免疫组化原理和步骤
免疫组化原理步骤及要注意的事项
免疫组化原理步骤及要注意的事项
免疫组化是一种常用的细胞和组织学检测方法，通过利用免疫学原理，使用特异性抗体对目标分子进行检测，主要应用于分析蛋白质分子的表达，可以帮助研究者了解不同细胞和组织中蛋白质的分布和功能，对于疾病的
诊断和治疗也具有重要意义。下面将介绍免疫组化的原理、步骤及要注意
的事项。
原理：
免疫组化是利用特异性抗体与抗原发生特异性反应的原理来进行的。
主要包括两种反应：免疫定位反应和信号测定反应。
-免疫定位反应：通过组织抗原表面与抗体的结合，将目标分子定位
于细胞或组织的特定位置。
-信号测定反应：将已定位的抗原-抗体复合物进行颜色或荧光标记，
发出可见信号，用于检测和记录。
步骤：
免疫组化的主要步骤包括标本制备、抗原修复、非特异性反应阻断、
一抗染色、二抗染色和显微镜观察。
1.标本制备：选择合适的组织样本，常用的样本有组织切片、细胞涂
片和细胞悬液。样本制备主要包括取材、固定、包埋等步骤，其中固定是
关键步骤，常用的固定剂有福尔马林、乙酸乙酯和交联剂等。
2.抗原修复：组织样本在固定过程中往往会导致抗原的空间结构改变
和蛋白质交联，使其成为免疫组化的目标结构。为了恢复抗原的免疫反应性，常常需要进行抗原修复，包括酶解法、消化法、热解法等。
3.非特异性反应阻断：为了减少非特异性结合，需要采取一些措施来
阻断非特异性背景信号。常用的方法包括用蛋白质阻断剂进行封闭、用牛
血清白蛋白或BSA预处理等。
4.一抗染色：在经过上述步骤之后，用特异性抗体与目标抗原结合，
构成抗原-抗体复合物。为了增强抗原-抗体的结合力，常采用多种放大手段，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或二级抗体等。
免疫组化的原理
免疫组化的原理
免疫组化是一种利用抗体与其特异性抗原结合的反应来检测或定位特定分子的方法。它主要基于抗体的高度特异性与高亲和力，能够识别并结合到抗原上。
免疫组化的过程一般包括固定组织、抗原还原、孵育抗体、洗涤、孵育二次抗体和检测。具体步骤如下：
1. 固定组织：将待检测的生物组织固定在载玻片上，通常使用形式固定剂或冷冻剂进行固定。
2. 抗原还原：对固定组织进行抗原还原处理，以破坏抗原与抗体结合时的形态学阻滞并使抗原更易于与抗体结合。
3. 孵育抗体：将含有特异性抗体的抗体溶液加到载玻片上的组织切片上，允许其与目标抗原结合。此时，如果组织中存在目标抗原，抗体就会与其结合形成免疫复合物。
4. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的抗体，减少干扰性信号的产生。洗涤通常使用磷缓冲盐溶液或其他缓冲溶液进行多次冲洗。
5. 孵育二次抗体：加入标记有酶、荧光物质或放射性同位素等的二抗溶液，使其与已结合的抗原-一抗复合物发生反应。二次抗体通常是对多种一抗的特异性抗体。
6. 检测：使用相应的技术，如酶标记法、荧光标记法或放射性
探测等，检测二次抗体与抗原-一抗复合物的结合情况。通过信号的产生和可视化，可以确定抗原的存在位置以及其表达程度。
总的来说，免疫组化是一种通过利用抗体与抗原间的特异性反应，实现对目标抗原的检测和定位的方法。其原理主要是通过抗原-抗体的结合来实现对特定分子的识别和鉴定。
免疫组化的原理及试验步骤
免疫组化的原理及实验步骤
一免疫组化的原理
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
二免疫组化的实验步骤
固定
１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时
２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液
切片
1.石蜡切片：
(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；
(2)将组织浸入二甲苯中透明；
(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；
(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；
(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；
注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波
热修复，煮沸热修复，酶消化方法
２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上
封固
1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。
2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)
3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；
4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭
染色
1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；
2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；
显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察
免疫组化简要步骤
免疫组化是一种用于检测细胞或组织中特定抗原的方法。以下是免疫组化的简要步骤：
1. 样本固定：将待检测的组织样本或细胞样本固定在载玻片上，通常使用福尔马林或乙醇等化学物质进行固定。
2. 抗原恢复：对于一些组织样本，固定后的抗原可能会变性，需要进行抗原恢复步骤，以使抗原恢复其天然的形态和可检测性。抗原恢复可以通过热处理、酶解或化学处理等方法实现。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫染色之前，需要使用一种非特异性抗体或蛋白质（如牛血清蛋白）来阻断非特异性结合位点，以减少假阳性结果。
4. 抗体结合：将特异性的一抗（一般为单克隆或多克隆抗体）加入样本中，与待检测的抗原结合。一抗可以是直接标记的，也可以是未标记的。
5. 洗涤：洗涤去除未结合的一抗，以减少背景干扰。
6. 二抗结合：加入与一抗来源不同物种的二抗，该二抗能够与一抗结合并标记有荧光素、酶或其他可视化标记。二抗的选择取决于一抗的
种类。
7. 再次洗涤：洗涤去除未结合的二抗。
8. 可视化：根据二抗的标记方式，使用荧光显微镜、酶标仪或其他适当的设备对样本进行可视化。
9. 分析和解释：观察和分析样本中的标记信号，并根据标记的位置和强度来解释结果。
需要注意的是，具体的免疫组化步骤可能会因实验目的、样本类型和使用的抗体等因素而有所不同。以上步骤仅为一般性的简要流程，实际操作中可能会有一些细微的差异。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于组织学
和细胞学研究中的实验方法，主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中
的分布和表达水平。它结合了免疫学原理和组织学技术，通过使用特异性
的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。
免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合，然后使
用染色技术来显示抗原的位置。该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。
第一步：抗原-抗体反应
免疫组化的第一步是选择合适的抗体，通过与目标蛋白质的特异性结
合来形成抗原-抗体复合物。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。单克
隆抗体具有高度特异性，只能结合到特定的抗原上。多克隆抗体具有高度
敏感性，可以结合多个位点，从而实现信号放大。
通常，为了提高抗原的可检测性，需要对组织样本进行抗原修复处理。这可以通过热处理（如蒸汽加热、微波加热）或酶切处理来实现。修复可
以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联，增加抗体的渗透性和可
结合性。
当抗原-抗体反应发生时，可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复
合物。例如，可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合，然后使用辣根过
氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来与二抗结合。该反应
可形成稳定的抗体-酶复合物。
第二步：信号放大
由于抗原-抗体复合物的信号很弱，通常需要进行信号放大以便更好
地检测到目标蛋白质。放大信号的方法有很多种，其中最常用的是酶免疫
标记联合酶放大技术。
酶免疫标记是通过将抗体与酶结合，使其能够催化特定的化学反应来
免疫组化原理及步骤
免疫组化原理及步骤
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体与抗原特异性结合的原理来检测组织中特定蛋白质的方法。它在病理诊断、生物医学研究和药物研发等领域具有广泛的应用价值。本文将介绍免疫组化的原理及实验步骤，希望能对相关领域的研究者和实验人员有所帮助。
免疫组化的原理主要基于抗体与抗原的特异性结合。在免疫组化实验中，首先需要选择与目标蛋白特异性结合的一抗和二抗。一抗与目标蛋白结合后，通过二抗与一抗结合，形成复合物，再通过酶标记或荧光标记的二抗来检测目标蛋白的表达情况。免疫组化的关键在于选择合适的抗体，确保其对目标蛋白的特异性结合，从而实现对目标蛋白的定位和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括组织标本的处理、抗原修复、蛋白质阻断、抗体染色、显色反应和显微镜观察等。首先，组织标本需要进行脱水、蜡包埋和切片等处理，以保证标本的完整性和稳定性。接下来是抗原修复步骤，通过高温、酶解或酸碱处理等方法，使组织中的蛋白质发生构象变化，从而有利于抗体的结合。然后进行蛋白质阻断，通过使用牛血清白蛋白（BSA）或牛血清等，阻断非特异性结合位点，减少背景信号的干扰。随后是抗体染色，将一抗和二抗依次加入标本中，使其与目标蛋白特异性结合。再进行显色反应，根据酶标记或荧光标记的二抗，观察目标蛋白的表达情况。最后通过显微镜观察，对标本进行定量分析和图像获取。
在进行免疫组化实验时，需要注意一些关键问题。首先是抗原修复的选择，不同的抗原修复方法对不同类型的组织标本有不同的影响，需要根据实际情况进行选择。其次是抗体的选择，需要确保抗体的特异性和敏感性，避免出现假阳性或假阴性结果。此外，实验过程中需要严格控制各个步骤的时间和温度，避免影响实验结果的准确性。最后，在观察和分析实验结果时，需要结合相关的对照组进行比较，以确保实验结果的可靠性。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用于检测组织中特定蛋白质表达的技术。它在病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域具有广泛的应用。本文将介绍免疫组化的步骤及原理，帮助读者更好地理解和应用这一技术。
首先，进行免疫组化实验需要准备组织切片。通常情况下，组织切片是从已固定的组织样本中制备的。固定的方法可以选择福尔马林固定、乙醇固定等，不同的固定方法会对后续实验产生影响，因此需要根据实验要求进行选择。
接下来，进行抗原修复。抗原修复是为了使组织样本中的蛋白质抗原重新暴露出来，以便后续的抗体结合。常用的抗原修复方法包括热处理、酶消化等，选择合适的抗原修复方法可以提高实验的成功率和结果的准确性。
然后，进行蛋白质的非特异性结合抑制。在进行免疫组化实验之前，需要阻断组织中非特异性的蛋白质结合，以减少假阳性结果的产生。一般可以使用牛血清蛋白（BSA）或者其他蛋白质来进行阻断。
接着，进行一抗的孵育。选择合适的一抗对于免疫组化实验的成功至关重要。一抗的选择应该考虑抗体的特异性、敏感性和稳定性等因素。孵育时间和温度也需要根据实验要求进行调整。
随后，进行二抗的孵育。二抗通常是与荧光素或者酶结合的抗体，用于检测一抗的结合情况。选择合适的二抗可以提高实验的信号强度和特异性。
最后，进行显色或者荧光检测。根据实验要求，可以选择酶标法或者免疫荧光法进行信号的检测。在显色或者荧光检测之后，可以对组织样本进行染色和镜检，最终得到免疫组化实验的结果。
免疫组化的原理是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过显色或者荧光检测来观察组织中特定蛋白质的表达情况。通过对组织样本的处理和抗体的选择，可以实现对蛋白质表达的定量和定位分析。
免疫组化的原理和步骤
免疫组织化学的概念：
免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的有哪些？
免疫组化实验中常用的抗体为单抗体和多抗体。单抗体是一个B淋巴细胞分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？
免疫组化原理及流程介绍
免疫组化原理及流程介绍
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用免疫反应来检
测组织内特定抗原的技术。它通过将特定的抗体与要检测的组织染色连接，从而实现对该抗原的可视化检测和定位。免疫组化广泛应用于病理学领域，可以用于诊断和鉴定疾病，研究疾病发生机制以及评估治疗效果。下面将
介绍免疫组化的工作原理和流程。
免疫组化的工作原理可以分为两个步骤：抗原-抗体反应和可视化。
抗原-抗体反应是指将固定的组织样本与特异性抗体结合，形成抗原-抗体
复合物。这种特异性的结合是由于抗原与抗体之间具有互补的结构，类似
于锁与钥的关系。一旦抗原-抗体结合发生，可以通过一系列的化学反应
来可视化这种结合，从而观察到抗原的位置和表达水平。
免疫组化的流程一般可以分为样本制备、抗原修复、抗体染色和结果
分析四个主要步骤。
样本制备：首先，需要取得要检测的组织样本。这些组织样本可以是
切片、细胞涂片或者细胞悬液。然后，将样本固定在载玻片上，以保持组
织结构的完整性。
抗原修复：组织样本的形态学上常常被固定剂和时间的影响而改变，
导致抗原的结构发生损坏。为了修复抗原使其可被抗体识别，需要进行抗
原修复步骤。常用的抗原修复方法包括高压蒸汽处理（例如蒸气胶片锅或
蒸箱）和化学处理（例如酶解或化学溶解）。
抗体染色：通过将特异性抗体与要检测的抗原结合，可实现抗原-抗
体复合物的形成。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以使用直接染
色或间接染色技术。直接染色是将抗原和抗体直接连接，通过抗原-抗体
复合物可视化抗原的表达水平。间接染色是先与一种包含特异性抗体的二抗结合，再利用第二抗体与标记物（通常是酶或荧光标记）结合，从而放大信号。
免疫组化的原理和步骤
免疫组化的原理和步骤
免疫组化是一种常用的实验方法，它利用特异性抗体与免疫原之间的
相互作用，通过对细胞或组织中特定抗原的定位和检测，以揭示细胞或组
织中特定分子的存在和分布情况。在免疫组化中，主要包括抗原修复、特
异性抗体结合、信号放大、染色和显微镜观察等步骤。
第一步：抗原修复
抗原修复是为了提高抗原的可见性，常见的修复方法有热原修复和化
学原修复。热原修复是将组织样本在热压下加热一段时间，以恢复被固定、变性或交联的抗原的活性。化学原修复是使用化学试剂改变组织中蛋白分
子的结构，使其易于抗体结合。抗原修复可以显著提高抗原的可见性，有
利于后续的免疫组化实验。
第二步：特异性抗体结合
特异性抗体是免疫组化实验的关键。在这一步中，需要选择与目标抗
原高度特异性结合的抗体。常用的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，可
以通过直接标记抗体或者间接标记抗体的方式进行实验。对于直接标记抗体，抗原与荧光物质、酶或金颗粒等直接结合，可通过荧光显微镜、光学
显微镜或电子显微镜直接观察抗原的分布和定位。对于间接标记抗体，首
先给定的抗原与一种特异性的一抗反应，接着加入与一抗结合的二抗，最
后加入标记有荧光物质、酶或金颗粒等的三抗，通过标记物的发光或染色
来观察抗原的分布和定位。
第三步：信号放大
为了增加信号的灵敏度和准确性，常常需要对抗原-抗体结合进行信
号放大，最常用的方法是酶标方法。在酶标法中，将特异性抗体与带有酶
标记的二抗结合，酶标记的二抗与染色剂的底物作用时，能生成可见的颜色或发光信号，从而实现对抗原的检测和定位。常用的酶标方法有还原粉末树脂染色法（如DAB法）和荧光素酶法等。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤
实验原理：
抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。
实验步骤：
（一）脱蜡和水化：
脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1、组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟。
2、无水乙醇中浸泡五分钟。
3、95%乙醇中浸泡五分钟。
4、75%乙醇中浸泡五分钟。
（二）抗原修复：
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：
1、抗原热修复
（1）高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m柠檬酸钠缓冲溶液（ph6.0）。盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）沸热修复电炉或水浴锅加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
（3）微波炉加热在微波炉里加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原Bcl-2、ax、AR、PR、C-fos、x-jum、z-kit、c-myc、E-cadherin。ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshock、Protein、HPV、Ki-67、MDMZ、P53、P34、P15、P-glycoprotein、PKC、PCNA、ras、Rb等
免疫组化的原理和步骤
免疫组织化学的概念：
免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的有哪些？
免疫组化实验中常用的抗体为单抗体和多抗体。单抗体是一个B淋巴细胞分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？
免疫组化基本原理及操作流程
免疫组化基本原理及操作流程
免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的方法，
用于检测和定位特定的抗原或抗体在细胞或组织中的存在和分布。免疫组
化的基本原理是利用抗原与抗体之间的高度特异性结合来实现抗原的检测
和定位。
免疫组化的基本操作流程如下：
第一步：标本处理
标本可以是细胞培养物、组织切片、血液等。在进行免疫组化前，首
先需要对标本进行适当的处理，以使得抗原能够得到良好的保存和定位。
处理方法包括固定、脱水、包埋等。固定是将标本用适当的化学物质处理，使其固定在载玻片上，并保持其原有的形态和结构。
第二步：抗原检测与定位
在标本处理完成后，可以开始进行抗原的检测和定位。这一步需要使
用特异性的抗体来与目标抗原结合。抗体通常通过动物免疫技术获得，即
将纯化的抗原注射到动物体内，激发其产生特异性的抗体。抗体经过收集
和纯化后，将其与抗原所在的标本接触，通过抗原与抗体的特异性结合来
检测和定位抗原的存在和分布。
第三步：抗体检测
抗体检测是免疫组化中至关重要的一步。通常使用标记抗体来检测抗
原的存在和定位。标记抗体是一种与特定抗体共价结合的物质，它可以通
过荧光染料、辣根过氧化物酶、生物素等标记物来实现抗原的检测和定位。
标记抗体通过特异性结合抗原，使得抗原能够在显微镜下观察到，并确定其存在的位置。
第四步：显色与观察
在完成抗体检测后，需要进行显色以使抗原能够在显微镜下观察到。显色方法包括使用荧光显色、暗场显色、免疫酶染色等。其中，免疫酶染色是最常用的方法，它通过在抗体中添加酶标记物，如辣根过氧化物酶（HRP），再加入适当的显色底物，使其生成可见的色素沉淀。经过显色后，使用显微镜观察标本，可见到抗原的存在和定位。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理
一、前言
免疫组化是一种常用的实验技术，它可以用来检测组织或细胞中的蛋白质表达及其分布情况。本文将详细介绍免疫组化的步骤及原理。
二、免疫组化的步骤
1. 取材
首先需要取得需要检测的样本，可以是活体组织或固定后的切片。对于固定后的切片，需要进行脱水、透明化和包埋等处理。
2. 制备切片
将取得的样本制备成厚度为4-6μm的切片，并将其放置在载玻片上。然后进行脱蜡和再水化处理，以便后续步骤的顺利进行。
3. 抗原修复
抗原修复是为了恢复经过固定和包埋处理后被破坏或掩盖了的抗原性
位点，使其能够被抗体识别。抗原修复方法有多种，如高温加压法、
微波辅助法等。
4. 阻断非特异性结合位点
在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点以减少假阳性结果。常用的方法是使用牛血清白蛋白、小鼠IgG等。
5. 抗体孵育
将特异性的一抗加入载玻片上，在恰当的条件下孵育一段时间，使其
与靶分子结合。然后用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
6. 二抗孵育
加入与第一抗体来源物种不同的二抗，使其结合到第一抗体上。通常
二抗会标记有荧光素、辣根过氧化物酶等标记物，以便于检测。
7. 洗涤
在每个孵育步骤之后都需要进行洗涤，以去除未结合的分子和杂质。
洗涤缓冲液可以是PBS、TBST等。
8. 显色
对于标记有辣根过氧化物酶等标记物的二抗，需要使用底物进行显色。底物包括DAB、VIP等，在加入底物之前需要在载玻片上加入过氧化
氢等催化剂。
9. 盖片封装
最后将载玻片盖上盖片，并使用透明胶水进行封装。这样可以保持样
本的湿度和防止样本污染。
三、免疫组化的原理
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤
免疫组化是一种广泛应用于生命科学领域的技术，可以用来检测和鉴
定细胞和组织中特定蛋白分子的存在、定位和表达量。免疫组化基于免疫
学原理，通过使用特异性抗体与待检测分子特异性结合，再通过可视化和
定量分析来观察和测定待检测分子的存在和分布情况。本文将详细介绍免
疫组化的原理和步骤。
免疫组化的原理：
免疫组化是基于免疫学原理的一种实验方法，其核心原理是特异性抗
体与待检测分子的免疫反应。免疫反应可分为两种类型：直接法和间接法。
1.直接法：
直接法是指特异性抗体直接与待检测分子发生免疫反应。在这种方法中，待检测物与特异性抗体结合后，通过标记在抗体上的标记物来直接检
测待检测物的存在。常用的直接标记物包括酶（如辣根过氧化物酶HRP）、荧光染料（如荧光素同工酶）和放射性同位素（如3H和125I）。直接法
的优点是操作简单，敏感度高，但标记物的选择受限。
2.间接法：
间接法是指通过特异性抗体与检测物结合，再加入与抗体结合的二抗
发生免疫反应。间接法的优点是能够使用多种不同的二抗，从而提高了敏
感度和特异性。常用的二抗包括抗IgG的兔抗或小鼠抗。这些二抗通常是
与辣根过氧化物酶结合，并以酶标记物（如DAB）或荧光染料（如荧光素
同工酶）来可视化。
免疫组化的步骤：
免疫组化实验通常需要经过一系列的步骤，包括固定组织、制备切片、抗原解脱、抗体标记和可视化。下面是免疫组化的详细步骤：
1.组织固定：
首先将待检的组织材料使用适当的固定剂进行处理，目的是固定细胞
和组织结构，以保持其形态和抗原的保存。常见的固定剂包括福尔马林、
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理
免疫组化是一种用于检测和定位特定细胞组织中特定分子的技术。它可以帮助我们研究细胞的结构和功能，并在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。以下是免疫组化的步骤及其原理。
步骤一：标本固定
免疫组化的第一步是将待检测组织样本固定在载玻片或其他固定载物上。常用的固定剂包括福尔马林（formalin）和牛血清白蛋白（BSA）。固定的目的是保持组织的形态结构并防止其腐解。
步骤二：脱水和去蜡
接下来，固定的组织样本通常需要通过一系列酒精浓度逐渐脱水，然后使用组织蜡进行浸泡固化。蜡浸泡的目的是保护组织细胞结构，并便于切片及后续的免疫标记。
步骤三：抗原暴露
在进行免疫组化之前，需要通过抗原暴露步骤使组织样本中的目标分子或抗原暴露出来，便于其和抗体的结合。这可以通过热处理（如加热松弛），酶解（如胰蛋白酶消化）或抗原修复剂（如热带缓冲液或消化酶）进行。
步骤四：非特异性结合位点的阻断
为了阻断非特异性结合位点，需要在进行免疫反应之前进行非特异性抗体预处理。
这可以通过与蛋白质或动物血清结合的非免疫球蛋白（如Bovine Serum Albumin，BSA）或鱼胶（Fish Gelatin）来实现。这样，可以降低背景信号并提高特异性。
步骤五：抗体结合
在免疫组化过程中，使用特异性抗体与待检测的目标分子结合形成免疫复合物。这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体是由同一B细胞产生的一类抗体，具有高度特异性，并且可以与特定的抗原结合。多克隆抗体则由多个B细胞产生，可以结合目标分子的多个表位。
步骤六：荧光或酶标记的二抗结合
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免疫组化原理及步骤
免疫组化操作规程
一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制
1. 0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml ；
1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH 2 PO 4 2·H 2 O ＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B （A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2·H 2 O ：15.6 g in 500 ml ddH 2 O ；
B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O ：71.632 g in 1000 ml dH 2
O ）。
2. Citrate Buffered Saline （0.01 M 柠檬酸缓冲液，
PH6.0 ）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O （A.Citrate acid
（柠檬酸）：10.5 g
加双蒸水至 1000 ml ； B.Citrate sodium （柠檬酸钠）： 29.41 g 加 双蒸水至 1000 ml ）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3% 双氧水和 0.5%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ，再接着 加 120 ul TritonX-100, 并加热一儿，冷却至临用前加 0.4 ml 30 ％ H 2 O 2 。
4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。
5. 含 0.03 ％ H 2 O 2 的 0.05 ％DAB （避光） ：用 20×DAB （1％， 10 mg/ml ）5 ul ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。
6.
一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7. Xylene 、梯度 Ethanol （100 ％×2、95％、80％、70％、50％）、 双蒸水、中性树胶（封裱剂）。
8. 苏木精染液：
四、操作步骤
1 、脱蜡、水化
60 ℃× 20 min →Xylene 2 × 10 minut ；es 80% ethanol 2 minutes ； 70% ethanol 2 minutes ； distilled water:5 min ； PBS 洗 3 次×3 min 。
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7) 100% absolute ethanol ：2 ×5 minutes ； 95% ethanol 2 minutes ；
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
8）用封闭通透液浸润切片30 min （RT 避光）。配法是用预热40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％H 2 O 2 。
9） PBS 溶液洗 3 次×3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
10）切片放入0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0 ）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，再加热约 6 min ×4 次，每次间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
11） PBS 溶液洗 3 次×3 min ；
12）将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈, 在圆圈内组织滴入5% 羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min ；
5、一抗孵育
13）甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250 、500 、1000 ）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。
6、二抗孵育
14）将一抗倒掉并用PBS 洗 5 min ×5 次；
15）用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入
100% absolute ethanol: (1-2) min
37 ℃ 恒温烤箱中30 min （回收）。
16) 用PBS 洗 5 次×5 min ；
7、SP 反应
17) 加入SP 后放入37 度烤箱中30 min。
18) 用PBS 洗 5 次×5 min ；
8、显色
19) 加入DAB(快速滴入，观察染色情况，倒掉染液)，显色时间
控制在约 5 min (3～10 min )，由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB(避光)(1:20 储备液)：5 ul 20 D×AB ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。1%DAB 储备液的制:50mgDAB+5ml 0.05 mol/L PBS 充分溶解，-20 ℃保存。
9、复染、脱水、透明、封片
20) 用PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min ；
21) 加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s 后自来水冲洗，
双蒸水洗 5 min ，再用PBS 返蓝 5 min。
22) 脱水：
50% ethanol 1-2 min ，
70% ethanol 1-2 min
95% ethanol 1-2 min ；
95% ethanol 1-2 min ；
100% absolute ethanol: (1-2) min