免疫组化原理和步骤
免疫组化的原理
免疫组化的原理
免疫组化是一种利用抗体与其特异性抗原结合的反应来检测或定位特定分子的方法。
它主要基于抗体的高度特异性与高亲和力，能够识别并结合到抗原上。
免疫组化的过程一般包括固定组织、抗原还原、孵育抗体、洗涤、孵育二次抗体和检测。
具体步骤如下：
1. 固定组织：将待检测的生物组织固定在载玻片上，通常使用形式固定剂或冷冻剂进行固定。
2. 抗原还原：对固定组织进行抗原还原处理，以破坏抗原与抗体结合时的形态学阻滞并使抗原更易于与抗体结合。
3. 孵育抗体：将含有特异性抗体的抗体溶液加到载玻片上的组织切片上，允许其与目标抗原结合。
此时，如果组织中存在目标抗原，抗体就会与其结合形成免疫复合物。
4. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的抗体，减少干扰性信号的产生。
洗涤通常使用磷缓冲盐溶液或其他缓冲溶液进行多次冲洗。
5. 孵育二次抗体：加入标记有酶、荧光物质或放射性同位素等的二抗溶液，使其与已结合的抗原-一抗复合物发生反应。
二次抗体通常是对多种一抗的特异性抗体。
6. 检测：使用相应的技术，如酶标记法、荧光标记法或放射性
探测等，检测二次抗体与抗原-一抗复合物的结合情况。
通过信号的产生和可视化，可以确定抗原的存在位置以及其表达程度。
总的来说，免疫组化是一种通过利用抗体与抗原间的特异性反应，实现对目标抗原的检测和定位的方法。
其原理主要是通过抗原-抗体的结合来实现对特定分子的识别和鉴定。
免疫组化的原理及试验步骤
免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。
2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。
免疫组化方法和步骤
免疫组化方法和步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平，以及研究细胞或组织中的蛋白质定位和相互作用。
免疫组化方法涉及一系列步骤，包括样本固定、抗原检测与标记、抗体与抗原结合、可视化和结果分析。
以下是免疫组化方法及步骤的详细介绍。
一、样本固定免疫组化实验的第一步是固定样本，通常使用福尔马林或乙醛等化学物质进行固定。
固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，并防止蛋白质的降解。
固定过程中，需要将样本固定在载玻片或膜上，以便之后的实验操作。
可使用刷子或杆状工具将样本涂布在载玻片上，或者使用离心管和离心机将细胞沉淀在载膜上。
二、抗原检测与标记样本固定后，下一步是检测和标记目标抗原。
有两种常用的方法供选择：直接法和间接法。
1.直接法：直接法在一个步骤中同时检测和标记抗原。
直接法可以快速获得结果，但受到抗体的特异性和标记物的可用性的限制。
2.间接法：间接法需要两个步骤，先使用特异性初级抗体与抗原结合，再使用标记有染料或标记物的二级抗体与初级抗体结合。
间接法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于多重标记和检测多个蛋白质。
三、抗体与抗原结合蛋白质和抗体结合是免疫组化的关键步骤。
待检样本上固定的抗原与抗体结合可以直接检测或通过信号增强来检测。
抗体与抗原结合的时间和温度取决于抗体的亲和力和特异性，通常需要在较低的温度下进行孵育，并在孵育过程中提供充分的抗体与抗原接触时间。
四、可视化可视化是将抗原抗体结合信号转化为可见光信号的过程。
最常见的可视化方法之一是使用酶标测定法。
酶标测定法将酶（如辣根过氧化物酶）结合到标记物（如荧光素黄标记的二级抗体）上，然后通过加入底物（如DAB）产生可见的色素反应。
除了酶标测定法外，还有其他可视化方法，如免疫荧光技术和原位杂交。
免疫荧光技术使用标记的荧光染料标记一级或二级抗体，然后通过荧光显微镜观察样本。
原位杂交使用与DNA序列互补的标记探针识别特定的DNA序列，并通过可视化标记（如荧光）来检测靶标。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于组织学和细胞学研究中的实验方法，主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中的分布和表达水平。
它结合了免疫学原理和组织学技术，通过使用特异性的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。
免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合，然后使用染色技术来显示抗原的位置。
该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。
第一步：抗原-抗体反应免疫组化的第一步是选择合适的抗体，通过与目标蛋白质的特异性结合来形成抗原-抗体复合物。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性，只能结合到特定的抗原上。
多克隆抗体具有高度敏感性，可以结合多个位点，从而实现信号放大。
通常，为了提高抗原的可检测性，需要对组织样本进行抗原修复处理。
这可以通过热处理（如蒸汽加热、微波加热）或酶切处理来实现。
修复可以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联，增加抗体的渗透性和可结合性。
当抗原-抗体反应发生时，可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复合物。
例如，可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来与二抗结合。
该反应可形成稳定的抗体-酶复合物。
第二步：信号放大由于抗原-抗体复合物的信号很弱，通常需要进行信号放大以便更好地检测到目标蛋白质。
放大信号的方法有很多种，其中最常用的是酶免疫标记联合酶放大技术。
酶免疫标记是通过将抗体与酶结合，使其能够催化特定的化学反应来产生荧光、色素或光学信号。
常用的酶免疫标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
这些酶能够催化荧光素、二苯基胺、硝基蓝等底物的氧化还原反应，从而产生可视化的信号。
酶放大技术常用的方法包括：免疫酶化学法（如DAB法）、免疫荧光法和免疫酶学荧光混合法等。
这些方法可通过将底物转化为可见的色素或荧光信号来标记抗原-抗体复合物，从而实现目标蛋白质的检测和定位。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用于检测组织中特定蛋白质表达的技术。
它在病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域具有广泛的应用。
本文将介绍免疫组化的步骤及原理，帮助读者更好地理解和应用这一技术。
首先，进行免疫组化实验需要准备组织切片。
通常情况下，组织切片是从已固定的组织样本中制备的。
固定的方法可以选择福尔马林固定、乙醇固定等，不同的固定方法会对后续实验产生影响，因此需要根据实验要求进行选择。
接下来，进行抗原修复。
抗原修复是为了使组织样本中的蛋白质抗原重新暴露出来，以便后续的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括热处理、酶消化等，选择合适的抗原修复方法可以提高实验的成功率和结果的准确性。
然后，进行蛋白质的非特异性结合抑制。
在进行免疫组化实验之前，需要阻断组织中非特异性的蛋白质结合，以减少假阳性结果的产生。
一般可以使用牛血清蛋白（BSA）或者其他蛋白质来进行阻断。
接着，进行一抗的孵育。
选择合适的一抗对于免疫组化实验的成功至关重要。
一抗的选择应该考虑抗体的特异性、敏感性和稳定性等因素。
孵育时间和温度也需要根据实验要求进行调整。
随后，进行二抗的孵育。
二抗通常是与荧光素或者酶结合的抗体，用于检测一抗的结合情况。
选择合适的二抗可以提高实验的信号强度和特异性。
最后，进行显色或者荧光检测。
根据实验要求，可以选择酶标法或者免疫荧光法进行信号的检测。
在显色或者荧光检测之后，可以对组织样本进行染色和镜检，最终得到免疫组化实验的结果。
免疫组化的原理是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过显色或者荧光检测来观察组织中特定蛋白质的表达情况。
通过对组织样本的处理和抗体的选择，可以实现对蛋白质表达的定量和定位分析。
总之，免疫组化是一种重要的实验技术，它在病理诊断和生物医学研究中具有广泛的应用前景。
掌握免疫组化的步骤及原理，有助于提高实验的成功率和结果的准确性，为相关领域的研究和临床诊断提供有力支持。
免疫组化原理及步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体与抗原特异性结合的原理来检测组织中特定蛋白质的方法。
它在病理诊断、生物医学研究和药物研发等领域具有广泛的应用价值。
本文将介绍免疫组化的原理及实验步骤，希望能对相关领域的研究者和实验人员有所帮助。
免疫组化的原理主要基于抗体与抗原的特异性结合。
在免疫组化实验中，首先需要选择与目标蛋白特异性结合的一抗和二抗。
一抗与目标蛋白结合后，通过二抗与一抗结合，形成复合物，再通过酶标记或荧光标记的二抗来检测目标蛋白的表达情况。
免疫组化的关键在于选择合适的抗体，确保其对目标蛋白的特异性结合，从而实现对目标蛋白的定位和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括组织标本的处理、抗原修复、蛋白质阻断、抗体染色、显色反应和显微镜观察等。
首先，组织标本需要进行脱水、蜡包埋和切片等处理，以保证标本的完整性和稳定性。
接下来是抗原修复步骤，通过高温、酶解或酸碱处理等方法，使组织中的蛋白质发生构象变化，从而有利于抗体的结合。
然后进行蛋白质阻断，通过使用牛血清白蛋白（BSA）或牛血清等，阻断非特异性结合位点，减少背景信号的干扰。
随后是抗体染色，将一抗和二抗依次加入标本中，使其与目标蛋白特异性结合。
再进行显色反应，根据酶标记或荧光标记的二抗，观察目标蛋白的表达情况。
最后通过显微镜观察，对标本进行定量分析和图像获取。
在进行免疫组化实验时，需要注意一些关键问题。
首先是抗原修复的选择，不同的抗原修复方法对不同类型的组织标本有不同的影响，需要根据实际情况进行选择。
其次是抗体的选择，需要确保抗体的特异性和敏感性，避免出现假阳性或假阴性结果。
此外，实验过程中需要严格控制各个步骤的时间和温度，避免影响实验结果的准确性。
最后，在观察和分析实验结果时，需要结合相关的对照组进行比较，以确保实验结果的可靠性。
总之，免疫组化作为一种重要的实验方法，在病理诊断和生物医学研究中有着广泛的应用前景。
免疫组化原理及流程介绍
免疫组化原理及流程介绍免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用免疫反应来检测组织内特定抗原的技术。
它通过将特定的抗体与要检测的组织染色连接，从而实现对该抗原的可视化检测和定位。
免疫组化广泛应用于病理学领域，可以用于诊断和鉴定疾病，研究疾病发生机制以及评估治疗效果。
下面将介绍免疫组化的工作原理和流程。
免疫组化的工作原理可以分为两个步骤：抗原-抗体反应和可视化。
抗原-抗体反应是指将固定的组织样本与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
这种特异性的结合是由于抗原与抗体之间具有互补的结构，类似于锁与钥的关系。
一旦抗原-抗体结合发生，可以通过一系列的化学反应来可视化这种结合，从而观察到抗原的位置和表达水平。
免疫组化的流程一般可以分为样本制备、抗原修复、抗体染色和结果分析四个主要步骤。
样本制备：首先，需要取得要检测的组织样本。
这些组织样本可以是切片、细胞涂片或者细胞悬液。
然后，将样本固定在载玻片上，以保持组织结构的完整性。
抗原修复：组织样本的形态学上常常被固定剂和时间的影响而改变，导致抗原的结构发生损坏。
为了修复抗原使其可被抗体识别，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括高压蒸汽处理（例如蒸气胶片锅或蒸箱）和化学处理（例如酶解或化学溶解）。
抗体染色：通过将特异性抗体与要检测的抗原结合，可实现抗原-抗体复合物的形成。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以使用直接染色或间接染色技术。
直接染色是将抗原和抗体直接连接，通过抗原-抗体复合物可视化抗原的表达水平。
间接染色是先与一种包含特异性抗体的二抗结合，再利用第二抗体与标记物（通常是酶或荧光标记）结合，从而放大信号。
结果分析：通过显微镜观察染色结果，评估抗原的表达情况和分布。
常用的评估方法包括定性评估和定量评估。
定性评估是通过观察染色强度和细胞定位来判断抗原的表达水平和细胞类型。
定量评估则是通过计算染色阳性的细胞数量或染色强度来定量化抗原的表达水平。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项.
免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤实验原理：抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。
先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。
由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。
实验步骤：（一）脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1、组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟。
2、无水乙醇中浸泡五分钟。
3、95%乙醇中浸泡五分钟。
4、75%乙醇中浸泡五分钟。
（二）抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：1、抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m柠檬酸钠缓冲溶液（ph6.0）。
盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）沸热修复电炉或水浴锅加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
（3）微波炉加热在微波炉里加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原Bcl-2、ax、AR、PR、C-fos、x-jum、z-kit、c-myc、E-cadherin。
ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshock、Protein、HPV、Ki-67、MDMZ、P53、P34、P15、P-glycoprotein、PKC、PCNA、ras、Rb等2、酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
免疫组化的原理和步骤
免疫组化的原理和步骤免疫组化是一种常用的实验方法，它利用特异性抗体与免疫原之间的相互作用，通过对细胞或组织中特定抗原的定位和检测，以揭示细胞或组织中特定分子的存在和分布情况。
在免疫组化中，主要包括抗原修复、特异性抗体结合、信号放大、染色和显微镜观察等步骤。
第一步：抗原修复抗原修复是为了提高抗原的可见性，常见的修复方法有热原修复和化学原修复。
热原修复是将组织样本在热压下加热一段时间，以恢复被固定、变性或交联的抗原的活性。
化学原修复是使用化学试剂改变组织中蛋白分子的结构，使其易于抗体结合。
抗原修复可以显著提高抗原的可见性，有利于后续的免疫组化实验。
第二步：特异性抗体结合特异性抗体是免疫组化实验的关键。
在这一步中，需要选择与目标抗原高度特异性结合的抗体。
常用的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，可以通过直接标记抗体或者间接标记抗体的方式进行实验。
对于直接标记抗体，抗原与荧光物质、酶或金颗粒等直接结合，可通过荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜直接观察抗原的分布和定位。
对于间接标记抗体，首先给定的抗原与一种特异性的一抗反应，接着加入与一抗结合的二抗，最后加入标记有荧光物质、酶或金颗粒等的三抗，通过标记物的发光或染色来观察抗原的分布和定位。
第三步：信号放大为了增加信号的灵敏度和准确性，常常需要对抗原-抗体结合进行信号放大，最常用的方法是酶标方法。
在酶标法中，将特异性抗体与带有酶标记的二抗结合，酶标记的二抗与染色剂的底物作用时，能生成可见的颜色或发光信号，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的酶标方法有还原粉末树脂染色法（如DAB法）和荧光素酶法等。
第四步：染色染色是免疫组化实验的关键步骤之一、通过染色方法可以使未染色的组织或细胞变得可见，从而明确表达抗原的位置和数量。
常用的染色方法有光学显微镜下的暴露荧光显微镜和电子显微镜。
第五步：显微镜观察最后一步是通过显微镜来观察和分析免疫组化结果。
光学显微镜和电子显微镜是常用的观察工具。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理一、前言免疫组化是一种常用的实验技术，它可以用来检测组织或细胞中的蛋白质表达及其分布情况。
本文将详细介绍免疫组化的步骤及原理。
二、免疫组化的步骤1. 取材首先需要取得需要检测的样本，可以是活体组织或固定后的切片。
对于固定后的切片，需要进行脱水、透明化和包埋等处理。
2. 制备切片将取得的样本制备成厚度为4-6μm的切片，并将其放置在载玻片上。
然后进行脱蜡和再水化处理，以便后续步骤的顺利进行。
3. 抗原修复抗原修复是为了恢复经过固定和包埋处理后被破坏或掩盖了的抗原性位点，使其能够被抗体识别。
抗原修复方法有多种，如高温加压法、微波辅助法等。
4. 阻断非特异性结合位点在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点以减少假阳性结果。
常用的方法是使用牛血清白蛋白、小鼠IgG等。
5. 抗体孵育将特异性的一抗加入载玻片上，在恰当的条件下孵育一段时间，使其与靶分子结合。
然后用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
6. 二抗孵育加入与第一抗体来源物种不同的二抗，使其结合到第一抗体上。
通常二抗会标记有荧光素、辣根过氧化物酶等标记物，以便于检测。
7. 洗涤在每个孵育步骤之后都需要进行洗涤，以去除未结合的分子和杂质。
洗涤缓冲液可以是PBS、TBST等。
8. 显色对于标记有辣根过氧化物酶等标记物的二抗，需要使用底物进行显色。
底物包括DAB、VIP等，在加入底物之前需要在载玻片上加入过氧化氢等催化剂。
9. 盖片封装最后将载玻片盖上盖片，并使用透明胶水进行封装。
这样可以保持样本的湿度和防止样本污染。
三、免疫组化的原理免疫组化的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够被免疫系统识别并引起免疫反应的分子，如蛋白质、多肽等。
抗体是由B细胞分泌的一种具有特异性结合能力的分子，可以识别和结合到相应的抗原上。
在进行免疫组化实验时，首先需要选择一种特异性较高的一抗，使其与靶分子结合。
然后加入来源于不同物种的二抗，使其与第一抗体结合。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤免疫组化是一种广泛应用于生命科学领域的技术，可以用来检测和鉴定细胞和组织中特定蛋白分子的存在、定位和表达量。
免疫组化基于免疫学原理，通过使用特异性抗体与待检测分子特异性结合，再通过可视化和定量分析来观察和测定待检测分子的存在和分布情况。
本文将详细介绍免疫组化的原理和步骤。
免疫组化的原理：免疫组化是基于免疫学原理的一种实验方法，其核心原理是特异性抗体与待检测分子的免疫反应。
免疫反应可分为两种类型：直接法和间接法。
1.直接法：直接法是指特异性抗体直接与待检测分子发生免疫反应。
在这种方法中，待检测物与特异性抗体结合后，通过标记在抗体上的标记物来直接检测待检测物的存在。
常用的直接标记物包括酶（如辣根过氧化物酶HRP）、荧光染料（如荧光素同工酶）和放射性同位素（如3H和125I）。
直接法的优点是操作简单，敏感度高，但标记物的选择受限。
2.间接法：间接法是指通过特异性抗体与检测物结合，再加入与抗体结合的二抗发生免疫反应。
间接法的优点是能够使用多种不同的二抗，从而提高了敏感度和特异性。
常用的二抗包括抗IgG的兔抗或小鼠抗。
这些二抗通常是与辣根过氧化物酶结合，并以酶标记物（如DAB）或荧光染料（如荧光素同工酶）来可视化。
免疫组化的步骤：免疫组化实验通常需要经过一系列的步骤，包括固定组织、制备切片、抗原解脱、抗体标记和可视化。
下面是免疫组化的详细步骤：1.组织固定：首先将待检的组织材料使用适当的固定剂进行处理，目的是固定细胞和组织结构，以保持其形态和抗原的保存。
常见的固定剂包括福尔马林、乙酸乙酯、乙醇等。
2.制备组织切片：使用组织切片机将固定的组织切割成薄片，通常厚度为3-5微米。
切片后，可以将切片保存在载玻片上待用。
3.抗原解脱：组织切片上的抗原往往由于固定处理而失去了原有的免疫反应活性，需要进行抗原解脱的处理。
抗原解脱的方法包括酶解法、热解法和酸解法等，可以恢复抗原的免疫反应性。
4.抗体标记：选择适当的特异性抗体，并将其与标记物结合。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理免疫组化是一种用于检测和定位特定细胞组织中特定分子的技术。
它可以帮助我们研究细胞的结构和功能，并在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。
以下是免疫组化的步骤及其原理。
步骤一：标本固定免疫组化的第一步是将待检测组织样本固定在载玻片或其他固定载物上。
常用的固定剂包括福尔马林（formalin）和牛血清白蛋白（BSA）。
固定的目的是保持组织的形态结构并防止其腐解。
步骤二：脱水和去蜡接下来，固定的组织样本通常需要通过一系列酒精浓度逐渐脱水，然后使用组织蜡进行浸泡固化。
蜡浸泡的目的是保护组织细胞结构，并便于切片及后续的免疫标记。
步骤三：抗原暴露在进行免疫组化之前，需要通过抗原暴露步骤使组织样本中的目标分子或抗原暴露出来，便于其和抗体的结合。
这可以通过热处理（如加热松弛），酶解（如胰蛋白酶消化）或抗原修复剂（如热带缓冲液或消化酶）进行。
步骤四：非特异性结合位点的阻断为了阻断非特异性结合位点，需要在进行免疫反应之前进行非特异性抗体预处理。
这可以通过与蛋白质或动物血清结合的非免疫球蛋白（如Bovine Serum Albumin，BSA）或鱼胶（Fish Gelatin）来实现。
这样，可以降低背景信号并提高特异性。
步骤五：抗体结合在免疫组化过程中，使用特异性抗体与待检测的目标分子结合形成免疫复合物。
这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体是由同一B细胞产生的一类抗体，具有高度特异性，并且可以与特定的抗原结合。
多克隆抗体则由多个B细胞产生，可以结合目标分子的多个表位。
步骤六：荧光或酶标记的二抗结合为了检测抗体和目标分子的结合，可以使用荧光染料或酶标记的二抗。
荧光染料（如FITC，Cy3，Cy5等）可以在荧光显微镜下观察到相应的光信号。
酶标记的二抗通常使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）来标记，这些酶可以催化或参与染色反应，并在光镜下呈现颜色。
步骤七：显色和观察显色的方法根据使用的标记物不同而有所不同。
免疫组化过程及原理
免疫组化过程及原理免疫组化，是一种通过特异性抗体和荧光素等探针对组织切片中的分子进行定位和鉴定的技术。
这种技术广泛应用于生物医学研究和医学诊断中。
本文将介绍免疫组化的过程和原理。
一、样品制备样品制备是免疫组化技术的第一步。
样品主要包括组织切片、胞液、细胞培养物等。
制备样本主要方法有固定、切片、脱水等步骤。
在进行免疫组化之前，必须使用固定剂对样本进行固定。
固定剂的选择应根据不同的样品以及需要检测的分子性质而定。
通常，使用含有甲醛或戊二醛的固定剂。
二、抗体选择和标记选择适当的抗体和相应的探针是免疫组化技术的关键。
抗体是能特异性与靶分子结合的蛋白质，可通过季节性生产、杂交瘤融合技术等方法制备。
标记技术有荧光标记、酶标记、金粒子标记等。
取决于使用的抗体和探针类型，所使用的技术将会是不同的。
三、特异性识别将标记好的抗体溶液滴到固定后的组织切片表面，然后进行特异性识别，即特异性抗体与分子特异性结合的过程。
在该步骤中，选定的抗体只与需要检测的分子特异性的表达区域结合。
四、荧光检测使用荧光显微镜检测标记分子特异性抗体对组织切片上分子特异性结合的情况。
在免疫组化的过程中，荧光探针的特异性荧光信号为明显的标记。
荧光显微镜能够捕捉到这些信号，并将它们转化成清晰可见的图像。
通过荧光检测可以确定细胞表达、蛋白质定位、蛋白质互作等。
五、数据记录和结果分析将荧光显微镜的图像记录下来，并通过图像分析软件进行数据处理和结果分析。
对比对照组、干预组与实验组数据，确定显著的差异。
进行加权平均、标准差、方差等数学方法，基于统计学得出可靠的结论。
六、检测标准化免疫组化技术在不同实验室或者不同操作者之间具有高度可变性。
为了在不同的实验室、不同的操作者不同的样品下得出相同的结果，需要标准化免疫组化的流程。
标准化流程包括选择合适的抗体、标准化抗体稀释度、制剂及品质检测，检测标准的制定等。
标准化流程的制定保证了实验之间的准确性和可重复性，提高了免疫组化技术的可靠性。
免疫组化原理及步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化是一种常用于研究细胞和组织中蛋白质的定位、表达及定量的方法。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。
在进行免疫组化实验时，通常需经历如下步骤：1. 取样与制片：从待研究的组织或细胞中取得样本，并将其固定在载玻片或切片上，以便后续的实验处理。
2. 抗原恢复：某些样本经过固定处理后，可能会造成抗原的损失或掩盖。
因此，为了使抗原能更好地被抗体识别，常需要进行抗原恢复的步骤。
一般而言，常用的抗原恢复方法包括加热处理、酶解或化学处理等。
3. 阻断非特异性结合：为了避免非特异性的结合，需使用一些非特异性抗体或蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）来阻断待测抗体结合样本中的非特异性位点。
4. 抗体标记与孵育：选择特异性与待测抗原结合的一抗体，并将其标记上可视化信号或发光染料等。
在将该标记抗体和样本一同孵育的过程中，待测抗原会与一抗体发生特异性结合。
5. 洗涤：通过洗涤步骤，去除与抗体无关的非特异性结合物，以减少背景信号的干扰。
6. 可视化和显色：对于免疫组化实验，最终需要将特异性结合的抗原或抗体定位，并使其可视化。
这可以通过结合染色剂、酶标记或荧光标记等方法实现。
7. 评价与分析：最后，通过显微镜观察和图像分析等手段，对标记结果进行定性或定量的评价与分析。
可以使用计算机软件进行图像处理和定量分析以获取更准确的数据。
总之，免疫组化的原理在于利用抗原与抗体的特异性结合来对蛋白质进行检测与定位。
在实验过程中，需要进行样本取样与制片、抗原恢复、非特异性结合阻断、抗体标记与孵育、洗涤、可视化和显色、评价与分析等一系列步骤。
这些步骤均为确保实验结果的准确性和可靠性所必需的。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理引言免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种用于检测组织样本中特定蛋白质的方法，它结合了免疫学和组织学的原理和技术。
免疫组化在研究和临床诊断中广泛应用，帮助我们了解疾病的发生机制和诊断疾病的标志物。
本文将介绍免疫组化的步骤及其原理。
免疫组化的步骤免疫组化主要包括抗原修复、抗体染色和结果观察三个主要步骤。
下面我们将详细介绍每个步骤的原理和操作流程。
抗原修复抗原修复是免疫组化中的关键步骤之一。
它的主要目的是使组织样本中的抗原蛋白恢复成可检测的状态。
组织样本在经历固定处理后，抗原会发生变性和交联，导致其结构的改变，使其难以与抗体结合。
因此，需要对组织样本进行抗原修复，以使其恢复原有的抗原性。
抗原修复的方法有两种常用的方式：热原修复和酶解原修复。
热原修复使用高温和缓冲液对样本进行处理，恢复抗原的三维结构，使其可用于抗体的结合。
酶解原修复通过使用酶类，如胰蛋白酶、蛋白酶K等，降解组织样本中的蛋白质，使其中的抗原暴露于溶液中，便于抗体的结合。
具体的操作流程如下： 1. 取出已固定的组织样本，将其置于适当的缓冲液中。
2. 对于热原修复，将样本加热至适当的温度（通常为95-100摄氏度），保持一定的时间（通常为15-30分钟）。
3. 对于酶解原修复，将样本加入含有特定酶的缓冲液中，孵育一定的时间（通常为30分钟至1小时）。
4. 护理样本：对于热原修复，将样本冷却至室温；对于酶解原修复，用PBS（磷酸盐缓冲液）或纯净水洗涤样本。
抗体染色抗体染色是免疫组化的核心步骤，通过与特定抗原结合，可以检测出组织样本中的目标蛋白质。
该步骤涉及抗体的选择、检测系统的建立和染色方法的确定。
抗体选择抗体选择是免疫组化中的关键因素之一。
根据研究或临床需求，选择适当的一抗体和二抗体非常重要。
一抗体通常是针对目标抗原的特异性抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
二抗体通常是对一抗体偶联的辅助抗体，可以是标记有多种标签的抗体，如辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
免疫组化原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的分布和表达水平。
它结合了免疫学和组织学的原理，能够在组织切片上定位和检测抗原，并通过染色方法将抗原可视化，从而实现对抗原的定性和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括固定、脱脂、抗原修复、抗体和检测步骤。
下面将详细介绍每个步骤的操作和常用试剂。
1.组织固定：组织固定的目的是保持组织结构完整并固定细胞的抗原。
常用的固定试剂包括10%中性缓冲福尔马林（10% neutral buffered formalin，NBF）和乙醇等。
2.脱脂：脱脂是将组织切片中的脂质去除，以提高抗体对抗原的结合效率。
常用的脱脂试剂包括二甲苯、甲醛和乙醚等。
3.抗原修复：抗原修复是为了使被固定的组织恢复原样，增强抗原的可检测性。
抗原修复的方法包括热处理、酶解法和pH调整等。
常用的抗原修复试剂包括热解剂例如EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液，酶解剂例如胰蛋白酶和蛋白酶K，以及甲酸、盐酸等酸性溶液。
4.抗体：5.检测：检测步骤用于将抗原-抗体复合物可视化。
这通常通过染色方法完成。
常用的染色方法包括免疫酶标记、免疫荧光和免疫金标记等。
免疫组化实验所需的试剂种类繁多，下面列举一些常用的试剂：1. NBF（10% neutral buffered formalin）：用于组织固定，保持组织形态完整。
2.二甲苯：用于脱脂步骤，去除组织中的脂质。
3.甲醛：用于脱脂步骤。
4.乙醚：用于脱脂步骤。
5.EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
6. Tris-EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
7.胰蛋白酶：用于抗原修复的酶解剂。
8.蛋白酶K：用于抗原修复的酶解剂。
9.盐酸：用于抗原修复的酸性溶液。
10.一抗：选择特异性良好的一抗抗体，常用的有多克隆和单克隆抗体。
11.二抗：用于检测一抗结合的抗体，常用的二抗有反兔、反小鼠或反人的多克隆抗体。
免疫组化的原理与操作
肿瘤分类
01
通过检测肿瘤组织中特定抗原的表达，有助于判断肿瘤的性质
和来源，为肿瘤的分类提供依据。
预后评估
02
免疫组化检测肿瘤细胞增殖、侵袭和转移相关的分子标志物，
有助于评估患者的预后和制定治疗方案。
靶向治疗
03
针对特定肿瘤相关抗原的免疫组化检测，有助于发现潜在的靶
点，为靶向治疗提供指导。
在感染性疾病诊断中的应用
病原体检测
通过检测感染组织中特定病原体的抗原或抗体，有助于确诊感染 性疾病的病因。
鉴别诊断
对于临床表现相似的感染性疾病，免疫组化检测有助于鉴别诊断， 为临床治疗提供依据。
流行病学调查
对感染性疾病的免疫组化检测结果进行分析，有助于了解疾病的 流行病学特征和传播途径。
在自身免疫性疾病诊断中的应用
自身抗体检测
控制显色反应的条件，避免背景染色和假阳性结果。
实验后的质量控制
1 2
结果判读
建立标准化的结果判读方法，确保结果的一致性 和可重复性。
室内质控
定期进行室内质控，评估实验的稳定性和可靠性。
3
室间质评
参与实验室间的质评活动，提高实验结果的可靠 性。
05
免疫组化在临床病理诊断中的应用
在肿瘤诊断中的应用
02
抗体选择与实验设计
抗体来源与特性
01
02
03
抗体来源
免疫组化抗体主要来源于 动物免疫系统，如小鼠、 兔、羊等，通过注射抗原 产生特异性抗体。
抗体特性
抗体具有高度的特异性， 能够识别并结合特定的抗 原，用于标记和定位组织 中的目标分子。
抗体纯度
高质量的抗体应具有高纯 度，低交叉反应性和低非 特异性结合，以提高实验 的准确性和可靠性。
免疫组化流程
免疫组化流程
免疫组化是一种生物技术，用于研究一个或多个蛋白质的交互性及它的细胞上的定位，从而探究蛋白质在复杂的细胞环境中的功能及其作用机制。
免疫组化是以抗体作为特异性
捕获识别分子的标记物，以检测某一特定的蛋白质在细胞中的形态分布，其主要分为三个
步骤：样本处理、抗体淬取和检测荧光。
1. 样本处理：由于免疫组化需要在细胞环境下完成实验，所以在处理样品前，先要
将细胞或组织悬浮，再利用活细胞分离技术将其分离出来，以制备出水平固定、正常形态
的细胞阵列。
2.抗体淬取：抗体淬取是查找蛋白质在细胞中的分布的主要步骤，将具有指示特定蛋
白质的特定抗体喷射在分离的细胞上是大多数实验的基本过程，抗体可以通过多种不同的
方法混合到细胞上，例如管接收、块接收和碰撞接收。
3.检测荧光：检测荧光是一种利用荧光探针标记抗体和膜蛋白，在荧光显微镜上观察
膜蛋白的分布情况，字膜上的膜蛋白和脱离细胞膜的膜蛋白也可以由不同颜色的荧光探针
标记，从而确定膜蛋白的分布情况。
以上三个步骤合在一起，就能完成免疫组化实验，从而检测蛋白质在细胞中的空间分布，免疫组化还可以用来分析蛋白质如何在细胞周围的其他分子之间相互作用。
这个实验
技术具有高灵敏度、可重复性强和节省时间等优点，可以大大提高细胞内目标蛋白质的分
析能力，同时为细胞医学研究和更深入地研究细胞功能提供重要的实验证据。
免疫组化的原理和步骤
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的有哪些？免疫组化实验中常用的抗体为单抗体和多抗体。
单抗体是一个B淋巴细胞分泌的抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。
多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物.免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好,且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响,但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法,高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法,免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法.这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素--抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因：指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。
产生的原因有以下几个方面：1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。
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免疫组化原理及步骤
免疫组化操作规程
一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制
1. 0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml ；
1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH 2 PO 4 2·H 2 O ＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B （A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2·H 2 O ：15.6 g in 500 ml ddH 2 O ；
B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O ：71.632 g in 1000 ml dH 2
O ）。
2. Citrate Buffered Saline （0.01 M 柠檬酸缓冲液，
PH6.0 ）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O （A.Citrate acid
（柠檬酸）：10.5 g
加双蒸水至 1000 ml ； B.Citrate sodium （柠檬酸钠）： 29.41 g 加 双蒸水至 1000 ml ）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3% 双氧水和 0.5%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ，再接着 加 120 ul TritonX-100, 并加热一儿，冷却至临用前加 0.4 ml 30 ％ H 2 O 2 。
4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。
5. 含 0.03 ％ H 2 O 2 的 0.05 ％DAB （避光） ：用 20×DAB （1％， 10 mg/ml ）5 ul ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。
6.
一抗、二抗均用 PBS 稀释。
7. Xylene 、梯度 Ethanol （100 ％×2、95％、80％、70％、50％）、 双蒸水、中性树胶（封裱剂）。
8. 苏木精染液：
四、操作步骤
1 、脱蜡、水化
60 ℃× 20 min →Xylene 2 × 10 minut ；es 80% ethanol 2 minutes ； 70% ethanol 2 minutes ； distilled water:5 min ； PBS 洗 3 次×3 min 。
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7) 100% absolute ethanol ：2 ×5 minutes ； 95% ethanol 2 minutes ；
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
8）用封闭通透液浸润切片30 min （RT 避光）。
配法是用预热40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％H 2 O 2 。
9） PBS 溶液洗 3 次×3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
10）切片放入0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0 ）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，再加热约 6 min ×4 次，每次间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
11） PBS 溶液洗 3 次×3 min ；
12）将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈, 在圆圈内组织滴入5% 羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min ；
5、一抗孵育
13）甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250 、500 、1000 ）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。
6、二抗孵育
14）将一抗倒掉并用PBS 洗 5 min ×5 次；
15）用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入
100% absolute ethanol: (1-2) min
37 ℃ 恒温烤箱中30 min （回收）。
16) 用PBS 洗 5 次×5 min ；
7、SP 反应
17) 加入SP 后放入37 度烤箱中30 min。
18) 用PBS 洗 5 次×5 min ；
8、显色
19) 加入DAB(快速滴入，观察染色情况，倒掉染液)，显色时间
控制在约 5 min (3～10 min )，由镜下观察颜色控制时间。
0.05％DAB(避光)(1:20 储备液)：5 ul 20 D×AB ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。
1%DAB 储备液的制:50mgDAB+5ml 0.05 mol/L PBS 充分溶解，-20 ℃保存。
9、复染、脱水、透明、封片
20) 用PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min ；
21) 加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s 后自来水冲洗，
双蒸水洗 5 min ，再用PBS 返蓝 5 min。
22) 脱水：
50% ethanol 1-2 min ，
70% ethanol 1-2 min
95% ethanol 1-2 min ；
95% ethanol 1-2 min ；
100% absolute ethanol: (1-2) min
100% absolute ethanol: (1-2) min ；
23) 透明：Xylene 1 ×(1-2) min →Xylene 2 ×-(21) min
24) 封片：中性树胶。
五、注意事项
1. 苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。
2. DAB 显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显
但背景不太深。
3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。
尤其一抗孵育最好在 4 度过夜。
4. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。
5. 片子着色不均匀的原因如下：
①脱蜡不充分。
可以60 ℃烤20 min ，立即放入新鲜的
xylene1 ；
②水化不全。
应经常配制新鲜的梯度乙醇；
③抗体没混匀。
用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；
④抗体孵育时，切片放倾斜；
⑤抗体孵育后PBS 冲洗不充分。
⑥制片厚薄不均匀等问题。
染片盒不平，切片倾斜。
6. 一抗从 4 ℃拿出后，为什么有人说要37 度复温，目的是什么？
①一方面，防止切片从 4 ℃直接放入PBS 易脱片；② 另一方100% absolute ethanol: (1-2) min
面，使抗原抗体结合更稳定。
一般不需要,但对表达较弱的抗原可能
有用,4 ℃和37 ℃度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运
动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染
色。
7. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？
① 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。
这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；
②一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
③内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
④非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免
疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
⑤DAB 显色时间过长或浓度过高；
⑥PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；
⑦标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。