偶联条件的选择

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亲和层析法分离生物大分子示意图
a.
配基 待分离的 生物分子
b.
载体 手臂 配基 亲和吸附剂
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c.
样品
杂质
d.
与待分离物质 专一可逆结合 的物质
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亲和层析介质的制备
配基的选择：选择合适的配基是亲和层析中的重要环节， 配基可以是有机小分子、生物大分子、染料等。根据待分离 物质在溶液中与配基之间的亲和力的大小和专一性等特性进 行选择，通过实验来确定理想的配基。例如选择酶的竞争性 抑制剂、底物和辅助因子类配基可以纯化酶，选择互补的碱 基序列、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白类配基可以纯 化核酸等等。在亲和层析中，分离生物大分子的配基必须有 适当的化学基团能与活化基团发生偶联作用，有较高的偶联 率，偶联后配基和被分离生物大分子的专一结合特性不变， 有效地分离目标产物；解吸附时不破坏生物大分子的生物活 性和理化性质。
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常用活化剂：活化剂一般用溴化氰和环氧氯丙烷较多，二 者各有利弊： (1)溴化氰：溴化氰活化载体是目前用得最多、效果最好 的活化方法。活化效率高，速度快。缺点是溴化氰容易分解产 生剧毒的氢氰酸及溴，活化臂短，不利于生物大分子的结合。 (2)环氧氯丙烷：环氧氯丙烷活化效率高，活化臂较长， 有利于生物大分子的结合。毒性很小，可以在常规条件下操作。 缺点是活化温度较高，45－50℃，活化时间较长。
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将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基， 与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲 和吸附剂，当被分离物随着流动相经过亲和吸附剂时，亲 和吸附剂上的配基就有选择地吸附待分离物质，通过解吸 附使待分离物质得以纯化。
亲和层析的优点：专一性结合，分辨率高，操作简单， 通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质；具有浓缩 作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品；利用 生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够 很好地保持样品原有的生物学性质。
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亲和层析原理
有很多生物大分子与相应的分子间具有专一的可逆 结合的特性，如酶与其底物、抑制剂、辅助因子，抗体 与抗原，核酸与互补的碱基序列、核酸聚合酶、结合蛋 白，激素与其受体、载体蛋白，细胞与其表面特异蛋白 等等，它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这 种专一的可逆结合力的称为亲和力。亲和层析的方法就 是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原 理建立和发展起来的。
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琼脂糖凝胶：目前应用最多的是瑞典Pharmacia公司生 产的Sepharose，它具有理想载体的特性，由D-半乳糖和 3,6-脱水-L-半乳糖交替结合而成的大分子多聚糖，靠糖链之 间的次级键交联成的稳定网状结构的珠状凝胶，改变琼脂糖 浓度可控制网孔的大小。如Sepharose 2B，4B和6B，其中 阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量，机械强度随凝胶浓 度降低而减弱。目前广泛使用Sepharose 4B来分离生物大 分子， 本实验采用的是本院自己研制的Sepharose QT4， 相当于Sepharose 4B。琼脂糖凝胶的多聚合链不是由共价 键连接而成的，在使用中应当注意的问题有受热失去稳定性， 引起部分溶解，故不宜加热消毒，低温保存，冻结会破坏其 结构，要避免在pH低于4高于9下长期工作，使用破坏氢键 的试剂会降低凝胶的稳定性，一般情况下不能进行干燥，适 宜湿态保存。
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谷胱甘肽转硫酶简介
谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases， 简称GSTs，EC2.5.1.18）广泛存在于动物和人体的 各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性 蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的 同工酶家族，均为由两个亚基组成的二聚体，相对分 子质量为45 000—49 000，各同工酶的等电点不同， 多为碱性同工酶。
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载体的选择：亲和层析的载体一般是凝胶类层析介 质。一般比较理想的载体应具备稀松的多孔网状结构， 对于溶液具有良好的亲水性、流动性和渗透性，大孔径 凝胶介质可以有效地使凝胶内部的羟基得到活化，以保 证较高的活化效率，提高了配基的有效浓度，提供较高 的亲和容量；必须有足够数量的化学基团，经化学方法 活化后，可以与大量的配基相偶联；具有良好的机械性 能，保证亲和柱维持较好的流速；必须是不溶于水、化 学惰性的，非特异性吸附作用弱；有良好的物理和化学 的稳定性，在配基偶联、亲和层析、再生处理过程中不 会因离子强度、温度、pH的变化，变性剂、去污剂的应 用而破坏载体的物理化学结构，在介质的反复使用过程 中能抗微生物和酶的侵蚀。
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偶联条件的选择： (1)偶联pH值：配基偶联最佳pH在8-10之间最有效，在 这个pH范围内配基上的氨基多是非质子化形式，要尽可能地 选用碱性条件。但是在高pH值时，配基的高级结构可能会改 变，甚至失活，所以偶联时pH的选择要根据具体情况而定。 (2)偶联温度和时间：溴化氰活化的载体，一般都在4℃左 右偶联过夜，也可以室温（20-25℃）下反应2h。环氧氯丙烷 活化的载体，一般在35－45℃偶联。偶联时间要根据配基的 浓度来确定，一般情况要16－24小时。 (3)偶联配基的浓度：偶联时并不总是需要大量的配基才 能制成高效的亲和吸附剂，高浓度配基的偶联可以增加结合强 度、空间位阻和非特异性结合，空间位阻可使亲和吸附剂结合 效率的降低，尤其是当高浓度大分子蛋白被偶联时。对于多数 亲和吸附剂选用的配基浓度是1-20µmol/mL gel，2µmol/mL是 最常用的配基使用量。
谷胱甘肽转硫酶的制备 及动力学研究
实验内容： （一）亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 （二）测定酶活力、米氏常数和最大反 应速度 （三）Folin-酚法测定蛋白质含量，计 算比活力
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课前思考题


1. 关于谷胱甘肽转硫酶。 2. 生物大分子的制备前期实验材料的预处理和蛋白 质的提取方法。 3. 亲和层析的原理，影响亲和层析的因素。 4. 关于配基、载体及配基的偶联。 5. 本实验中Buffer A和B中各组分的作用是什么？ 6. 实验中应注意的问题。
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兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
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GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化 物的解毒作用，GST催化这些带有亲电中心的 疏水化合物与还原型谷胱甘肽（GSH）的亲核 基团GS－反应，中和它们的亲电部位，使产物 水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物 为巯基尿酸，被排出体外，从而达到解毒目的。 另外，GST还能共价或非共价地与非底物配基 以及多种疏水化合物结合，具有结合蛋白的解 毒功能。