进出口食品中耐热大肠菌群快速计数法
大肠菌群不同检测方法的结果分析
大肠菌群不同检测方法的结果分析作者：陈梅王楠馨左泽彦罗绍楠来源：《食品安全导刊·中旬刊》2021年第07期摘要：目的：通过对大肠菌群质控样品的检测，比对VRBA平板计数法和LST多管发酵法在大肠菌群计数检测中的准确性，同时分析移液管和移液枪对检测结果的影响。
方法：质控样品来源于中国检验检疫科学研究院测试评价中心，按照质控样品证书和GB 4789.3—2016进行检测。
结果：VRBA平板计数法的检测结果|z|值为0.095，LST多管发酵法的检测结果|z|值为1.349。
使用移液管进行VRBA平板计数法检测的|z|值为0.095，而使用移液枪进行VRBA 平板计数法检测的|z|值为0.804。
结论：相比于LST多管发酵法，VRBA平板计数法的检测结果更接近质控样品的特性值，灵敏度和准确性更高。
相比于移液枪，使用移液管进行VRBA 平板计数法检测的结果更接近质控样品的特性值，准确性更高。
关键词：大肠菌群;质控样品;VRBA平板计数法;LST多管发酵法大肠菌群是指需氧及兼性厌氧、在35～37 ℃培養条件下，48 h内能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌[1-2]。
大肠菌群的检测方法主要有VRBA平板计数法、乳糖胆盐多管发酵法、LST多管发酵法、纸片法、PCR试剂盒法、全自动生化鉴定仪法等。
根据《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》（GB 4789.3—2016），在食品检测领域，VRBA平板计数法、乳糖胆盐多管发酵法和LST多管发酵法是常用的检测方法[3-4]。
1 材料与方法1.1 质控样品来源质控样品来源于中国检验检疫科学研究院测试评价中心。
质控样品为西林瓶真空包装，包装完好。
1.2 试剂与仪器VRBA琼脂、BGLB肉汤、LST肉汤均购于北京陆桥;氯化钠试剂购于国药集团。
立式压力蒸汽灭菌器（型号：SQ810C，厂家：重庆雅马拓）;生化培养箱（型号：BD115，厂家：宾得）;光学显微镜（型号：DM3000LED，厂家：徕卡）。
10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。
2范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
3术语和定义3.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
4责任质量部组织制订、化验室负责实施。
5内容5.1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
5.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
5.1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
5.1.4 天平：感量0.1 g。
5.1.5 均质器。
5.1.6 振荡器。
5.1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
5.1.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
5.1.9 无菌培养皿：直径90 mm。
5.1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
5.1.11 菌落计数器。
5.2培养基和试剂5.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.2.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.2.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.2.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.2.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
5.2.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
5.3大肠菌群MPN 计数法5.3.1 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
9.6.186.食品微生物快速检测大肠菌群快速检测
食品中大肠菌群的测定依据
检样 无菌称取25g（mL）样品于225mL稀释液中，均质
10倍系列稀释
GB 4789.3-2016 食品微生物学检验
大肠菌群MPN计数法
适用于大肠菌群含量较低的食品中 大肠菌群的计数
选择适宜3个连续稀释度h
演示完毕，感谢您的聆听
不产气
产气
BGLB肉汤
36℃±1℃
48h±2h
不产气
产气
大肠菌群阴性
大肠菌群阳性
查MPN表 结果报告
结果判读
1 大肠菌群在测试片上生长后产酸。 2 pH指示剂使培养基颜色变深，在红色
菌落周围有气泡者为大肠菌群。 3 记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数。 4 根据大肠菌群MPN表查出相应的大肠菌群数。
是微生物检验诸多快速方法中比较成熟的方法之一。
已被广大卫生检验者所接受。目前已广泛应用于食品、 餐饮业、卫生、环保、水质检验等。
总结
思考题
1.大肠菌群快速检测方法与国标检测方法的异同？ 2.大肠菌群快速检测的测试片为什么会使产生使纸片颜 色加深周围并有气泡的菌落？ 3.如何对测试片的生长结果进行计数？ 4.大肠菌群快速检测适合在那些领域使用？
测试片结果解读
测试片可能会出现如下现象
1）没有任何菌落生长，不要计算圆形培养基外的菌落。因为泡棉上 已不含选择性培养基。
测试片结果解读
测试片可能会出现如下现象
2）当菌落数超过220时，可选择其中一个或几个有代表性的小方格，计算 平均菌落数，再乘以20得到整个测试片的菌落数。当有许多气泡，培养基 颜色变深暗，有很多小菌落时，记为多不可计。
测试片结果解读
测试片可能会出现如下现象
快速检测食品中微生物方法的进展
快速检测食品中微生物方法的进展摘要：快速检测食品中微生物的方法在食品卫生检验方面起着越来越重要的作用，最终将达到预防肠道传染病和食物中毒的发生的目的。
快速方法包括即用型纸片法、生物化学技术、选择鉴定用培养基法、免疫学技术、细菌直接计数法、全自动微生物分析系统等。
本文对上述各种快速检测食品中微生物的方法的研究进展作一综述。
关键词：快速检测食品微生物随着人们生活水平不断提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。
在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染微生物的可能。
一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导致食源性感染和食物中毒。
传统的检验方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高，但涉及的实验较多、操作烦琐、耗时长、准备和收尾工作繁重。
所以，准确、省时、省力和省成本的快速检验方法是社会的迫切需要。
本文对食品中微生物的快速检测方法进展情况进行综述，以利于对食品进行筛选和检测，最终达到预防肠道传染病和食物中毒的发生的目的。
1、即用型纸片法3m公司的perrifilmtmplate系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数。
由rcp scientific inc 公司开发上市的regdigel系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门菌、葡萄球菌的产品，这两个系列的产品与传统检测方法之间的相关性非常好。
如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，已经被列为国标方法。
使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果[1]。
美国3m公司生产的pf（petrifilm）试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。
在大肠菌群检测方面，国标方法报告的是mpn值而不是每克食品中的大肠菌群数，pf法则可以得出精确数据。
霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36℃培养，不需要低温设备；快速，仅需2 d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短3 d～5 d，大大提高了工作效率。
实验--食品中大肠菌群的测定-课件 (一)
实验--食品中大肠菌群的测定-课件 (一)随着人们对食品安全的重视，食品中大肠菌群的测定越来越受到关注和重视。
在食品安全监测和生产中，常常需要进行大肠菌群的检验，以保证食品的卫生安全。
此次实验旨在学习并掌握食品中大肠菌群的测定方法。
实验一、菌落计数法1.准备样品：取适量的食品样品，如牛奶、肉制品等，加入适量的蒸馏水，充分摇匀后待用。
2.制备平板：准备好平板培养基，常用的有菌落总数计数培养基和大肠杆菌计数培养基等。
用已灭菌的棉签挖取少量培养基涂抹在培养皿上，使其均匀分布。
3.采样：用无菌的移液管取一定量的稀释后的样品，滴于培养皿表面。
4.培养：将培养皿倒置放入恒温箱中，在37℃温度下培养24-48小时。
5.计数：观察培养皿上的菌落数量，使用菌落计数器进行计数，按一定倍数（如1/10、1/100）还原为真实菌落数量。
实验二、MPN法1.制备移液器：准备好10个稀释液和10个带有3个具孔的板，每个孔中加入相应的稀释液。
2.取样：从食品样品中取一定量，用蒸馏水稀释后，分别分装到板中。
3.培养：将板放到37℃恒温培养箱中进行培养，观察是否有生长。
4.判断仪器读数：根据板中生长、未生长的情况计算菌落数，并用最可能数法计算出MPN结果。
总结通过两种方法的比较，可以看出，两种方法都有各自的优点和缺点，需要根据实际需求进行选择。
对于无法进行菌落计数的样品，可以选择MPN法，它具有精度高、结果稳定等特点。
而对于数量较少的样品，可以更为准确地使用菌落计数法。
本次实验学习了食品中大肠菌群的测定方法，虽然实验中用了人工计数，但实际工作中，常常会结合现代化设备进行自动化检测，从而提高检测效率和准确度。
对于保障食品卫生安全，这一方面的控制是很有必要的。
大肠菌群平板计数法标准号
大肠菌群平板计数法标准号大肠菌群平板计数法是指在实验室条件下，通过将待检样品分散在含有特定培养基的平板上，利用培养基对大肠菌群产生的特异性反应，以及对大肠菌群可生长的特定条件进行培养和计数，从而评估样品中大肠菌群的数量。
该方法已被广泛应用于食品、环境和医疗卫生等领域的微生物检测。
大肠菌群平板计数法标准号是《食品微生物学通则》GB 4789.3-2016。
该标准是由中国国家标准化管理委员会于2016年发布的，是用于食品微生物检测的基本规范。
根据该标准，大肠菌群平板计数法的操作流程主要包括样品制备、平板培养、菌落计数和结果表达。
下面将对每个步骤进行详细介绍。
首先，样品制备是指将待检样品进行预处理，以提高大肠菌群的检测效果。
根据不同样品的特点，可以采取不同的处理方法，如加入适量的缓冲液进行搅拌均匀、加热杀菌和稀释等。
此外，还需要注意样品制备过程中的卫生要求，以防止交叉污染。
然后，将样品均匀地分散在含有选择性培养基的平板上。
选择性培养基可以抑制非大肠菌群的生长，从而增加大肠菌群在平板上的菌落形成，方便后续的计数。
常用的选择性培养基有MacConkey琼脂、立兰肠杆菌培养基等。
接下来，将含有样品的平板置于适宜的温度和湿度条件下进行培养。
大肠菌群在一定的温度范围内可迅速繁殖，通常将培养温度控制在37摄氏度。
此外，还需要为培养提供适当的湿度，可以通过在培养箱内放置含水的培养皿或湿度控制器来实现。
菌落计数是大肠菌群平板计数法的核心步骤。
通常，在培养一定时间后，将平板上的菌落进行计数。
菌落计数可以手工进行，也可以使用计数仪来实现。
在进行计数时，需要注意区分出不同的菌落，并排除其他非大肠菌群的菌落。
最后，根据菌落计数的结果，可根据标准对样品中大肠菌群的数量进行评估。
通常，大肠菌群的计数结果以CFU/g（或CFU/mL）表示，即每克（或每毫升）样品中大肠菌群的菌落数。
需要注意的是，大肠菌群平板计数法在应用中存在一定的局限性。
大肠菌群计数检验指导
例： 10-4样品稀释液1mL ，在VRBA平板上有100个典 型和可疑菌落 ，挑取其中10个接种BGLB肉汤管 ，证 实有6个阳性管 ，则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×104/g（ mL）=6.0×105CFU/g（ mL）。
· 胆盐可以抑制其它细菌生长繁殖。 · 分解乳糖产酸产气的大肠菌群 ，看小倒管中的气体。
杜氏发酵管产气情况
1 产气
2
不产气
第四天： 大肠菌群计数报告
第一法： 确证大肠菌群LST阳性管数 ， 检索
MPN表（见附录） ，报告每g（mL）样 品中大肠菌群的MPN值。
第二法： 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以结晶
· 从10-2取样1ML+9 ML生理盐水=1：1000，从10-3取 样1ML ，接种到3管LST中。
第二法： 检样稀释与平板计数
检样稀释： 同上。 平板计数： 1 、每个稀释度接种2个无菌平皿 ，每皿1mL稀
释样品 ， 另外一个平皿加1mL生理盐水作空 白对照。 2 、及时将15—20mLVRBA（结晶紫中性红胆 盐琼脂） 倾注每个平皿中。 3 、待琼脂凝固后 ，再加3—4mLVRBA覆盖表 层 。翻转平板培养。
· MPN： 表示食品中大肠菌群数是以每100ML或克检样内大肠菌 群最大可能数 。一般采用9管法.
· 一般样品25ML（克）+225ML生理盐水=1： 10，从 10-1取样1ML ，接种到3管LST（月桂基硫酸盐胰蛋白 胨肉汤） 中。
· 从10- 1取样1ML+9 ML生理盐水=1：100，从10-2取样 1ML ，接种到3管LST中。
进出口SN标准微生物检测方法之大肠杆菌和大肠菌群计数方法
大肠杆菌和大肠菌群计数方法Enumeration of Escherichia coli and the coliform章节内容：·传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法·LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌（除双壳类软体动物制品外）·瓶装水检测方法·贝类和贝类肉制品检测方法·柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法·大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法·参考文件大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。
大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。
虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。
某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。
1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。
由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。
再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。
与已知的非产气致病菌容易区别开来。
因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。
肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂 。
于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。
1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。
虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。
于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。
简述食品中大肠杆菌的快速检测方法相关研究进展
科技文苑Sep 2020 CHINA FOOD SAFETY67大肠杆菌是两端钝圆、无芽孢且能运动的革兰氏阴性短杆菌，其寄生部位主要是生物的大肠内，约占肠道菌的1%。
大肠杆菌可合成维生素B、K，正常栖居条件下无致病的可能性。
但是，食物在生产加工过程中被粪便中的大肠杆菌直接或间接污染，人们食用被污染的食品后就会影响身体健康，严重时还会致死。
因此，为保障国人身体健康，有必要对食品中大肠杆菌的快速检测方法展开研究。
1 食品中大肠杆菌传统检测方法1.1 多管发酵法该方法是以大肠菌群可发酵乳糖产酸产气的特征为依据来检测大肠菌群——大肠菌群阳性管在44.5℃培养基内持续培养24h 后会产生荧光产物，培养基在紫外光源照射下会有荧光出现。
具体方法步骤为：将一定量水样加入土壤蛋白胨培养液内，随后分步骤展开初发酵实验、平半分利、复发酵试验鉴定；然后参照最可能数（MPN）表，结合各稀释度发酵管数，对每升或每10mL 水样内的大肠菌群数进行收集。
多管发酵法无需耗费太多成本，且实验要求相对简单；不足之处在于其他因素极易对其构成影响，检测结果缺乏准确性。
1.2 平板计数法该方法首先需要稀释食品样本，即将其中的微生物分散为单个细胞组织，减少一定量的稀释液，以便通过肉眼观察，并计算稀释液浓度与样本数量来得到菌落数量。
菌落通常为紫红色，经培养后会有气泡产生，表示大肠杆菌阳性。
平板计数法不但能将大肠杆菌数量计算出来，还可对其特征进行观察，操作相对简单。
但是，该检测方法会使样本中的大肠杆菌肉眼辨识度偏低，需借助放大镜进行。
1.3 测试片法该方法是在国外纸片检测技术的运用下对大肠杆菌进行检测，国内外学者围绕测试片进行了深入研究。
蔡军[1]对平皿计数法与测试片法进行了对比试验，结果发现测试片法特异性较强，且检出限度较低，诊断效率接近于平板计数法。
文霞等[2]采用3M Petrifilm TM大肠菌群测试片法对大肠菌群进行了检测，发现3M Petrifilm TM 大肠菌群测试片法在计数方面与传统平皿计数结果相比无差异。
食品微生物学检验中大肠菌群MPN_计数法的应用与准确性分析
食品微生物学检验中大肠菌群MPN计数法的应用与准确性分析王甲芳，王娟娟，周 敏（山东省济南市历下区疾病预防控制中心，山东济南 250013）摘 要：本文借鉴国家标准GB 4789.3—2016中第一法MPN计数法，分析其在食品微生物学检验中的应用和准确性，并提出提高大肠菌群MPN计数法准确性的建议，旨在提升食品微生物学检验的精确性和可靠性，进一步保障人们的健康安全。
关键词：食品微生物学；大肠菌群；最可能数计数法；准确分析Application and Accurate Analysis of Most Probable Number (MPN) Method for Coliform in Food Microbiology TestingWANG Jiafang, WANG Juanjuan, ZHOU Min(Jinan Municipal Center for Disease Control and Prevention, Li Xia District, Jinan 250013, China) Abstract: In this paper, the first MPN counting method in GB 4789.3—2016 was used to analyze its application and accuracy in food microbiology inspection, and suggestions were put forward to improve the accuracy of coliform MPN counting method, aiming at improving the accuracy and reliability of food microbiology inspection and further guaranteeing people’s health and safety.Keywords: food microbiology; coliform; most probable number method; accurate analysis食品微生物学检验是保障食品安全和公众健康的重要手段。
肉制品中大肠菌群的检验—第一法大肠菌群MPN计数法
菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀后即为1:10稀释
液。或用均质器以8000~10000r/min，均质1min，做成1:10稀释液。
一、样品的采集和处理
大
肠
4.2 鲜、冻家禽检样的处理
菌
群
先将检样进行表面消毒，再用无菌剪子取检样深层肌肉25g（一般可从
MPN
胸部或腿部剪取）。其他处理同生肉。带毛野禽去毛后，同家禽检样处理。
MPN
1.2 采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。
计 数
2. 采样方案
法
2.1 根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害
程度等确定采样方案。
2.2 采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、
c和m 值,三级采样方案设有n、c、m 和M 值。
一、样品的采集和处理
大
第一法：大肠菌群MPN计数法
目录页
样品的采集和处理 设备和材料 培养基和试剂
大肠菌群MPN计数检样程序 大肠菌群MPN计数检样操作步骤
样品的采集和处理
一
1. 采样原则和采样方案 2. 采样用品 3. 样品的采取和送检 4. 检样的处理
一、样品的采集和处理
大 肠
1. 采样原则
菌 群
1.1 样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。
群
样品,
MPN
若5个样品的检验结果均小于或等于m 值(≤100CFU/g),则这种情况是允许的;
计 数
若≤2个样品的结果(X)位于m 值和M 值之间(100CFU/g<X≤1000CFU/g)，
法
则这种情况也是允许的;
若有3个及以上样品的检验结果位于m 值和M 值之间,则这种情况是不允许的；
食品大肠菌群测定两种方法的应用与研究
２０ ． ． 新标 准 Ｇ ／ ４ ８ ． ０９ ３ １ Ｂ Ｔ ７９ ３—２ ０ （ 品卫 生微 生 物检 ０８ 食 验 大肠菌群计数》 的实施 ， 替代老标准《 食品卫生微生物检验 大
肠菌群测定》 与老标准相 比大 肠菌群 的 ＭＰ ， Ｎ从 以乳糖 胆盐为 主要培养基 的 ＭＰ Ｎ法 ， 修改为 以月桂基硫酸盐胰蛋 白胨 肉汤为 主要培养基 的 ＭＰ Ｎ法 ， 同时报告 方式每 １０ ｌｇ 大肠 菌群 的 ０ ｍ（） ＭＰ Ｎ值修改为 每 ｌ ｌｇ大肠菌群的 ＭＰ ｍ （） Ｎ值 。诸城市疾病预 防 控制 中心卫 生细 菌实验室对 ２ ０ ． ． —２ １ ． ． 收到 的食 品 ０９３ １ ００ １１
有 Ｌ Ｔ肉汤产气的管 ， Ｓ 用接种环移种于煌绿乳糖胆盐（ Ｇ Ｂ 肉 Ｂ Ｌ） 汤管 中，６ ±１ 培养 ４ ｈ ｈ ３℃ ｏ Ｃ ８ ±２ 。 １２ ３ 食 品大肠菌群快速检测纸 片法 固体和半 固体样品 ： ．． 取 ３袋大纸片 ， 每袋接种 １ １ 稀 释样品 ｌｍ ； ３袋 小纸片 ， ：０ Ｏ ｌ取 每袋 接 种 １１ 稀释样品 １ ｌ另取 ３ ：０ ｍ； 袋小纸片 ， 每袋接种 １ １０ 释 ：０ 稀 样 品 ｌ 。凡国家卫 生指标 规定大肠 菌群？３ ｍｌ ０的样 品 （ 如碳 酸
１ １ １ 实验试剂 ．．
大肠菌群快速检测纸片 （ 中国疾病预 防控制
中心监制山东省疾病预防控制中心出品） 效期 内使用 ； 月桂基硫 酸胰蛋 白胨 （ Ｓ 肉汤 ， 绿乳糖胆盐 （ Ｇ Ｂ 肉汤 ，青 岛高科 Ｌ Ｔ） 煌 Ｂ Ｌ） （
右， 让样 液全部吸入纸 片中 ， 在用 手轻轻平压一 次 ， 使样液 分布 均匀并 同时赶走气泡。 ） １ ３ 结果判定与分析 ； ． １３ １ 大肠菌群 ＭＰ ．． ＮｄＨ ａｔ ａｅ ０ ０年第 １ ｄｃ ｅ ｉ Ａｎ ｅｌ Ｃ ｒ ２ １ ｈ ８卷第 ４期
食品中大肠菌群计数检测标准(GB 4789.3-2016)及解读.
八
大肠菌群平板计数法的操作步骤
九
结果与报告
— 1—
过渡页
一
大肠菌群的概念
食品营养与检测专业教学资源库
定义：一群在36℃培养48h可发酵乳糖、产 酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏染色阴 性无芽孢杆菌。
— 2—
过渡页
二
大肠菌群的检测意义
食品营养与检测专业教学资源库
该菌主要来自于人畜粪便，故以 此作为粪便污染指标来评价食品 的卫生质量，推断食品中有无污 染肠道致病菌。
— 2—
大肠菌群MPN计数的检验程序
检样 25g(mL)样品+ 225mL稀释液，均质
10倍系列稀释
选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管
36℃±1℃
48h±2h
不产气
产气
36℃±1℃
BGLB肉汤
48h±2h
不产气
产气
大肠菌群阴性管 大肠菌群阳性管
查MPN表 报告结果
食品营养与检测专业教学资源库
食品营养与检测专业教学资源库过渡页大肠菌群的检测操作流程1大肠菌群mpn计数的检验程序2大肠菌群平板计数法的检验程序食品营养与检测专业教学资源库大肠菌群mpn计数的检验程序25gml样品225ml稀释液均质10倍系列稀释选择适宜三个连续稀释度的样品匀液接种lst肉汤管48h2h361bglb肉汤48h2h361大肠菌群阴性管大肠菌群阳性管查mpn表报告结果食品营养与检测专业教学资源库大肠菌群平板计数法的检验程序选择2个3个适宜连续稀释度的样品匀液接种vrba平板25gml样品225ml稀释液均质10倍系列稀释36118h24h计数典型和可疑菌落bglb肉汤36124h48h报告结果食品营养与检测专业教学资源库过渡页大肠菌群的检测设备及材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外其他设备和材料如下恒温培养箱冰箱恒温水浴箱天平均质器振荡器无菌吸管或微量移液器及吸头无菌锥形瓶ph计或ph比色管或精密ph试纸菌落计数器
实验二 食品中大肠菌群的检验
③另取1mL灭菌吸管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每
稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管。
2）乳糖发酵实验 接种1mL待检样品于乳糖胆盐 发酵管内。接种3个稀释度，每一 稀释度接种3管，置（36土1)℃
汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是
否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，
如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复
发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
LST结果判断
大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充 满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如 果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以 用手轻轻打动试管。
阳性管 10ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1ml 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 0.1ml 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 3 6 9 3 6 9 12 6 9 12 16 9 13 16 19 4 7 11 15 7 11 15 19 MPN 10ml 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 阳性管 1ml 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 0.1ml 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 11 15 20 24 16 20 24 29 9 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 MPN 10ml 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 阳性管 1ml 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.1ml 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 1100+ MPN
耐热大肠菌群的实训报告
一、引言随着全球气候变化和工业生产的发展，耐热大肠菌群（Thermotolerant coliforms, TFC）作为食品、水源和环境卫生的重要指示菌，其检测和监控对于保障人类健康具有重要意义。
本次实训旨在通过实验室操作，了解耐热大肠菌群的检测方法，掌握相关实验技能，并分析实验结果，为后续的食品安全和环境监测工作打下基础。
二、实训目的1. 理解耐热大肠菌群的概念和检测意义。
2. 掌握耐热大肠菌群检测的原理和操作步骤。
3. 培养实验室操作技能，提高实验数据的准确性和可靠性。
4. 分析实验结果，探讨耐热大肠菌群在食品和环境中的分布情况。
三、实训原理耐热大肠菌群是指能够在45℃以上生长繁殖的大肠菌群。
在食品、水源和环境中，耐热大肠菌群的存在与否是评价其卫生状况的重要指标。
检测耐热大肠菌群的方法主要包括平板计数法和膜过滤法。
平板计数法：将待检样品与乳糖胆盐发酵管（LB）混合，接种于伊红美蓝琼脂平板上，在37℃恒温箱中培养24小时，观察菌落生长情况。
膜过滤法：将待检样品通过0.45μm孔径的膜过滤，将滤膜贴于伊红美蓝琼脂平板上，在37℃恒温箱中培养24小时，观察菌落生长情况。
四、实训材料与仪器1. 实验材料：待检样品、乳糖胆盐发酵管（LB）、伊红美蓝琼脂平板、0.45μm孔径滤膜、无菌水、接种环等。
2. 实验仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、移液器、无菌操作台等。
五、实训步骤1. 样品预处理：将待检样品与乳糖胆盐发酵管（LB）混合，接种于伊红美蓝琼脂平板上。
2. 平板培养：将接种后的平板置于37℃恒温箱中培养24小时。
3. 观察菌落：观察平板上菌落生长情况，记录菌落数。
4. 膜过滤法：将待检样品通过0.45μm孔径的膜过滤，将滤膜贴于伊红美蓝琼脂平板上，培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 结果分析：对比平板计数法和膜过滤法的结果，分析耐热大肠菌群在样品中的分布情况。
六、实验结果与分析1. 平板计数法：在待检样品中，平板计数法检测到的耐热大肠菌群数量为100CFU/g。
食品中大肠菌群的检验
6）大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按5）确证的大肠菌群LST阳性管数 ，检索MPN表（见附录B），报告每g（ mL）样品中大肠菌群的MPN值。
表B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表
第二法：大肠菌群平板计数法
需要用到的培养基
（1）VRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂
成分：蛋白胨7.0g，酵母膏3.0g，乳糖10.0g ，氯化钠5.0g，胆盐或3号胆盐1.5g，中性 红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g～18g
产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌是人和温血动物肠道 内普遍存在的细菌，是粪便中 的主要菌种产。气一克般雷生白活氏在菌人大 肠中并不致病，但它侵入人体 一些部位时，可引起感染 。
总大肠菌群系指一 群在37℃培养24小 时能发酵乳糖、产 酸产气、需氧和兼 性厌氧的革兰氏阴 性无芽胞杆菌。
大肠菌群
耐热大肠菌群（粪大肠
肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻 是近年来新发现的危害严重的肠 道传染病，已逐渐成为威胁人群 健康的重要公共卫生问题。
致病性大肠杆菌能引起食物 中毒。致病性菌株能侵入肠 粘膜上皮细胞，具有痢疾杆 菌样致病力。肠致病性大肠 杆菌（EPEC）、肠毒素性 大肠杆菌（ETEC）和肠侵 袭性大肠杆菌（EIEC）等。
粉溶液200mL，0.1%煌绿水溶液 13.3mL，蒸馏水800mL， pH7.2±0.1。 制法：略
抑菌剂的选择
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷 基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等 。
抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革 兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用 十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用 煌绿和胆盐作为抑菌剂。
其他项目
抗生素残留、beta-内酰胺酶、 商业无菌等
SN0169—92出口食物中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌查验方式
中华人民共和国进出口商品查验行业标准SN 0169—92出口食物中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌查验方式代替 ZB X09 002一88Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━1 主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料吸管: 1mL,具刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。
水浴箱：±0.5℃。
培养箱：36±1℃,±0.5℃。
冰箱: 0～5℃和-15～-20℃。
均质器。
乳钵和研棒。
平皿：直径90mm。
天平：感量0.1g。
显微镜。
稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
玻璃珠：直径约5mm。
菌落计数器。
3 培育基及试剂月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。
煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
EC 肉汤。
伊红美蓝琼脂(EMB)。
营养琼脂斜面。
色氨酸肉汤。
MR-VP培养基。
Korser氏枸椽酸盐肉汤。
结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。
生理盐水。
革兰氏染色液。
Kovacs氏靛基质试剂。
甲基红指示剂。
Voges-pros kauer(V-P)试剂。
4 样品制备以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保留；非冷冻而易腐的食物,应置于4℃冰箱保留。
检验前冷冻样品可于2～5℃ 18h内解冻,或在45℃以下15min 内解冻。
不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食物以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。
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《出口贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法》编制说明1.任务来源根据国家出入境检验检疫总局2011年下达的标准编写任务通知(计划编号：2011B145)，由福建出入境检验检疫局主持中华人民共和国国家出入境检验检疫行业标准《出口贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法》的编制起草工作。
2.目的和意义贝类，多指软体动物门中的瓣鳃纲（或双壳纲）动物，一般体外披有1~2块贝壳，常见的有牡蛎、贻贝、蛤、蛏等。
由于贝类生长位置较稳定，一旦遇到污染，很难回避；且贝类多属于滤食型生物，在进食食物的同时，也将水中的有毒有害物质吸入体内。
随着近海沿岸水域人类活动的日益频繁，近几年贝类受到到大肠菌群、粪大肠菌群污染的事件时有报道。
大肠菌群、粪大肠菌群作为常用的指标菌，被广泛应用于各类水产品的检验。
目前，系统内尚无专门针对贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测的标准方法。
因此本制标项目将在现有的相关国家标准和检验检疫行业标准的基础上，参考国外相关检测方法，研究制定贝类（及其产品）适用的大肠菌群、粪大肠菌群检测方法，以适应日益增长的技术执法中对贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测的需要。
“贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法”目前无相同的国家标准和行业标准，我国现行的国家标准“食品卫生微生物学检验水产食品检验”（GB/T 4789.20-2003）未规定粪大肠菌群检测方法，“鲜、冻动物性水产品卫生标准”（GB 2733-2005）、“出口活贝类检验规程”（SN/T 0375-1995）等相关国家行业标准也未就贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法进行规定。
本制标项目将现有的相关国家标准和检验检疫行业标准的基础上，参考国外相关检测方法，结合多年来国家标准、行业标准实际应用情况，吸收新的检测技术或手段，研究制定新的贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法，并进行验证和编制。
3 制标依据本标准按照GB/1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求进行编写。
其中技术路线参照美国食品药品管理局（FDA）《细菌分析手册》第4章大肠杆菌和大肠菌群计数（2002年）（Bacteriological Analytical Manual，Chapter 4:Enumeration of Escherichia coli and the coliform bacteria,2002）进行修改。
引用了如下标准的部分内容：GB/T 4789.20 食品卫生微生物检验水产食品检验GB 17378.7 海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输SN/T 1538.1 培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T 1538.2 培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南参考比较了GB 4789.3 《食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB 4789.39 《食品卫生微生物学检验粪大肠菌群计数》以及GB 17378.27 《海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查和生物监测》等方法，制订适用贝类的大肠菌群、粪大肠菌群检测方法。
4研究过程在建立了本方法（以下称其为“贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测法”）后，对其进行了方法验证。
方法验证包括两部分：室内方法比较研究和室间协作试验。
4.1 室内方法比较研究以检测人工污染相同浓度添加菌样品的方式，比较了贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测方法采取200g取样量及5管接种培养法，与通常食品中25g取样量及3管接种法的差异；同时，还研究了贝类大肠菌群、粪大肠菌群相对准确性和特异性。
大肠菌群、粪大肠菌群作为卫生指示菌达到一定数量才表明贝类卫生状况差，贝类中检测出的大肠菌群、粪大肠菌群数如果很低并没有多少实际意义，因此未进行该方法的检出限研究。
4.2 室间协作试验组织了6个实验室，其中包括一家生产出口贝类产品的企业实验室，采用1种贝类样品，3个污染水平的实验室间协作实验，确定了本方法的重复性值和再现性值。
5研究内容5.1 室内方法比较研究5.1.1取样量及接种培养法的比较本方法对贝类样品的取样量为200g，采用5管法接种培养，不同于通常食品25g 的取样量，采用3管接种培养。
采用相同浓度的人工污染贝类样品，按两种不同取样量、不同的接种管数进行检测，比较检测大肠菌群、粪大肠菌群结果的差异。
5.1.1.1方法5.1.1.1.1基质：经过热处理的花蛤、贻贝样品，剥去双壳取蛤肉及壳瓣内液体均质（不加稀释液），经菌落总数测定为不含菌的阴性样品。
5.1.1.1.2菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922购自上海汉尼公司。
将冷冻保存的大肠埃希氏菌菌株置室温回温后，接种于营养肉汤中制成菌悬液，至36.5℃培养18～24h，取1mL菌液肉汤加入9mL稀释液制成1/10的菌液稀释液后，按1/10做成系列稀释度，选择合适系列稀释度的菌悬液备用。
5.1.1.1.3接种水平：用上述菌悬液的合适浓度的稀释液分别接种2种贝类基质，每种贝类按101~102CFU/ mL、102~103CFU/ mL、104~105CFU/ mL分别接种3个样品，每个样品为225g，经过均质混匀后，分成200g、25g待检。
5.1.1.1.4分析：按贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测方法，取样量为200g，采用5管法；另外，按通常的取样量为25g，采用3管法。
比较两种不同取样量、不同的接种管数检测结果的差异。
检测结果见下表。
表1 比较两种不同取样量及不同接种管数培养法的检测结果从对两种人工污染样品三个接种水平两种取样量计数结果可以看出,两种方法所得结果经统计学处理，无显著差异，从检测结果来看，取样量为200g的检测数值大部分大于取样量为25g的检测数值，说明取样量大检出的菌量会相对多点，也可能与试验样本数不够多有关系。
5.1.2 相对准确性5.1.2.1方法2.1 实验菌株菌液制备采用5.1.1.1制备的基质，分别称取四份各200g花蛤肉均质待用。
添加菌液制备同5.1.1.2，将过夜培养的菌悬液，10倍递增稀释至所需浓度（本实验采用10-6、10-7、10-8、10-9四种稀释度），每个稀释度取1mL分别添加到四份200g花蛤肉中均质混匀，分成四组，按照贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测法检测，同时用常用的3管法计数所添加菌液含菌量。
5.1.2.2结果表2 大肠菌群数量的检测结果由于只添加大肠埃希氏菌1种菌，粪大肠菌群的检测结果与大肠菌群的检测结果基本一致，不再单独列表说明。
以上试验选用冻煮花蛤作为人工污染样品基质，用传统3管法对添加到蛤肉中的菌液含大肠埃希氏菌的量进行计数，同时，采用贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测法检测人工污染贝类中的菌量。
从以上几种浓度菌液的计数结果可以看出，用该方法所得计数结果，基本落在所添加菌液含菌量的95%可信限范围内，因此，采用该方法能够准确检测出贝类中所含的大肠菌群、粪大肠菌群的数量。
5.1.3 特异性5.1.3.1方法选取15株大肠菌群菌株和25株非大肠菌群菌株，将40株菌分别接种到经过热处理为不含菌的40份花蛤样品中，接种水平约为102 cfu/ mL，采用贝类大肠菌群检测法，按取样量与稀释液之比为1：2的比例混匀，各取2mL加入10mL双料LST管中，共接5管，只要5管中有一管产酸产气并经过BGLB证实，说明所添加的菌能够被检出判定为阳性，反之为未检出判定为阴性。
5.1.3.2结果贝类大肠菌群检测法的特异性见表3。
表3 贝类大肠菌群检测法特异性研究菌株中文名菌株学名菌株号菌株来源结果大肠埃希氏菌Escherichia coli ATCC25922 购自上海汉尼公司阳性大肠埃希氏菌Escherichia coli ATCC 8739 福抗厂提供阳性大肠埃希氏菌Escherichia coli 44110 购自中国药品生物制品检定所阳性大肠埃希氏菌Escherichia coli 44155 购自中国药品生物制品检定所阳性大肠埃希氏菌Escherichia coli 44106 购自中国药品生物制品检定所阳性大肠埃希氏菌Escherichia coli 44103 购自中国药品生物制品检定所阳性大肠埃希氏菌Escherichia coli ATCC10536 购自陆桥公司阳性大肠埃希氏菌Escherichia coli CC008 本室分离菌株阳性阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii ATCC 29544 购自陆桥公司阳性阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii ATCC 51329 购自上海汉尼公司阳性阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii ATCC 50205 上海局提供阳性肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae 46117 购自中国药品生物制品检定所阳性Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 购自上海汉尼公司阳性肺炎克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca ATCC700324 生物梅里埃公司提供阳性产酸克雷伯氏菌阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae CC031 本室分离菌株阳性Citrobacter freundii ATCC8090 购自上海汉尼公司阴性弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii CC029 本室分离菌株阴性弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter braakii CC012 本室分离菌株阴性布氏柠檬酸杆菌普通变形菌Proteus vulgaris ATCC49132 购自上海汉尼公司阴性奇异变形菌Proteus mirabilis ATCC43072 购自上海汉尼公司阴性奇异变形菌Proteus mirabilis CC010 本室分离菌株阴性Edwardsiella tarda ATCC15947 购自上海汉尼公司阴性迟钝爱德华氏菌Salmonella paratyphi A CC002 福建CDC提供阴性甲型副伤寒沙门氏菌Salmonella choleraesuis ATCC13311 福抗厂提供阴性猪霍乱沙门氏菌鼠伤寒沙门氏Salmonella typhimurium ATCC14028 购自上海汉尼公司阴性肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis ATCC13076 购自上海汉尼公司阴性肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis 5041 购自中国药品生物制阴性品检定所浦那沙门氏菌Salmonella poona NCTC-4840 购自上海汉尼公司阴性Shigella sonnei ATCC25931 购自上海汉尼公司阴性宋内氏志贺氏菌痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae 51252 购自中国药品生物制阴性品检定所蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus ATCC11778 购自上海汉尼公司阴性副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 购自上海汉尼公司阴性阴性副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus 1.1997 购自中科院微生物所菌种中心溶血性链球菌Streptococcushemolytics 33210-4a 购自中国药品生物制阴性品检定所铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 购自上海汉尼公司阴性Staphylococcus aureus ATCC6538 福抗厂提供阴性金黄色葡萄球菌ATCC12228 福抗厂提供阴性表皮葡萄球菌StaphylococcusepidermidisListeria monocytogenes ATCC7644 购自上海汉尼公司阴性单增李斯特氏菌英诺克李斯特Listeria innocua ATCC33090 购自上海汉尼公司阴性氏菌阴性粪肠球菌Enterococcus faecalis 1.013 购自中科院微生物所菌种中心从上表可以看出，采用贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测法，对贝类中添加的15株大肠菌群菌株均能够检出，对贝类中添加的25株非大肠菌群菌株均未检出，说明本方法特异性为100%。