检验-流式细胞分析仪器与技术
临床医学检验技术(士)-流式细胞仪分析技术及应用(精选试题)
临床医学检验技术（士）-流式细胞仪分析技术及应
用
1、流式细胞仪技术中，表示细胞内颗粒复杂程度的指标是
A.前向角散射光信号
B.侧向角散射光信号
C.自发荧光信号
D.激发荧光信号
E.特异荧光信号
2、流式细胞仪技术中，表示细胞体积大小的指标是
A.前向角散射光信号
B.侧向角散射光信号
C.自发荧光信号
D.激发荧光信号
E.特异荧光信号
3、荧光染料应有较高的
A.量子产额和消光系数
B.吸收
C.波长差
D.标记染色
E.荧光信号
4、发射光波长与激发光波间有较大的
A.量子产额和消光系数
B.吸收
C.波长差
D.标记染色
E.荧光信号
5、荧光染料对488nm激发光波长有强的
A.量子产额和消光系数
B.吸收
C.波长差
D.标记染色
E.荧光信号
6、多参数定量测定和分选的技术称
A.荧光免疫分析
B.酶联免疫分析
C.流式细胞免疫分析
D.化学发光免疫分析
E.放射免疫分析
7、流式细胞仪采集的荧光信号反映
A.细胞的大小
B.细胞的寿命
C.细胞内部结构的复杂程度
D.细胞表面的光滑程度
E.被染成荧光部分细胞数量的多少
8、关于液流系统的鞘液，下述哪项是不正确的
A.鞘液是辅助样本被正常检测的基质液
B.鞘液是用来与样本作对比的
C.鞘液包裹在样本流周围
D.使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确性
E.防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞
9、分选速度与细胞悬液中分选细胞的下述哪项直接相关
A.细胞含量
B.细胞性质
C.细胞大小
D.有否胞膜
E.单核或多核
10、流式细胞术细胞分选的技术要求包括
A.分选速度
B.分选纯度
C.分选收获率
D.分选得率
E.以上均是
11、AIDS免疫功能的检测最重要的检测手段是
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述
流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）
基本组成结构
1.液流系统由样本和鞘液组成。待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它能够对细胞进行快速、高效、准确的分析和排序。流式细胞仪的工作原理基于光学和流体力学原理，下面将详细介绍其工作原理。
1. 光学系统
流式细胞仪的光学系统包括激光器、光学透镜、滤光片和光电探测器等。激光
器产生高能量的单色光束，常用的激光器有氩离子激光器、固态激光器和半导体激光器等。光学透镜用于聚焦激光束，使其能够准确地照射到待测样品上。滤光片用于选择特定波长的光线，以便对不同的细胞成份进行分析。光电探测器用于接收样品中散射或者荧光产生的光信号，并将其转化为电信号。
2. 流体力学系统
流式细胞仪的流体力学系统主要包括进样系统、流动装置和排样系统。进样系
统用于将待测样品引入流式细胞仪中，通常通过吸管或者自动进样器实现。流动装置通过施加适当的压力，将样品推动至流动池中，并保持样品在流动池中形成单个细胞的流动状态。排样系统用于将已经分析过的样品排出流式细胞仪。
3. 细胞分析
当样品进入流动池后，激光束照射到细胞上，细胞会发生散射和荧光现象。流
式细胞仪通过光电探测器接收细胞产生的散射光和荧光光，并将其转化为电信号。根据细胞的大小、形状、颜色和荧光强度等特征，流式细胞仪可以对细胞进行分类和分析。
4. 数据分析
流式细胞仪将采集到的电信号转化为数字信号，并通过计算机进行处理和分析。计算机软件可以根据用户的需求，对细胞进行分类、计数和定量分析。用户可以根
据细胞的特征，绘制散点图、直方图、柱状图等图形，以便更直观地观察和分析细胞的特征。
总结：
流式细胞仪主要技术参数
流式细胞仪主要技术参数：
1.光学系统：
1.1激光器配置:配置488nm ,638nm和405nm固体激光器，功率均≥50mw，激光功率可由
软件实时监控，空间独立排列
1.2▲检测通道设置：488nm激光可激发五色荧光，638nm激光可激发三色荧光， 405nm
激光可激发五色荧光，共13色荧光通道，以及前向角散射光检测通道（FSC）和侧向角散射光检测通道(SSC)。
1.3光路设计：固定校准的光路设计，每根激光间信号独立传播。用户可自行安装开机，
无需专业人员调校
1.4采用最新的的FAPD（Fiber Array Photo Detector）检测器，能够达到5倍于传统高
性能PMT的光电转换效率
2.分析性能：
2.1 ▲荧光灵敏度：FITC的荧光灵敏度≤30 MESF，PE的荧光灵敏度≤10 MESF
2.2 荧光分辨率：CV≤2%（G0/G1期最高峰）
3.电子系统：
3.1 信号处理精度：24比特（16,777,21道）数字信号精度
3.2 高达107的线性动态范围，可以将高信号和低信号都完全显示在一张图上
3.3 ▲支持多色荧光信号共同采集，15个参数检测时，信号获取速度（上样速度）达到30,000个/秒以上
4.液路系统：
4.1自动化上样系统，具有自动混匀和内外管壁自动清洗功能，降低样本间交叉污染
4.2可支持多种常用的进样管，如5 mL的聚苯乙烯和聚丙烯流式管,1.5 mL 和 2 mL EP管4.3内置自动化的液流系统维护程序，例如开关机程序、启动（初始化）、每日清洗、排气
泡、反冲等全部由自动软件控制。
临床免疫学检验第二十二章 流式细胞仪分析技术及应用
第二十二章流式细胞仪分析技术及应用
本章要点
1.流式细胞仪的分析及分选原理
2.数据的显示与分析
3.流式细胞仪免疫分析的技术要求
4.流式细胞术在免疫学检查中的应用
概述：流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。流式细胞仪：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。
第一节流式细胞仪的分析及分选原理
流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
一、工作原理
（一）基本组成结构
1.流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度<10m／s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
2.激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配合氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ，为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料
流式细胞仪检测技术与质量控制
流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法
1.1 标本收集
收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法
2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。
2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。
流式细胞仪在临床检验中的应用
流式细胞仪在临床检验中的应用
流式细胞仪在临床检验中的应用
介绍：
流式细胞仪是一种现代化的生命科学仪器，能够对细胞进行快速、准确的分析和排序。它通过利用激光器产生的光与细胞相互作用，获取细胞的多种信息，可以广泛应用于临床检验中。
章节一、流式细胞仪的原理
1.1 激光器光源
1.2 光学系统
1.3 流式细胞仪的探测系统
1.4 数据采集与分析系统
章节二、流式细胞仪的标记和染色技术
2.1 细胞表面标记物的检测
2.2 细胞内标记物的检测
2.3 细胞染色技术的选择与优化
章节三、流式细胞仪在血液学检验中的应用
3.1 血常规检验
3.2 免疫表型分析
3.3 流式细胞术在白血病诊断中的应用
章节四、流式细胞仪在免疫学检验中的应用4.1 免疫细胞亚群分析
4.2 免疫功能检测
4.3 炎症指标检测
章节五、流式细胞仪在肿瘤学检验中的应用5.1 肿瘤细胞检测
5.2 肿瘤干细胞检测
5.3 肿瘤微环境分析
章节六、流式细胞仪在其他临床检验中的应用6.1 全血凝块分析
6.2 骨髓移植前检验
6.3 器官移植免疫监测
附件：
本文档的附件包括：
附件1：流式细胞仪操作手册
附件2：流式细胞仪数据分析软件说明书
附件3：流式细胞仪标记和染色试剂使用手册
法律名词及注释：
1、《医疗器械管理条例》：指中华人民共和国国务院于2000年通过的关于医疗器械管理的法规。
2、《临床实验室管理条例》：指中华人民共和国国家卫生计生委于2000年颁布的关于临床实验室管理的法规。
3、《医学伦理学指导原则》：指国际上广泛采纳的医学伦理学准则，包括尊重人的尊严、权益和自主决策能力等原则。
流式细胞检测技术员工作职责
流式细胞检测技术员工作职责
流式细胞检测技术员是生物医学领域中重要的职业之一。他们
主要负责分离、分析、鉴定和计数细胞，通过流式细胞仪等设备，
检测细胞的成分、形态、数量等重要特征。流式细胞检测技术员的
工作职责包括以下几个方面：
1. 操作流式细胞仪：技术员需要掌握流式细胞仪的原理和操作
方法，能够熟练地使用相关软件，进行样品分析、数据采集和分析
处理等工作。他们需要对仪器的运转情况进行监控和维护，确保其
正常的运转和可靠性，在使用过程中要遵守相关的安全规定和操作
规范。
2. 细胞样品的制备与处理：技术员需要从样品中提取细胞、维
持细胞的生长或培养，并根据实验要求进行必要的处理。例如，使
用激光切割工具切割样本，或使用酶、药物等进行处理等。
3. 数据分析和解释：技术员需要掌握各种数据分析方法和工具，对测试结果进行分析和解释。他们需要熟练掌握流式细胞仪的参数
设置和数据收集方法，能够分析和处理数据，制作数据图表和报告，向实验室负责人和其他团队成员汇报分析结果。
4. 实验室管理和维护：技术员需要遵循实验室的安全管理规定，确保实验室的卫生、安全和环境保护。另外，他们需要管理和维护
实验室仪器和设备的使用情况，及时处理设备故障并保持仪器的正
常运转。
5. 科研项目的支持：技术员需要参与实验室的科研项目并提供
相关技术支持，例如设计实验方案、协助完成实验，作出数据报告
等。此外，他们还需要不断学习和研究最新的技术和方法来支持实验室的科研工作。
流式细胞仪操作步骤
流式细胞仪操作步骤
一、样品准备
1. 确认样品是否符合实验要求，如细胞浓度、荧光标记等。
2. 根据实验需求，选择合适的试管和细胞样品。
3. 确认样品中是否有杂质或污染物，必要时进行离心和洗涤。
4. 尽可能缩短样品处理时间，避免细胞活性受到影响。
二、样品上机
1. 打开流式细胞仪，确认仪器正常工作。
2. 将样品加入到流式细胞仪的样品管中。
3. 根据实验需求，设置合适的流速和压力。
4. 开始采集数据，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
三、参数设置
1. 根据实验需求，选择合适的荧光标记和检测参数。
2. 根据细胞类型和特性，设置合适的门控和阈值。
3. 确认仪器校准和定标工作已完成。
4. 根据需要，设置多色分析，以便于进行细胞分群和定量分析。
四、数据采集
1. 在采集数据时，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
2. 根据实验需求，确定采集的数据量，确保数据具有代表性。
3. 记录采集数据的时间和条件，以便于后续数据分析。
4. 在采集数据时，注意观察细胞活性、浓度和分布情况，及时调整实验条件。
五、数据分析
1. 使用专业软件对采集的数据进行处理和分析。
2. 根据实验需求，对数据进行去噪、归一化和定量分析。
3. 进行细胞分群、细胞周期和细胞凋亡等分析。
4. 对数据进行统计学分析和可视化展示。
六、结果输出
1. 根据分析结果，输出相应的图表和数据表格。
2. 对结果进行解释和注释，以便于读者理解和应用。
3. 如果需要，可将结果整理成报告形式，提供给相关人员参考和使用。
七、质量控制
八、实验室清理
流式细胞仪在检验医学中的应用
流式细胞仪在检验医学中的应用
流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种对流体中的细胞或生物粒子逐个进行多参数的快速分析和分选的技术。FCM的基本原理是用激光测量鞘流中染色细胞标记物的荧光强度和宽度、前向散射光强度和宽度、侧向散射光强度和宽度等参数，由于荧光标记的单克隆抗体不同，即可定量测出细胞上的不同抗原物质来区分细胞、分析细胞成分。因此，FCM是细胞生物学、分子生物学、分子免疫学、单克隆抗体技术、激光技术、电子计算机技术等学科高度发展、综合的结晶。FCM的应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究，为微观认识细胞及横向比较其特征提供了精密、准确的方法。自1973年BD公司生产出世界上第一台流式细胞仪以来，它以其快速、灵活、灵敏、定量的特性，广泛应用检验医学中的细胞分析、肿瘤分析、白血病分析、遗传学分析、免疫状态分析、微生物分析、血栓与止血分析、流行病学分析等多方面。随着单克隆抗体技术的不断发展，FCM的应用领域将会随之扩大。流式细胞仪已经是检验科用于临床和科研的必备仪器。
1。监测细胞免疫状态
细胞免疫功能不但与恶性肿瘤、免疫系统的疾病有关;而且还与为数众多的受神经内分泌--免疫功能轴影响的状态或疾病有密不可分的联系。因此监测免疫状态如同检查神经和内分泌功能一样重要。流式细胞术提供了简捷地检测淋巴细胞亚群的方法，1993年在波士顿召开的人类白细胞分化抗原会议(leukocyte differentiation antigen，HLDA),将CD抗原(cluster of differentiation)分为T细胞、B细胞、髓细胞、血小板、内皮细胞、自然杀伤细胞、活化抗原、粘附因子、细胞因子和细胞因子受体等九个组，确立了48种新抗原。到2000年7月，第七届人类白细胞分化抗原会议的召开，CD抗原已达200种。CD系列在免疫学中常
流式细胞仪的基本组成和工作原理
流式细胞仪是一种能够对细胞进行高效快速检测和分析的先进仪器，
广泛应用于医学、生物学、药学等领域。它通过对细胞进行单个分析，能够提供更加详细和精确的数据，对细胞的分类、计数、表面标记物
分析等方面都有着重要的应用价值。在进行流式细胞仪的选择和使用
之前，了解其基本组成和工作原理是非常重要的。
一、流式细胞仪的基本组成
流式细胞仪主要由激光器、光学系统、流动系统、检测系统和数据分
析系统等组成。
1. 激光器
激光器是流式细胞仪的激发光源，通常采用氩离子激光器、固体激光
器或半导体激光器。激光器能够提供高强度、单色、准直、相干的激
发光源，用于激发待检测细胞中的荧光标记物。
2. 光学系统
光学系统包括聚焦物镜、滤光镜、物镜和检测器等部分，用于将激发
光源聚焦到待检测的细胞上，并收集样品发出的荧光信号。光学系统
的设计和性能对流式细胞仪的灵敏度和分辨率有着重要的影响。
3. 流动系统
流动系统用于将样品中的细胞单个输送到激光束中进行检测。它通常
包括样品注射器、流动池和排液系统等部分，能够实现高速、稳定的细胞输送，保证检测过程的准确性和稳定性。
4. 检测系统
检测系统用于对激发样品中的荧光信号进行检测和测量，通常包括多路光学检测器、光电倍增管、滤光片等部分，能够对不同波长的荧光信号进行高效、快速的检测。
5. 数据分析系统
数据分析系统用于对检测到的荧光信号进行处理和分析，通常包括计算机、数据采集卡、数据处理软件等部分，能够提供多种数据处理和分析功能，帮助用户快速、准确地获取所需的数据信息。
二、流式细胞仪的工作原理
流式细胞仪的工作原理主要包括样品注射、激发和检测、数据采集和分析等步骤。
医学-流式细胞仪简介和使用方法
注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸
为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于NH4CL的BD 公司的FACSLyse溶血剂。
优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上可清楚地
将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。
缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，
随时间细胞形态变化大。
二、0.1% BSA-PBS缓冲液
1. 准备500ml，PH7.3 PBS 2. 加入5ml 10% BSA 3. 使用0.45um滤网过滤
三、氯化铵溶血剂
1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 调节PH值至7.2 3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤
流式细胞仪标本处理一般原则及方法 流式细胞仪使用一般方法及技巧
李爱军 渭南市中心医院检验科
第一部分
流式细胞仪标本准备 染色的一般原则及方法
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。 根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。
可用的抗凝剂如下：
EDTA： 2mg/ml 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml
操作
1. 将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离； 2. HBSS或PBS洗清 3. 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS； 4. 37ºC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；
流式细胞仪在医学检验中的应用
流式细胞仪在医学检验中的应用
流式细胞仪是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器［1］。概括来讲，流式细胞术就是对于处在快速直线流动中的细胞或生物颗粒进行多参数的快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器的问世，科技工作者进行了不懈的努力。随着各相关技术的迅速发展，流式细胞术已经成为日益完善的细胞分析和分选工具。目前，流式细胞仪已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域［2］。我科于2010年6月引进了一台BD公司的FACSCalibur流式细胞仪，现已投入到临床的应用中，为临床诊断和科研提供了强有力的手段。现将它的原理及临床应用介绍如下：
流式细胞分析(flowcytometryFCM),又称流式细胞术。其原理是将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统(透镜、光阑、滤片、和检测器等)收集荧光、光散射、光吸收、或细胞电阻抗等信号。计算机系统进行收集、储存，显示并分析被测定的各种信号，对各种指标作出统计分析［3］。
1 流式细胞术在肿瘤学上的应用
利用FCM进行细胞周期分析、DNA 倍体分析、定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等，从而获得组织形态学方法难以得到的信息，可为肿瘤的临床诊断、治疗和预防提供帮助。对肿瘤细胞DNA 含量作定量分析，解析细胞周期，通过细胞异倍体测定预测各种肿瘤的预后，并能在化疗中对药物的选择和放疗中强度、时间的决定等起指导作用。解析抗癌药物作用机制，对癌症进行早期诊断及鉴别良恶性有一定参考价值。此外，由于FCM对凋亡、周期蛋白、癌基因及抗癌基因的研究也发挥着重要作用，近年来引起肿瘤研究者的极大关注，已广泛应用于肿瘤基础和临床研究中，为肿瘤诊断、疗效评价和预后预测提供重要参考指标。另外，传统的细胞形态学至今仍是诊断肿瘤的一种重要的手段。多年来，细胞学工作者就设想使肿瘤细胞学诊断自动化，流式细胞术的问世，使细胞学检查自动化的宿愿如愿以偿，并已广泛应用于肿瘤临床细胞学的诊断研究。
免疫学检验-流式细胞仪分析技术及应用PPT优选课件
细胞学分型法，是以混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture，MLC）或称混合淋巴细胞反应 （mixed lymphocyte reaction，MLR）为基本技术 的 HLA分型法。能用本法测定的抗原称为 LD抗原 （lymphocyte defined antigen），包括 HLA－D、 －DP。 MLC又有单向和双向之分。
第一课件网网站
2020/10/18
1
（一）单向MLC １、阴性分型法 ２、阳性分型法 （二）双向MLC
2020/10/18
2
第三节 HLAห้องสมุดไป่ตู้型的实际应用
• HLA与器官移植 • HLA与自身免疫性疾病 • HLA与输血反应 • HLA与法医鉴定
2020/10/18
3
第二十二章 流式细胞仪分析技术及应用
2020/10/18
4
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THANK YOU FOR YOUR GUIDANCE.
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汇报人：XXX 日期：20XX年XX月XX日
guava 流式细胞仪 技术参数
guava 流式细胞仪技术参数
Guava流式细胞仪技术参数
引言：
Guava流式细胞仪是一种常用的生物实验仪器，用于细胞分析和排序。它具有高灵敏度、高通量和快速分析的特点，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物筛选等领域。本文将介绍Guava流式细胞仪的主要技术参数，包括仪器结构、性能指标和应用范围等方面。
一、仪器结构
Guava流式细胞仪由光学系统、流体系统、电子系统和数据分析系统等几个部分组成。
1. 光学系统：包括激光源、光栅和光电探测器等。激光源产生激光束，光栅用于分光，光电探测器用于接收散射光、荧光信号等。
2. 流体系统：包括进样系统、流体控制系统和废液处理系统等。进样系统用于将待测样品引入流式细胞仪，流体控制系统用于控制进样速度和流速，废液处理系统用于排除已经分析过的样品。
3. 电子系统：包括信号放大器、数据采集器和控制器等。信号放大器将光电探测器接收到的微弱光信号放大，数据采集器将放大后的信号转换为数字信号，控制器控制整个流式细胞仪的运行。
4. 数据分析系统：包括数据处理软件和结果展示界面等。数据处理软件用于对采集到的数据进行分析和处理，结果展示界面用于显示实验结果。
二、性能指标
Guava流式细胞仪的主要性能指标包括散射信号检测范围、荧光信号检测范围、灵敏度、分辨率和通量等。
1. 散射信号检测范围：指流式细胞仪可以检测到的散射光信号的范围。通常分为前向散射、侧向散射和反向散射三个方向。
2. 荧光信号检测范围：指流式细胞仪可以检测到的荧光信号的范围。不同的荧光染料具有不同的发射波长，流式细胞仪需要具备相应的波长范围的荧光探测器。
流式细胞仪原理及应用
流式细胞仪原理及应用
流式细胞仪是一种用于细胞计数和表征的仪器，它基于细胞在流体中流动并通过光源的原理。以下是流式细胞仪的原理和一些常见应用。
原理：
1. 细胞准备：样品中的细胞首先需要进行适当的处理，包括细胞分离、去除细胞团块和杂质等，以确保流经流式细胞仪时的均匀性和准确性。
2. 细胞传递：样品中的细胞通过封闭的通道流动，形成单个细胞的串行排列，以便每个细胞能够单独接收光信号。
3. 激光照射：流式细胞仪使用激光器产生高强度的单色光束，照射到细胞上。
4. 光散射和吸收：细胞与经过的激光光束相互作用，发生光散射和吸收现象。这些现象提供了关于细胞大小、形状、复杂度和细胞表面分子的信息。
5. 光信号收集：流式细胞仪使用多个光学组件和探测器来收集光信号。不同的检测器可以收集不同的光散射角度和波长的光信号。
6. 数据分析：收集到的光信号通过计算机进行处理和分析，可以获得细胞的数量、计数、分类和细胞表面分子的信息。
应用：
1. 细胞计数：流式细胞仪可以快速准确地计数细胞数量，并提供关于细胞浓度和细胞增殖的信息。这在生物学研究和临床实验室中非常常见。
2. 细胞表征：通过测量细胞的大小、形状和表面标记物等特征，
流式细胞仪可以对细胞进行表征，并帮助研究人员了解细胞类型和状态的变化。
3. 免疫细胞分析：流式细胞仪可以用于免疫学研究，如分析免疫系统中的不同细胞亚群、检测细胞表面抗原、测量细胞分泌物和研究细胞凋亡等。
4. DNA和蛋白质分析：通过使用荧光染料或抗体标记，流式细胞仪可以实现对DNA含量、染色体多样性以及特定蛋白质的定量和定位分析。
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信号检测系统
3
组成 ：光电转换器、放大器和信号处理电路 作用 ：将产生的各种光信号成比例的转换成电信 号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据 采集和分析。
数据分析与显示系统
4
设门（gating）是流式细胞仪分析中的一种重 要技术，只有通过最佳的设门方式，才能准 确地获取和分析。 “设门” 是指在细胞分布图中，根据该图 的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞 群。 通过“设门”得到不同的 区域 （Region）。从而对其中的细胞进行单参数 或多参数分析。
第二节流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括鞘液流和样品流 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区
理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且 在特定的时间内，应该只有一个细胞或生物微粒 通过激光束。
流 动 室 和 液 流 驱 动 系 统
流动室——仪器的核心部件，待测样品与激光在 这里相交，通常由有机玻璃、光学玻璃或石英等 制成。 流动室内充满了鞘液，使细胞排成单列进入流动 室喷嘴口，形成细胞液柱。
流式细胞仪的检测信号
荧光信号
激发光源 弧光灯 采用高压汞灯， 廉价、激发光谱 广泛，但在单一 谱线上能量较弱 ，且功率不够稳 定，应用受到一 定限制 激光 提供单波长、高 能量、高稳定性 的光照，是快速 、准确分析细胞 微弱光的理想光 源。现代流式细 胞仪多采用激光
光学收集系统 光学收集系统：主要由多组透镜、滤光片和分光 镜等光学元件组成，将不同波长的光信号送入不 同的探测器 1）长通滤片（long pass filter，LP ) 滤片
激光探测器
侧向角散射光（SSC）
激光器
侧向散射光探测器
流式细胞仪的检测信号
散射光
Right Angle Light Detector Cell Complexity
Incident Light Source
Forward Light Detector Cell Surface Area
• FSC，前向角散射光，代表细胞大小 • SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度
流式细胞术的分析及分选原理
液流 系统 光学 原理
光学 系统
流式 细胞仪
光电转 换原理
电子 系统
测试 原理
4
激光
光电 倍增管
放大电路
流式细胞仪是集
多种技术为一体的 新型高科技仪器 激光技术 单克隆抗体技术 细胞荧光化学技术 光电测量技术 电子物理技术 电子计算机技术
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
（四）FCM常见荧光染料的种类和特性
尽可能高的光子产量，以提高信号强度
理想 荧光染料
对激发光有较强的吸收，以降低背景噪音
激发光谱与发射光谱之间要有尽可能大的 间隔，以减少背景信号对荧光信号的干扰
易于与被标记的抗原、抗体或其他生物物 质结合，而不会影响被标记物的特性
常用的染料有以下几种：
异硫氰基荧光素（FITC）
FCM能检测到最小颗粒大小
分辨率 分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用 变异系数（CV）来表示。一般要求不大于2%
表面标志物检测准确性与重复性 准确性：检测百分比在给定的范围内。
重复性：一个样本重复检测20次，CV应不大 于10%
分析速度
分析速度以每秒分析的细胞个数来表示。
FCM分选技术要求
细胞分选对仪器的性能要求较高
分选是流式细胞仪的重要功能之一 分选功能的装置较为复杂 分选指标 分选速度 分选收获率
►
分选纯度
分选速度
1
每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度 为10000个/秒左右。 分选纯度
2
目标细胞占分选出细胞的百分比，分选纯度与仪 器配置和细胞是否重叠有关。纯化模式的指标。 分选收获率
2）短通滤片（short pass filter，SP )
3）带通滤片（band pass filter，BP）
长通滤片
只允许特定波长以上的光通过 ，如LP500 滤片，只允许500nm以上的光通过
与长通滤片正好相反 ，只允许特定波长以 短通滤片 下的光通过 ，如SP500滤片，只允许500nm 以下的光通过 只允许相当窄波长范围内的光通过，滤片一 带通滤片 般有两个值，如BP500/50允许通过的波长范 围为475～525nm，中心值为500nm。
（一）外周血单细胞悬液制备
新鲜的外周血是天然的单细胞悬液。 单次密度梯度离心法是最常用于分离制备单个核 细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离外周血中的 单个核细胞。
（二）培养细胞的单细胞悬液制备
悬浮 生长 贴壁 生长
反复吹打
分散 细胞 细胞 脱落
常规 洗涤 低速 离心
低速 离心 漂洗 重悬
单细胞 悬液
多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合 成及抗体标记物的发展。 多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员 的要求较高。
试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。
（三）自发荧光
自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射后 所发出的荧光。 每种细胞群都有不同水平的自发荧光，如淋巴细 胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。 自发荧光易引起信号干扰，出现假阳性结果，在 实际临床检验工作中应注意区别。
流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现 的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的一 个系统。
光学系统
光学激发系统
（1）散射光信号
前向角散射(Forward
（2）荧光信号
Scatter, FSC )
侧向角散射(Side Scatter, SSC)
前向角散射光（FSC）
大颗粒
激光器
激光器
小颗粒
细胞分选原理
当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方的压 电晶体产生机械振动带动流动室以相同频率进行振动， 使液流注断裂成一连串均匀的液滴，仅少量液滴含有细 胞，有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了 被分选的细胞的特性参数时， 此类细胞在形成液滴时 会被充电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参 数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电 极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生 向右或向左的偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分 选的目的。
PNH患者其红细胞、粒细胞、淋巴细胞表面的 CD55、CD59抗原明显减少或消失。
FCM的液流系统
（如何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流驱动系统：包括压缩空气泵、压力传感器、 鞘液过滤器和样本压力调节器等。
常用的液流系统中细胞流和鞘液流的驱动一般采 用正压的方法控制的，保证了鞘液的流速恒定。 鞘液以匀速通过流动室，因此整个液流系统运行 流速是不变的。
光学系统
2
包括光学激发系统和光学收集系统。
设门策略
对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型
分选系统
流式细胞仪的分选是指从细胞群体中分离出感兴 趣的细胞，检测的任意参数都可作为分选时指定 的细胞的依据。 分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
液滴形成、充电、偏转三部分 纯化模式、富集模式、单细胞模式
细胞凋亡检测 细胞周期检测 细胞分选
其他
二、临床诊断中的应用 感染性疾病的诊断
xMAP技术用于病毒和TORCH检测
白血病免疫表型分析
FCM在血液病诊断、治疗和预后判断方面，具有 非常重要的价值。 正确区别急性髓细胞性白血病（AML）和急性淋 巴细胞性白血病（ALL）。
网织红细胞分析
基本原理：用某种荧光染料与网织红细胞内的 RNA结合，再通过流式细胞术检测被染色的网织 红细胞数目
（一）直接免疫荧光染色法
直接免疫荧光染色法是荧光抗体技术最基本、最 简单的方法，多用于细胞表面标志的染色分析。 优 点 ① 操作简单，方法简便、快速 ② 特异性强，与其他抗原交叉染色较少
③ 反应中只有两种因素（细胞与抗体）参与， 结果判断较简单
间接免疫采用生物素偶联抗体
（二）多参数分析时荧光抗体的组合标记
血小板计数
FCM是当前血小板研究中不可缺少的检测工具， 可用于检测血小板的多项指标。 对血小板相关的多种疾病诊断、治疗和预防，以 及抗血小板活化药物的研究、评价及治疗监测等 方面具有重要意义和研究价值。
血小板分析一般通过SSC和FSC散射光对数取样 设门。
PNH诊断
阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一种以补体介导的血 管内溶血为特征的获得性造血干细胞克隆性疾病。
藻红蛋白（PE） 藻红蛋白偶联物 PE-Cy5 藻红蛋白偶联物 PE-Cy7 别藻青蛋白（APC） 得州红（Texas red）
三、对照设置
一）阴性对照
确定非特异性荧光
二）阳性对照 查看抗体的有效性
四、仪器操作
一）仪器的校准 光路和流路的校准 采用荧光微球flow-check计算CV值 PMT校准 采用荧光微球flow-set校准 二）补偿调节 三）阈值设定 采用FSC指标来设定 四）上样速度
第五节Luminex技术
核心技术包括xMAP技术和xTAG技术，新一代诊 断技术平台 技术特点：高通量、高速度、重复性好、线性范 围宽、敏感性高、检测物质广泛、 低样本量、检 测物质广泛、平台拓展性广
第六节 流式细胞术的应用 一、生物医学研究中的应用
淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞亚群的检测已成为某些疾病诊断、疗效 评价和免疫功能检测的常规手段。 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK细胞分析
3
分选出来的细胞占原溶液中该细胞的比例。通常 情况下，分选纯度和收获率是相互矛盾。 富集模 式分选的指标。
其他 荧光线性
稳定性
携带污染率
第四节 流式细胞仪应用的技术要求
一、样品制备
能否制备出合格的单细胞悬液是关系最终分析结 果准确与否的关键。
单细胞悬液大多来自生物样品，不同组织来源的 样本制备方法也不同。
第七章
流式细胞分析仪器与技术
主要内容
1 2
流式细胞仪的工作原理
Fra Baidu bibliotek
流式细胞仪的基本结构
流式细胞仪的主要性能指标 流式细胞仪应用的技术要点
3
4 5 6
Luminex技术
流式细胞术的应用
流式细胞术（flow cytometry ，FCM）是以流式 细胞仪作为检测工具，结合激光技术、计算机分 析技术、流体力学、细胞荧光染色技术和免疫学 技术等学科的理论与技术，对于处在快速直线流 动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快 速定量分析和分选的高新技术 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人 工合成微球等
蛋白酶消化 机械吹打
（三）新鲜实体组织单细胞悬液制备
将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困 难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细 胞的目的又要不损伤细胞。 最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
不论是哪种方法都不可避免的会对细胞表面膜结 构、细胞活性和功能等造成不同程度的损伤。
488 nm 激光
流 式 细 胞 仪 分 选 系 统
前向散射光 检测器
荧光检测器
电磁场
-
+
单个细胞被分类 进入检测管
第三节 流式细胞仪的主要性能指标
灵敏度
分辨率
表面标志物检测准确性与重复性
分析速度 分选指标
其他
灵敏度
荧光灵敏度
仪器能检测到单个微球上标有荧光分子的最小值
衡量FCM检测荧光信号的重要指标 FSC检测灵敏度
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法 和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
（五）活检标本单细胞悬液制备
活检标本及各种内镜取材标本可制备成单细胞悬 液。
一般要求镜检取材标本至少取3块以上。 制备方法与新鲜实体组织基本相同。
（六）脱落细胞的单细胞悬液制备
脱落细胞应去除取材伴随的杂质后，再制备单细 胞悬液。 脱落细胞用流式细胞术检测，是一种更为客观的 检测手段，对临床诊断和治疗很有意义。
二、荧光素标记
FCM主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号， 荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。 直接免疫荧光染色以双色以上分析较为常用。 以FITC和PE组合多见 单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单 一细胞群的抗原检测。