作步骤
（1）制胶（以20 mL为例）
准备： 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 7学
2．溴化乙锭（EB）：致癌剂，操作时应戴手套，尽
量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚
蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯青（
xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝
少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
泳槽中。
精选ppt
2010
分 子实 生验
物 10 学
（2）点样：用微量移液器取1－2µl载样液，和5 µl质粒混匀 ， 加入点样孔。
（3）电泳：打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100－ 120 V), 可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约25分钟 即可观察结果。
琼脂糖凝胶电泳的制备 及核酸检测
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分 子实 生验
物 1学
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳一 般分为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界面电泳 不需支持物，这类电泳目前已很少使用;而区带电泳则 需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、 醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶 -G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶 电泳其优点主要在于操作简单、快速、灵敏。
Tris 108g ，硼酸 55g ， EDTA.2H2O 7.44g,
加蒸馏水定容至1000ml ）
EB：5 µl / 100 ml TBE
电泳样品：标准分子量核酸（DL2000）
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物 9学
四. 操作步骤
（1）制胶（以20 mL为例）
准备： 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，
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物 7学
2．溴化乙锭（EB）：致癌剂，操作时应戴手套，尽
量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚
蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯青（
xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝
少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
泳槽中。
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物 10 学
（2）点样：用微量移液器取1－2µl载样液，和5 µl质粒混匀 ， 加入点样孔。
（3）电泳：打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100－ 120 V), 可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约25分钟 即可观察结果。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物ppt课件
6．加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无 水乙醇!）,12,000 rpm 离心1分钟,弃掉废液。
7．加入500μl漂洗液WB 12,000 rpm 离心1分钟,弃 掉废液。
8．将吸附柱AC放回空收集管中,12,000 rpm离心2 分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制 下游反应。
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实 验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观 察，可检测到10 ng的DNA），且检测的范围 很广。
4
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解， 45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决 定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用 下向正极泳动。DNA分子的迁移速度与相对分子质 量的对数成反比。
的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml 电泳缓冲液（1×TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终 浓度为0.5 g/ml)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上， 检查有无气泡。
16
6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝 固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将 凝胶放入电泳槽中。
实验二 琼脂糖凝 胶电泳检测PCR产物
1
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
2
实验目的
了解琼脂糖凝胶电泳的原理 掌握琼脂糖凝胶的制和纯化DNA片段最常用的技 术。根据制备凝胶的材料，分为琼脂糖电泳 和聚丙烯酰胺电泳。
28
此外在琼脂糖凝胶电泳中其它注意事项还有：
1.）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观 察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降。
7．加入500μl漂洗液WB 12,000 rpm 离心1分钟,弃 掉废液。
8．将吸附柱AC放回空收集管中,12,000 rpm离心2 分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制 下游反应。
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实 验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观 察，可检测到10 ng的DNA），且检测的范围 很广。
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琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解， 45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决 定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用 下向正极泳动。DNA分子的迁移速度与相对分子质 量的对数成反比。
的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml 电泳缓冲液（1×TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终 浓度为0.5 g/ml)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上， 检查有无气泡。
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6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝 固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将 凝胶放入电泳槽中。
实验二 琼脂糖凝 胶电泳检测PCR产物
1
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实验目的
了解琼脂糖凝胶电泳的原理 掌握琼脂糖凝胶的制和纯化DNA片段最常用的技 术。根据制备凝胶的材料，分为琼脂糖电泳 和聚丙烯酰胺电泳。
28
此外在琼脂糖凝胶电泳中其它注意事项还有：
1.）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观 察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降。
琼脂糖凝胶电泳注意事项ppt正式完整版
二、点样电泳
• 1.96孔塑料板要干净，loading要点均匀， 控制在1~2ul的量，并做好对应标记。
• 2.加样时，枪头要上紧，吸样均一准确， 排液时吸头不要有残留。
• 3.点完样后及时盖上胶垫，注意不要盖反。 • 4.点电泳前最好检查待用胶是否合格；点
电泳时要对准胶孔，尽量点完所有的样。 • 5.点完样勿忘点marker并摆正胶位，电泳
琼脂糖凝胶电泳注意事项
☺什么是电泳？
带电颗粒在电场作用下，向着 与其电性相反的电极移动，称 为电泳。 生物大分子如蛋白 质,核酸,多糖等大多都有阳离 子和阴离子基团,称为两性离 子在电场中,带电颗粒向正极 或负极迁移,迁移的方向取决 于它们带电的符号。
☺电泳有几类？
按分离原理的不同，电泳分为4类: 移动界面电泳 区带电泳 等电聚焦电泳 等速电泳
仪正负极不要插反，电泳槽的盖子要盖紧。
三、EB染色
• 1.切胶要准，取胶要稳，泡胶要慎， 避免EB溅起。
• 2.碰到EB的手套要及时丢弃。 • 3.EB液要适时跟换，盘子要清洗。 • 4.抹布要严格区分，不可交叉使用。
四、Tanon Tanon-2500 数码凝 胶图像分析仪的使用
• 1.使用前要注意清洁，以免影响胶图的 清晰度。
☺琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、 鉴定DNA、RNA分子混合物的方法， 以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分 子在泳动时的电荷效应和分子筛效应， 达到分离混合物的目的。
☺琼脂糖凝胶电泳的操作
操作步骤 电子称的使用，要时刻注意保持电子称的精确性，保持清洁，根据不同的浓度的胶称琼脂糖。
• 2.照胶时尽量减少开紫外灯的时间。 • 3.拍照时先关摄像头再关紫外灯，不可
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