植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产
植物细胞培养技术生产次生代谢产物的研究进展
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２０ ０８年 第 １期 （ 第６ 总 ２期 ）
牡 丹 江 师 范 学 院 学报 （ 自然科 学版 ） Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｄ ｎｉｎ ｒ ｌ ｉｅ ｓ ｙ ｏ ｒ ａ ｏ Ｍｕ ａ ｊ ｇＮｏ ｍａ ｖ ｒ ｉ ａ Ｕｎ ｔ
２ １ 前体 物饲 喂及 生物转化 ．
光 照对 次生代 谢 产物 的合 成 有 重要 影 响 ． 不
前 体化 合物 的供应 不足影 响次 生代谢 产物在 植 物 体 内 的合 成 代 谢 ． 物 体 内 可发 生皂 化 、 植 酯
同植物 细胞 生产 次 生 代 谢产 物 时 ， 光 质 和光 量 对
１ ３ 合 适培 养基 的选用 ． 改 良的 Ｂ 培 养基 利 于 愈伤 组织 的诱导 和 以 后 的培养． 培养 基 中糖 浓 度 直接 影 响某 些 细 胞 的
干重 和次 生代谢 产 物 的产 量 ， 同植 物 细 胞 对 培 不 养基成 分 的需求 也各 不相 同．
植物次生代谢产物生产
pH值：植物细胞培养的最适宜pH 值在5-6 之间,但也存在
提高植物细胞培养中次生代谢 产物产量的方法
前言
初生代谢(primary metabolism)是指能使营养物质转换成细
胞结构物质、维持细胞正常的生命活动或能量的代谢，初 生代谢的产物称为初生代谢产物(primary metabolites)， 如糖、蛋白质、脂类、核酸等。它们是维持细胞生命活动 所必需的。
• 解决植物细胞培养生产次生代谢物含量低的最有效的手段之一是 筛选高产细胞株。用来筛选的细胞来源可以是有足够生理和形态 异质性的细胞群，也可以是通过物理或化学因子诱变处理产生的 突变体群。
• 筛选方法:目测法,放射免疫法、酶联免疫法、流动细胞测定法、 琼脂小块法等。
3. 物理因素
光照：对次生代谢产物的合成有重要影响. 不同植物细胞生
温度：不同种类的植物细胞培养对温度的要求是不同的, 最
适的温度为25 ℃左右, 超过30 ℃, 对生长有明显的抑制作 用. 较低的温度有利于生物碱的合成, 而高温则会导致次生 代谢产物的合成基本停止。
通气状况：国外学者研究发现: 利用生物反应器培养长春花
植物次生代谢产物的生产技术及工艺进展
植物次生代谢产物的生产技术及工艺进展
植物次生代谢产物是植物生命活动中的重要组成部分，在生态系统中发挥着重
要的作用。它们除了在自己的生长中起到重要的作用外，还有很多药用价值。其中有一些物质已经被广泛地用于医药、香料、染料、高级材料等领域。然而，由于各种因素的制约，植物次生代谢产物的生产一直是相对困难的。接下来，我会就植物次生代谢产物的生产技术及工艺进展这一话题进行探讨。
一、植物次生代谢产物的生产技术大体分类
生产一直是植物次生代谢产物生产的难点。在过去，传统的化学合成方法被认
为是主要的生产途径。然而，这种方法的成本较高，且仅适用于某些化学物质的生产。现在，人们发现通过细胞培养建立起的次生代谢产物生产系统是一种新的方法。这种方法借助植物本身的代谢机制，可以建立高效、连续、大规模的生产系统，从而大大提高了生产效率。接下来，我们将对这两种方法进行简单的介绍。
1.1 传统的化学合成方法
传统的化学合成方法是指通过人工合成的方式，在实验室中根据物质结构和反
应机理对物质进行合成。和传统的制药行业一样，这种方法也存在许多缺陷。首先，植物次生代谢产物的化学结构较为复杂，需要很多繁琐的反应步骤，耗时耗力，且合成的产物纯度较低。其次，这种方法长期以来忽视了环境和生态等方面问题，不利于现代可持续发展的趋势。
1.2 细胞培养方法
细胞培养技术是指在体外培养细胞，利用细胞本身的基因信息和代谢途径来合
成目标产品。细胞培养技术具有高效、连续、规模化生产、高纯度、低成本等优点。尤其在植物次生代谢产物生产领域已经得到广泛应用，成为一种主要的生产方式。现有的细胞培养方式大致分为固定化细胞培养、悬浮细胞培养、和器官培养三类。
植物组织细胞培养技术生产此生代谢产物
植物组织细胞培养技术生产次生代谢产物的应用摘要：植物组织细胞培养是现代生物技术应用最重要的一个方面，它是一个应用
广泛和快速发展的技术。植物组织细胞培养技术已应用于植物次生代谢产物的生
产，并取得很大成效。本文讲述组织细胞培养技术在药物、食品、化妆品等方面的
次生代谢产物生产的一些应用，以及总结了现在主要植物组织培养技术、植物组织
培养技术在实践中的应用。
关键词：次生代谢产物细胞培养代谢产物
植物的次生代谢产生的活性物质成分已被人类广泛应用，主要集中在研究制药(如如抗癌药物紫杉醇、疗伤药物紫草宁、保健药物人参皂甙等)、食品添加剂(如生姜、香子兰等)、调味剂(如胡椒、留兰香等)、食用色素(如花青素等)、油料(如如豆寇油、春黄菊油等)、饮料(如咖啡、可可等)、树胶(如阿拉伯胶等)、化妆品、生物杀虫剂和农用化学品等方面。尽管有些植物次生代谢物质并不是很多，但它们与人类健康密切相关，已成为当前生物领域研究关注的重点。因此许多植物代谢产物以组织细胞培养技术的方法开发利用，进行大规模生产，使植物次生代谢物质产量和活性提高。
1 植物组织培养技术在实践中的应用[1]
21世纪是生物技术迅速发展的世纪，而植物组织培养技术是生物技术中的重要内容，可以用于：
植物育种已被越来越广泛的用于扦插难生根植物、引种材料少的植物。除常规的用器官进行培养，也可以用花药进行花粉单倍体植株育种，这种方法技术简单，对一些植物种来说易于诱导未成熟花粉的分裂，可以进行大群体研究，可以迅速而大量的产生单倍体，具有迅速纯合、选择效率高、排除杂种优势干扰、突变体筛选、消除致死基因等优点。
植物细胞悬浮培养综述
植物细胞悬浮培养综述
植物细胞悬浮培养
植物细胞悬浮培养是指在脱离自身组织的条件下，对植物的不同外植体进行诱导，将获得的愈伤组织或其他组织（不定根）转接入摇瓶培养基中进行震荡培养，得到均一的、游离的悬浮细胞或组织，通过不断的继代培养使细胞增殖并保持最佳的生理活性，继而转接到大型生物反应器中培养而获得大量悬浮细胞的一种技术。
像微生物细胞一样，未分化的植物愈伤细胞可以在特定的液体培养基环境下进行大规模繁殖，以产生稳定的悬浮细胞。主要用于生产有价值的植物源次生代谢产物，如紫杉醇、紫草素、青蒿素、地高辛、人参皂甙和苦艾碱等。
植物的大多数组织部分都能用来诱导生产愈伤组织，并可以无限期地在体外维持愈伤组织的脱分化特性，生产功效代谢物组分。并且愈伤组织培养合成人类所需的次级代谢产物比从野外植物材料中提取更方便。
植物细胞悬浮培养的应用
植物细胞悬浮培养作为一种新技术，主要应用于富集和生产活性次生代谢产物，同时还能合成氨基酸、有机酸、黄酮、多酚等易吸收的小分子，多糖、多肽或蛋白等具有重要功效的大分子。
植物细胞悬浮培养技术产生的活性次生代谢产物，大量用于药品、功能性食品或化妆品。如：人参植物细胞悬浮培养培养的细胞获得的细胞产物的裂解液、提取物和培养物可以作为活性成分用于抗炎、抗肿瘤、抗衰老的药品和化妆品中。来自青蒿形成层的细胞及其培养物不仅对脂多糖（LPS）诱导细胞释放NO 有抑制作用，而且能抑制环氧合酶-2（COX-2）的表达，因此可以作为有效的抗炎成分应用于药品、化妆品中；来自紫杉形成层或原形成层的细胞系，其溶解产物、提取物及培养物具有抗癌活性；来自番茄形成层的细胞及其培养物能抑制与老化相关的酶的生成，抑制效率高于改善皱纹效果很强的视黄酸。
细胞培养的应用
均一性好,大小与生理状况一致;
生长快;
目标产物含量高;
细胞遗传性能稳定.
二、动物细胞培养与表达制备药用蛋白
1962年开始，用于生物医学研究，生产酶
制剂，生长因子，疫苗，单抗等。
如：纤溶酶原激活剂（t-PA）、神经生长
因子（NGF）、 乙肝疫苗（HbsAg）、干扰素
（IFN）、白介素（IL）等
（一）病毒疫苗生产：Vero细胞培养
培养；
缺点：剪切力大。
搅拌式反应器结构示意图
1—搅拌器；2—罐体； 3—夹套；4—搅拌轴；
5—压出管；6—支座；
7—人孔；8—轴封；
9—传动装置
典型的搅拌结构
（1-2）非机械搅拌式反应器 非搅拌式反应器所产生的剪切力较小，结 构简单。其主要类型有鼓泡式反应器、气升式 反应器等气体搅拌式反应器
→Gas outlet
实例： （2）过程2需要的工具酶有 限制性内切酶和DNA连接酶 __________________ 。 （3）欲将大肠杆菌b筛选出 来，应利用基因表达载体 标记基因 （重组DNA分子）上的_____ 。 （4）干扰素不能在高温环境 中保存，其原因是__________ 干扰素是蛋白质，高温下会变性 ___________________ 。
加碱（碳酸 氢钠） 加糖（葡萄 糖） 50L 胎牛血清 其他成分 灌注培养液 生 物 微载体 反 应 锥形瓶逐级 放大培养 5L种子罐培 养 培养液 器 收获病毒 出液口
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3 高产细胞系的筛选(P113)
3.1高产细胞系 筛选的整体思路
外植体
愈伤组织的诱导筛选
悬浮培养细胞
高产细胞系筛选
高产细胞系的建立
高产细胞株系的特点
• 培养细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定 的产物
• 细胞生长及产物合成的速度快，在较短的时间内 能得到较高产量的终产物
• 代谢产物要在细胞中积累，而不被迅速分解，最 好能将其释放到培养基中
有效成分含量高。 次生产物的产量=细胞量*细胞次生代谢产物的产率
可控
遗传因素决定
植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能 力弱、易聚团等特点。
植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有 利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累 和分离。
适合植物细胞培养的反应器应具有适宜 的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。
醌 简单酚类
紫草宁 香豆素
抗菌、抗炎、抗病毒、止血 香料，抗菌消炎
萜
类
生物碱
紫杉醇 青蒿素
长春新碱 奎宁
抗癌 抗疟疾
抗癌 抗疟疾
长春碱： ＄ 2 million/kg 长春新碱： ＄ 15million/kg
• 李时珍在《本草纲目》中所开列的1892种药物 绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定 药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产 物。天然的次生代谢产物已经超过2万种。
植物细胞培养与次级代谢产物制备
第5章 植物细胞培养与 次级代谢产物制备
Preparation of Pla植n物t细C胞e培ll养M与次e级ta代b谢o产l物it制e备s
细胞工程 Chapter 5
§5.1 植物细胞培养及其特点
plant cells culture：指在离体条件下，将
分离的植物细胞通过继代培养增殖获得大量 细胞群体的一种技术。
植物细胞培养是在植物组织培养的基础上 发展起来的，是生产植物次生代谢产物的一 种技术。
植物细胞培养与次级代谢产物制备
Characteristics of plant cells culture
与微生物细胞相比，植物细胞：
• 平均直径 Larger in 30-100 times • Tend to occur in aggregates形成细胞团 • Shear-sensitive易被剪切力损伤 • Slow growing生长慢，周期长 • Easily contaminated易受微生物污染 • Light, oxygen, CO2 demand
Chapter 5
植物细胞培养与次Co级py代rig谢ht产©物20制11 备Wang Weidong, All rights reserved.
植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策
植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策
植物细胞培养技术是将植物体的某一部分经过无菌处理，置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。利用植物细胞培养技术生产有用代谢产物，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。据不完全统计，我国已对400多种植物建立了组织和细胞培养体系，并从中分离出600多种代谢产物。
1外植体的影响
同一植株不同部位的组织进行培养时，其产物或产物积累量不同。
银杏叶来源的愈伤组织黄酮含量为1.5%，茎段来源的愈伤组织为1.0%，而子叶来源的愈伤组织仅为0.3%。Mischenko等[3]在茜草愈伤组织培养过程中发现，来源于叶柄和茎的愈伤组织蒽醌累积量比来源
于茎尖和叶的愈伤组织高。徐咏梅等对杜仲乔林与叶林2种栽培模式下树皮中次生代谢物的含量差异研究发现，乔林树皮中杜仲醇、总黄酮和杜仲胶的含量均比叶林树皮中的高，而叶林树皮中绿原酸、京尼平甙酸和桃叶珊瑚甙比乔林树皮中的高。因此，利用植物细胞培养生产次生代谢物时，选择能诱导出疏松易碎、生长快速且具有较高次生代谢物合成能力的愈伤组织的外植体非常重要。
2培养基的影响
2.1培养基种类
在细胞培养中，愈伤组织生长和次生代谢物产生的最佳培养基一般是不一致的。钟青平等研究不同培养条件下的栀子愈伤组织生长和栀子黄色素的产生时发现，B5、MG-5基本培养基有利于愈伤组织生长；M-9基本培养基有利于黄色素合成。甘烦远等认为MC培养基对红花愈伤组织生长和生育酚的形成最有效。因此在组织培养时可以采用二步培养法，根据生长及代谢的需要，调整基本培养基。
植物组织培养技术的主要类型与应用范围
植物组织培养技术的主要类型与应用范围植物组织培养技术是一种通过体外培养植物细胞、组织和器官的方法，以实现植物无性繁殖、基因转化、品种改良等目的。该技术已经被广泛应用于植物科研、种质资源保护与利用、植物病害防治和植物繁殖等领域。本文将介绍植物组织培养技术的主要类型与应用范围。
一、植物组织培养技术的主要类型
1. 植物离体培养
植物离体培养是指将植物组织或器官从体内分离出来，放置在富含营养物质的培养基中进行培养。这种技术可以用于植物无性繁殖、基因转化、种质资源保存和研究等方面。根据培养的组织类型不同，植物离体培养可分为愈伤组织培养、胚性组织培养、根尖培养等。
2. 植物悬浮细胞培养
植物悬浮细胞培养是指将植物组织中的一部分细胞分离出来，通过悬浮培养技术使其在液体培养基中保持悬浮状态进行培养。这种技术主要用于生产植物次生代谢产物、基因转化等方面。
3. 植物器官培养
植物器官培养是指将植物体中的器官（如茎、叶、种子等）分离出来进行培养。通过植物器官培养技术，可以快速繁殖优良品种、实现植物基因转化、筛选抗病性植株等。
二、植物组织培养技术的应用范围
1. 植物无性繁殖
植物无性繁殖是指通过植物组织培养技术，将植物组织或器官培养后产生新的植株。这种方法可以实现高效繁殖植物种质资源，解决传统繁殖方式低效率的问题。
2. 品种改良
植物组织培养技术可以用于品种改良。通过离体培养技术，可以进行基因转化，导入抗病、抗逆性等优良基因，从而提高植物的品质和抗性。
3. 植物次生代谢产物的生产
植物组织培养技术可以用于大规模生产植物次生代谢产物。通过悬浮细胞培养技术，可以实现大量的细胞生产，从而获得丰富的植物次生代谢产物。
植物细胞培养生产次生代谢产物及其应用前景
（3）合适培养基的选用
• 改良的B5 培养基利于愈伤组织的诱导和以 后的培养。培养基中糖浓度直接影响某些 细胞的干重和次生代谢产物的产量,不同植 物细胞对培养基成分的需求也各不相同。
展望前景
• 虽然植物细胞大规模培养生产有用次生代谢产物在过去几 十年取得了飞速发展，但真正应用于商业化生产的事例不 多，就目前的工艺，以低于1 000$／kg的生产成本来获得 某种次生代谢物是困难的[14]，况且许多基础理论和工程 技术问题有待于进一步研究。展望未来，植物细胞培养技 术要想实现真正意义的工业化，必须从以下几方面努力： (1)筛选高产细胞系；(2)利用基因工程手段，对次生代谢 中的关键酶基因进行修饰和改造，提高次生代谢物的产量； (3)与工程技术相结合，针对不同的培养体系，研制高效的 生物反应器系统。随着这几方面研究的不断深入，植物细 胞培养这种方兴未艾的技术将在生产有价值的植物天然成 分方面发挥越来越大的作用。
• 20世纪70年代以后，该技术有所发展，利用植物细胞工程技术生产一 些药用有效成分在工业上获得成功，据20世纪80年代末期的统计，当 时全世界有40多种植物的细胞培养工程研究获得成功，部分悬浮细胞 培养体系中次生物质的产量达到或超过整体植株的产量，有些药用植 物的研究达到中试水平，其中利用紫草悬浮细胞培养生产紫草宁的成 功令人瞩目[5]。1984年日本的Mitsui公司利用紫草生产紫草宁规模达 到750 L，产物最终浓度达到1400 mg／L。
植物细胞培养生产次生代谢产物中的影响因素
植物细胞培养生产次生代谢产物中的影响因
素
论文导读：植物细胞培养是获得植物有用代谢产物的来源。但由于许多次生代谢产物储存于液泡里。并诱导植物细胞次生代谢产物的释放。
关键词：植物细胞培养，次生代谢产物，诱导，两相培养法
天然药物是药物的一个重要的组成成分，它来自于植物、动物、矿物和微生物，但以种类繁多的植物为主。天然药物之所以能防病治病，其物质基础是其中所含有的有效成分，包括一系列的植物细胞次生代谢产物[1] 。而目前由于环境恶化的影响，一些天然的药用植物近乎灭绝，还有一些由于生境特异，生长缓慢，人工栽培困难，加上长期以来的粗放型和掠夺性的开采，其资源已严重匮乏，自然资源已难以满足日夜增长的临床需要。因此，应用现代生物技术进行天然药用植物细胞大规模培养提取获得医疗、化妆等所需的活性成分来满足日益增长的市场需求，已在实践中得到了应用。
植物细胞培养是获得植物有用代谢产物的来源。目前植物细胞培养难以工业放大的一个关键问题是生产技术成本过高，虽然实现了植物细胞的连续使用，减少由于接种量过高而产生的附加成本，缩短培养周期。但由于许多次生代谢产物储存于液泡里，释放量很少或根本不释放，限制了植物细胞培养技术在工业上的应用，同时也增加了后期分离产物的操作难度，为此如何在适当的条件下优化植物细胞的培养，并诱导植物细胞次生代谢产物的释放，就显得尤为重要。本文就此从以下方面进行综述。
1.培养条件的调控
1.1PH值的影响
培养基的酸度对植物细胞代谢产物的分泌很重要，一些次级代谢产物是与H+通过对运方式
跨膜传递的。由于细胞膜两侧的PH值差控制对运的方向，因此当培养基中的PH值降低时，即培养基中的H+离子浓度升高时，就会促使次生代谢产物向胞外运输，而H+会向胞内运输。如降低培养基的PH值，可有效提高大麦细胞释放七叶氰；高山红景天细胞红景天氰的释放实验也得到同样的效果[2] 。因此，在植物细胞培养过程中，通常PH作为一个重要的参数被控制在一定的范围内，植物细胞培养的适宜PH值一般为5-6。但PH改变引起次生代谢产物的外分泌并不适用所有的物质，如长春花细胞中的阿吗碱的释放并未因为培养基的酸化而增加，可能阿吗碱是以结合态被牢固束缚于液泡中，不易透过液泡膜，因此单纯的扩散调控不能促其释放[3] 。
植物次生代谢产物生产
添加的前体物种类、浓度和时间对次生代谢产物的影响在 很多细胞培养中也得到体现。
4.4 抑制剂的使用
• 植物次生代谢是多途径的, 是植物体内一系列酶促反应的 结果, 在离体培养条件下有初生物质向次生物质的转化, 也 有次生物质之间的相互转化. 抑制剂可抑制支路代谢和其 它相关次级代谢途径，使代谢过程有利于目的次生代谢物 的产生。
甜叶菊（Stevia rebaudiana）
Rao and Ravishankar 1999
光果甘草（Glycyrrhiza glabra） Rao and Ravishankar 1999
奇异果（Thaumatococcus danielli） Rao and Ravishankar 1999
从植物细胞培养获得药品
5 培养方法
5.1 两步培养
两步培养：生长与生产非耦联型的培养体系，细胞的最适生
长条件和最适生产条件是不同的。两段培养法就是根据这点， 把培养过程分为细胞生长期和次生代谢物生产期两个阶段。 在不同阶段分别采取不同的培养条件，在细胞生长期使接种 细胞大量繁殖，提高比生长速率，尽快获得高密度细胞；在 生产期则可保持细胞的高密度，维持存活率，降低细胞死亡 速率，持续获得目标产物。
植物细胞培养与次生代谢产物再工业生产方面的前景
植物细胞培养与次生代谢产物在工业生产方面的前景
【摘要】许多植物次生代谢产物是常用的药物制品、优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。本文主要讲述了植物细胞培养产生的次生代谢产物在工业各方面的重要作用、开发以及大规模生产应用。
【关键词】植物组织细胞培养次生产物工业生产
【正文】
植物细胞培养始于本世纪初，并不可争议地具有工业化潜力。目前植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，而植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。
这些次生代谢活性物质成分已被人类广泛应用，主要集中在研究制药、食品添加剂、调味剂、食用色素、油料、饮料、树胶、化妆品、生物杀虫剂和农用化学品等方面。尽管有些植物次生代谢物质并不是很多，但它们与人类健康密切相关，已成为当前生物领域研究关注的重点。因此许多植物代谢产物以组织细胞培养技术的方法开发利用，进行大规模生产，使植物次生代谢物质产量和活性提高。
一、在制药工业方面的应用
药用植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异。这些次生代谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、甾体及其甙、生物碱七大类。还有人根据次生产物的生源途径分为酚类化合物、类萜类化合物、含氮化合物(如生物碱)等三大类，据报道每一大类的已知化合物都有数千种甚至数万种以上。在次生代谢产物的生产中, 药用植物细胞培养技术是通过给予体外生长的植物细胞一定的营养条件, 使其生长, 并根据植物或植物不同组织的细胞调节生长条件来获取所需的次生代谢产物的生物技术。由于植物体内的任何一个细胞都包含有整体植物全部的遗传信息, 在
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2g /人, 500万人/年 1000kg/年
实际销量
350 kg/年
紫杉醇供需相差十分悬殊
30
25 25
20
20
18.2
14.8 15
12
10 6.6
5
3.4
0.8
0
1992 1994 1995 1998 1999 2000 2001 2002
图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）
1000 800 600 400 300
自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较
生产方式
生产周期
紫草宁含量（％干重）
完整植物
2～3年
1～2
植物细胞培养
3周
14
• 细胞培养是生产次生代谢产物的理想途径： ①缩短周期，提高生产效率
植物细胞培养生产周期为15-30d；而完整植株生长短则几个月， 长则数年，如木瓜8个月，而紫草为5年
②易于管理，减轻劳动强度 ③培养在无菌条件下进行，可排除病虫害干扰 ④可探索新的合成路线，获得新的有用物质
药源问题解决办法（三）
– 生物方法
• 组织和细胞培养
• 微生物发酵
• 生物合成
研究阶段
红豆杉生物合成途径基本明确 10种相关酶基因被克隆表达 利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量
1.2 获得植物次生代谢产物的方法
从植物中提取 化学合成
植物细胞大规模培养生产次生代谢产物
植物细胞具有形态全能性，化学全能性 （在离体的条件下可以合成整株植物能合成的物质）
700岁的红豆杉惨遭剥皮
药源问题解决办法（一）
– 人工栽培
采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉 幼苗
– 寻找红豆衫的替代物
从红豆杉非树皮部位提取 产紫杉醇的非红豆杉植物
药源问题解决办法（二）
– 化学合成 • 全合成
1994年获得成功 现有六种途径
• 半合成
以10-DABⅢ和Baccatin Ⅲ作为半合成原料获得紫杉醇
有效成分含量高。 次生产物的产量=细胞量*细胞次生代谢产物的产率
可控
遗传因素决定
植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能 力弱、易聚团等特点。
植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有 利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累 和分离。
适合植物细胞培养的反应器应具有适宜 的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。
1.3 植物细胞悬浮培养：即是将植物细胞或小 的细胞团在液体培养基中进行大规模培养
的技术。
成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：
分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50个细胞以下，在实 际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
细胞分裂快，均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬 浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈 鲜艳的乳白或淡黄色。
480 350
1000 780
620
200
0 2000年
2002年
2004年
需求量
图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）
药源问题
• 红豆杉
主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物 种之一
• 生长缓慢 分布有限 Taxol含量低
树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人
高产细胞系的筛选过程
⑴选定特定起始材料
①准确选择能够产生目的代谢产物的植物种类、品种或单株 ②应尽量选择自然状态下产生天然产物的组织或器官为外植体
2 细胞的初始培养
实验中获得适宜于悬浮培养的细胞系的过程 称为细胞的初始培养。
2.1建立悬浮系
获取悬浮培养的细胞
酶解法 愈伤组织培养法
细胞的振荡培养
使细胞团分散 促进气体交换
培养方式：
搅拌培养； 旋转振荡培养； 旋转培养
2.2 建立良好的悬浮系的关键环节
1. 选择适宜的外植体
双子叶植物：幼胚、成熟胚、下胚轴、叶片 单子叶植物：幼胚、成熟胚、幼穗、花药等
植物细胞悬浮培养及次生代谢 产物生产
• 1983年，日本三井石油化学工业公司在世界 上首次成功地采用紫草细胞培养工业化生产 紫草宁。
北京锦绣大地农业股份有限公司
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1 植物次生代谢产物概述 2 细胞的初代培养 3 高产细胞系的筛选 4 植物细胞悬浮培养方法 5 植物次生代谢物质生产
1.1 植物代谢产物 （1）初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必
须的代谢。初生代谢过程中形成的各种产物为初 生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易 发生转化。
（2）次生代谢：建立在初生代谢基础上，对于植
物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为 次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物， 比较稳定，可以在体内积累。
2. 诱导疏松愈伤组织；
培养基 愈伤组织的异质性； 继代培养
3. 选择适宜的培养基；
基本培养基+CTK/AUX+天然复合物
eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE
培养基的PH
李忠光，龚明. 2006.7
4. 悬浮培养初期的控制 转速，光，温度
5. 悬浮细胞的继代与选择 继代中收集小的细胞团 条件培养基：新鲜培养基
3 高产细胞系的筛选(P113)
3.1高产细胞系 筛选的整体思路
外植体
愈伤组织的诱导筛选
悬浮培养细胞
高产细胞系筛选
高产细胞系的建立
高产细胞株系的特点
• 培养细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定 的产物
• 细胞生长及产物合成的速度快，在较短的时间内 能得到较高产量的终产物
• 代谢产物要在细胞中积累，而不被迅速分解，最 好能将其释放到培养基中
类别
黄酮
酚 类 化 合醌 物
简单酚类
次生代谢产物 用途
银杏黄酮，大豆黄酮 治疗心血管疾病
紫草宁 香豆素
抗菌、抗炎、抗病毒、止血 香料，抗菌消炎
萜
类
生物碱
紫杉醇 青蒿素
长春新碱 奎宁
抗癌 抗疟疾
抗癌 抗疟疾
长春碱： ＄ 2 million/kg 长春新碱： ＄ 15million/kg
• 李时珍在《本草纲目》中所开列的1892种药物 绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定 药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产 物。天然的次生代谢产物已经超过2万种。
次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加 剂、工业原料等。
紫杉醇简介
• 紫杉醇：二萜类化合物 Байду номын сангаас 最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分
离 • 广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌
等十几种癌症 • 目前主要来源于红豆杉属植物
市场需求
抗癌一线用药
销售额年增长率5亿美元