检验-流式细胞分析仪器与技术
细菌学检验-13-流式细胞技术
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
多参数，综合分析
显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200 简单，单参数
（二）散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
第十三章 流式细胞术
流式荧光免疫技术：是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理 化特性进行多参数定量分析和纯化（对特定 群体加以分选）的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（flow cytometry，FCM）：集 激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克 隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
（一）基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
光收集系统：光电倍增管（PMT）
FACSCalibur 光路图
（3）电子数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
FACSCalibur
特点：
光路调节系统固定
自动化程度高
操作简便
使用寿命长
配备1-2根激光
临床型（台式机）
细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
BD LSR
FACS Vantage DiVa
实验七 流式细胞仪检测技术
实验七流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。
各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。
随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。
本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。
当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。
实验七-流式细胞仪检测技术
实验七-流式细胞仪检测技术实验七流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。
各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。
随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。
本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。
当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。
临床医学检验技术(士)-流式细胞仪分析技术及应用(精选试题)
临床医学检验技术（士）-流式细胞仪分析技术及应用1、流式细胞仪技术中，表示细胞内颗粒复杂程度的指标是A.前向角散射光信号B.侧向角散射光信号C.自发荧光信号D.激发荧光信号E.特异荧光信号2、流式细胞仪技术中，表示细胞体积大小的指标是A.前向角散射光信号B.侧向角散射光信号C.自发荧光信号D.激发荧光信号E.特异荧光信号3、荧光染料应有较高的A.量子产额和消光系数B.吸收C.波长差D.标记染色E.荧光信号4、发射光波长与激发光波间有较大的A.量子产额和消光系数B.吸收C.波长差D.标记染色E.荧光信号5、荧光染料对488nm激发光波长有强的A.量子产额和消光系数B.吸收C.波长差D.标记染色E.荧光信号6、多参数定量测定和分选的技术称A.荧光免疫分析B.酶联免疫分析C.流式细胞免疫分析D.化学发光免疫分析E.放射免疫分析7、流式细胞仪采集的荧光信号反映A.细胞的大小B.细胞的寿命C.细胞内部结构的复杂程度D.细胞表面的光滑程度E.被染成荧光部分细胞数量的多少8、关于液流系统的鞘液，下述哪项是不正确的A.鞘液是辅助样本被正常检测的基质液B.鞘液是用来与样本作对比的C.鞘液包裹在样本流周围D.使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确性E.防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞9、分选速度与细胞悬液中分选细胞的下述哪项直接相关A.细胞含量B.细胞性质C.细胞大小D.有否胞膜E.单核或多核10、流式细胞术细胞分选的技术要求包括A.分选速度B.分选纯度C.分选收获率D.分选得率E.以上均是11、AIDS免疫功能的检测最重要的检测手段是A.流式细胞术B.抗体检测C.抗原检测D.病毒学检测E.细胞数量的检测12、正常人外周血中成熟的NK细胞占A.5%B.10%C.15%D.20%E.30%13、在流式细胞仪的分选方面，以下与细胞收获率存在负相关的是A.细胞纯度B.细胞大小C.细胞自发荧光D.细胞颗粒大小E.细胞表面分化抗原14、流式细胞仪的主要组成不包括A.液流系统B.光路系统C.抗原抗体系统D.信号测量E.细胞分选15、流式细胞仪的技术特点不包括A.采用鞘流原理B.以激光做激发光源C.使用散射光检测D.检测荧光信号E.采用电阻抗及化学染色原理16、流式细胞术荧光标记不包括A.标记第一抗体B.直接免疫荧光标记法C.标记第二抗体D.间接免疫荧光标记法E.标记游离的抗原或抗体17、流式细胞术的临床应用不包括A.T淋巴细胞亚群测定B.白血病免疫分型C.弓形虫病的诊断D.原虫的研究E.细菌的检测研究。
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。
二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它可以用于细胞分析、细胞计数、细胞排序等多种实验操作。
它的工作原理基于细胞的光学特性和流体动力学原理。
1. 光学系统流式细胞仪的光学系统包括光源、激光器、物镜和探测器等。
光源通常采用氩离子激光器、固态激光器等，能够提供高强度、单色性好的激光光束。
激光光束经过一系列的透镜和反射镜，聚焦到待检测的细胞上。
物镜用于采集散射光和荧光信号，并将其聚焦到探测器上。
2. 流体系统流式细胞仪的流体系统由进样系统和排样系统组成。
进样系统通过注射器将待检测的细胞悬浮液注入流动腔室，使细胞以单个细胞的形式通过激光束。
排样系统则将已经检测完毕的细胞排出。
3. 光学参数测量当细胞通过激光束时，细胞与激光光束发生相互作用，产生散射光和荧光信号。
流式细胞仪通过探测器测量这些信号，以获取有关细胞的信息。
- 散射光测量：散射光分为前向散射光、侧向散射光和反向散射光。
前向散射光与细胞的大小和形状有关，侧向散射光与细胞的复杂度和颗粒物含量有关，反向散射光与细胞的内部结构有关。
- 荧光信号测量：流式细胞仪可以使用多种荧光染料标记细胞，如荧光蛋白、荧光染料等。
激光光源激发标记的细胞产生荧光信号，探测器测量这些信号的强度和波长，以获取有关细胞的信息。
4. 数据分析流式细胞仪通过软件对测得的数据进行分析和处理。
常见的数据分析包括细胞计数、细胞分类、细胞排序等。
软件可以根据用户的需求进行自定义设置，提供多种参数和图表，方便用户对细胞数据进行深入分析。
总结：流式细胞仪是一种基于细胞光学特性和流体动力学原理的仪器。
通过光学系统和流体系统，它可以实现对细胞的散射光和荧光信号的测量。
通过数据分析软件，用户可以对测得的数据进行进一步的分析和处理。
流式细胞仪在生物医学研究中具有广泛的应用前景，可以匡助科研人员深入了解细胞的特性和功能。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它能够对细胞进行快速、高效、准确的分析和排序。
流式细胞仪的工作原理基于光学和流体力学原理，下面将详细介绍其工作原理。
1. 光学系统流式细胞仪的光学系统包括激光器、光学透镜、滤光片和光电探测器等。
激光器产生高能量的单色光束，常用的激光器有氩离子激光器、固态激光器和半导体激光器等。
光学透镜用于聚焦激光束，使其能够准确地照射到待测样品上。
滤光片用于选择特定波长的光线，以便对不同的细胞成份进行分析。
光电探测器用于接收样品中散射或者荧光产生的光信号，并将其转化为电信号。
2. 流体力学系统流式细胞仪的流体力学系统主要包括进样系统、流动装置和排样系统。
进样系统用于将待测样品引入流式细胞仪中，通常通过吸管或者自动进样器实现。
流动装置通过施加适当的压力，将样品推动至流动池中，并保持样品在流动池中形成单个细胞的流动状态。
排样系统用于将已经分析过的样品排出流式细胞仪。
3. 细胞分析当样品进入流动池后，激光束照射到细胞上，细胞会发生散射和荧光现象。
流式细胞仪通过光电探测器接收细胞产生的散射光和荧光光，并将其转化为电信号。
根据细胞的大小、形状、颜色和荧光强度等特征，流式细胞仪可以对细胞进行分类和分析。
4. 数据分析流式细胞仪将采集到的电信号转化为数字信号，并通过计算机进行处理和分析。
计算机软件可以根据用户的需求，对细胞进行分类、计数和定量分析。
用户可以根据细胞的特征，绘制散点图、直方图、柱状图等图形，以便更直观地观察和分析细胞的特征。
总结：流式细胞仪的工作原理是基于光学和流体力学原理。
通过激光器产生的光束照射到细胞上，细胞会发生散射和荧光现象。
光电探测器接收细胞产生的光信号，并将其转化为电信号。
流体力学系统实现了样品的进样、流动和排样。
计算机软件对采集到的数据进行处理和分析，以便用户对细胞进行分类和定量分析。
流式细胞仪的工作原理使其成为生物医学研究中不可或者缺的工具，可广泛应用于细胞学、免疫学、生物化学等领域。
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
临床免疫学检验第二十二章 流式细胞仪分析技术及应用
第二十二章流式细胞仪分析技术及应用本章要点1.流式细胞仪的分析及分选原理2.数据的显示与分析3.流式细胞仪免疫分析的技术要求4.流式细胞术在免疫学检查中的应用概述：流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
流式细胞仪：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。
第一节流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。
它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
一、工作原理（一）基本组成结构1.流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。
设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度<10m／s。
由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。
流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
2.激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。
常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配合氪离子激光器或染料激光器。
光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。
免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。
将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。
例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料
流式细胞仪检测技术与质量控制流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。
该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。
本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。
当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法1.1 标本收集收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。
由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。
2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR 扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。
本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。
目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。
4 讨论流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。
流式细胞仪在临床检验中的应用
流式细胞仪在临床检验中的应用流式细胞仪在临床检验中的应用介绍：流式细胞仪是一种现代化的生命科学仪器，能够对细胞进行快速、准确的分析和排序。
它通过利用激光器产生的光与细胞相互作用，获取细胞的多种信息，可以广泛应用于临床检验中。
章节一、流式细胞仪的原理1.1 激光器光源1.2 光学系统1.3 流式细胞仪的探测系统1.4 数据采集与分析系统章节二、流式细胞仪的标记和染色技术2.1 细胞表面标记物的检测2.2 细胞内标记物的检测2.3 细胞染色技术的选择与优化章节三、流式细胞仪在血液学检验中的应用3.1 血常规检验3.2 免疫表型分析3.3 流式细胞术在白血病诊断中的应用章节四、流式细胞仪在免疫学检验中的应用4.1 免疫细胞亚群分析4.2 免疫功能检测4.3 炎症指标检测章节五、流式细胞仪在肿瘤学检验中的应用5.1 肿瘤细胞检测5.2 肿瘤干细胞检测5.3 肿瘤微环境分析章节六、流式细胞仪在其他临床检验中的应用6.1 全血凝块分析6.2 骨髓移植前检验6.3 器官移植免疫监测附件：本文档的附件包括：附件1：流式细胞仪操作手册附件2：流式细胞仪数据分析软件说明书附件3：流式细胞仪标记和染色试剂使用手册法律名词及注释：1、《医疗器械管理条例》：指中华人民共和国国务院于2000年通过的关于医疗器械管理的法规。
2、《临床实验室管理条例》：指中华人民共和国国家卫生计生委于2000年颁布的关于临床实验室管理的法规。
3、《医学伦理学指导原则》：指国际上广泛采纳的医学伦理学准则，包括尊重人的尊严、权益和自主决策能力等原则。
流式细胞仪工作原理与应用范围
流式细胞仪工作原理与应用范围2008-11-01 10:30流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。
流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞仪分析技术
流式细胞仪分析技术流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于细胞学和免疫学研究的分析技术。
它结合了光学、生物技术和数字技术，可以迅速、准确地分析单个细胞的形态特征、生理状态、分子表达和细胞功能等。
流式细胞仪分析技术与传统的显微镜观察方法相比，具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高准确性和自动化等优势。
流式细胞仪分析技术的原理是基于细胞在流体中的特性和细胞与激发光交互作用时所产生的光信号。
具体而言，流式细胞仪通过光源产生一束激发光，并经过一系列的光路元件，将光束聚焦在细胞悬液中的细胞上。
细胞在激发光的作用下，会发出散射光和荧光光，然后通过一系列的光学滤波器和光学器件，将光信号转化为电信号，并通过光敏器件转化为数字信号。
最终，这些数字信号可以被计算机采集和分析，从而得到细胞的相关参数和信息。
1.细胞计数和细胞大小测量：流式细胞仪可以通过细胞的散射光信号，计算细胞的浓度和大小。
这对于确定细胞的增殖状态、细胞密度和细胞生长速度等具有重要意义。
2.细胞凋亡分析：流式细胞仪可以通过荧光标记技术，检测细胞凋亡相关的标志物，如细胞膜外磷脂翻转和DNA断裂等。
这对于研究细胞凋亡的发生和调控机制非常重要。
3.细胞表面标记物检测：流式细胞仪可以利用荧光标记的抗体，检测细胞表面的特定抗原或受体，从而研究细胞的分型、功能和相互作用等。
这对于免疫细胞的表型分析和免疫细胞亚群的鉴定非常有价值。
4.荧光蛋白标记检测：流式细胞仪可以利用荧光蛋白标记，检测细胞内特定蛋白的表达水平和分布情况。
这对于研究基因表达调控和蛋白质相互作用等具有重要意义。
总之，流式细胞仪分析技术在生命科学研究中起到了重要的作用。
它可以为研究人员提供关于细胞数量、大小、形态、生理状态、分子表达和细胞功能等多样化信息，为细胞学和免疫学的基础研究、新药研发和临床诊断等方向提供有力的支持。
随着技术的不断发展和改进，流式细胞仪分析技术将在未来发展得更加成熟和广泛应用。
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料介绍流式细胞仪是一种常见的生物学实验仪器，可用于快速分析、定量和分选单个细胞。
它以极高的灵敏性和精度，使其成为现代生命科学中最重要的工具之一。
流式细胞仪的应用范围非常广，包括细胞免疫学、药理学、细胞周期分析、基因表达分析等等。
本文档旨在介绍流式细胞仪的基本工作原理、检测技术和质量控制方法。
工作原理流式细胞仪通过吸收、散射和荧光等特定光学信号来检测和分析细胞。
它的核心组成部分是荧光染料和激发光源，荧光染料可以与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物，激发光源可以激活荧光染料的荧光信号。
当样品通过流式细胞仪时，细胞和细胞复合物被单独地呈现在流体中，并且被一个聚光镜系列扫描，采集特定的光学信号。
通过分析该信号，流式细胞仪可以确定每个单一细胞的荧光特性。
检测技术荧光检测流式细胞仪常用的检测方法是荧光检测。
它需要将荧光染料与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物。
流式细胞仪将样品置于聚光镜下，激发光源激活荧光染料的荧光信号，然后通过聚光镜采集荧光信号。
荧光检测既可以用来鉴定单个表面标记物，也可以用于检测内部标记。
散射检测散射检测是流式细胞仪的另一种找出单个细胞的方式。
散射检测基于细胞对激光束的散射表现，散射强度既可以用来区分不同类型的细胞，也可以用于估计细胞的大小、形状和结构。
生物素-亲合素检测生物素-亲合素检测是流式细胞仪常用的一种检测方法。
生物素-亲合素检测通过不同的化学偶联对荧光染料进行标记，使得检测定量更加精确。
质量控制流式细胞仪的检测结果受多种因素的影响，因此需要严格的质量控制程序来保证检测结果的准确性和可靠性。
质量控制程序包括实验前的设备校准和实验后的数据分析。
设备校准设备校准是流式细胞仪保证检测结果准确性和可靠性的关键。
光学器件需要定期校准，以确保检测的性能和准确性。
每个荧光探针必须进行校准，以确保正确的基线水平和探针强度。
数据分析数据分析是流式细胞仪质量控制的另一关键步骤。
流式细胞仪主要技术参数
流式细胞仪主要技术参数1.光学系统：1.1*激光配置:配置488nm、638nm激光器，488nm、638nm激光功率都不低于50mW。
可选配405nm激光，405nm激光功率不低于80mW。
1.2检测参数：至少可同时激发和检测4色荧光。
1.3光路设计：固定校准的光路设计，智能监控确保激光稳定工作。
光学滤光片可由用户根据实际应用自行更换，无需专业人员调校。
1.4#采用新型检测器，能够达到5倍于传统高性能PMT的光电转换效率，每个通道配备独立检测器，电压可独立调节。
1.5*光信号收集系统, NA不小于1.3，能将大视野范围内的光信号准确地传递到接收光路中，最多可以支持到7个空间独立的激光同时激发的信号收集。
1.6* 系统具备进一步升级的能力，可升级至3激光13色。
2.分析性能：2.1颗粒检测能力：可准确区分0.2um和0.3um的细胞或微粒。
2.2*荧光灵敏度：FITC的荧光灵敏度少于30 MESF，PE的荧光灵敏度少于10 MESF。
2.3荧光分辨率：CV≤3%（G0/G1期最高峰）。
2.4无需微球的绝对计数功能，在检测的同时即可自动计算样本浓度，结果准确。
3.电子系统：3.1信号处理精度：20比特100万道原始信息量（1,048,576 channels）。
3.2高达107的线性动态范围，可以将高信号和低信号都完全显示在一张图上。
3.3支持多色荧光信号共同采集，信号获取速度（上样速度）达到30,000个/秒以上。
3.4荧光补偿：全矩阵荧光补偿，可脱机补偿，离线分析。
4.液路系统：4.1自动化上样系统，具有自动混匀和自动清洗功能，降低样本间交叉污染。
4.2液流系统日常维护简单、清洗简便，开关机程序全自动完成，全部由自动软件控制。
4.3#上样速度：除常见低、中、高速外，用户可连续自定义样本进样速度（10-240uL/min）。
5.软件功能：5.1操作系统：Window 7或以上版本。
5.2系统语言：支持中文、英文双语言。
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蛋白酶消化 机械吹打
（三）新鲜实体组织单细胞悬液制备
将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困 难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细 胞的目的又要不损伤细胞。 最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
不论是哪种方法都不可避免的会对细胞表面膜结 构、细胞活性和功能等造成不同程度的损伤。
细胞分选原理
当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方的压 电晶体产生机械振动带动流动室以相同频率进行振动， 使液流注断裂成一连串均匀的液滴，仅少量液滴含有细 胞，有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了 被分选的细胞的特性参数时， 此类细胞在形成液滴时 会被充电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参 数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电 极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生 向右或向左的偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分 选的目的。
488 nm 激光
流 式 细 胞 仪 分 选 系 统
前向散射光 检测器
荧光检测器
电磁场
-
+
单个细胞被分类 进入检测管
第三节 流式细胞仪的主要性能指标
灵敏度
分辨率
表面标志物检测准确性与重复性
分析速度 分选指标
其他
灵敏度
荧光灵敏度
仪器能检测到单个微球上标有荧光分子的最小值
衡量FCM检测荧光信号的重要指标 FSC检测灵敏度
2）短通滤片（short pass filter，SP )
3）带通滤片（band pass filter，BP）
长通滤片
只允许特定波长以上的光通过 ，如LP500 滤片，只允许500nm以上的光通过
与长通滤片正好相反 ，只允许特定波长以 短通滤片 下的光通过 ，如SP500滤片，只允许500nm 以下的光通过 只允许相当窄波长范围内的光通过，滤片一 带通滤片 般有两个值，如BP500/50允许通过的波长范 围为475～525nm，中心值为500nm。
第二节流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括鞘液流和样品流 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区
理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且 在特定的时间内，应该只有一个细胞或生物微粒 通过激光束。
流 动 室 和 液 流 驱 动 系 统
流动室——仪器的核心部件，待测样品与激光在 这里相交，通常由有机玻璃、光学玻璃或石英等 制成。 流动室内充满了鞘液，使细胞排成单列进入流动 室喷嘴口，形成细胞液柱。
细胞凋亡检测 细胞周期检测 细胞分选
其他
二、临床诊断中的应用 感染性疾病的诊断
xMAP技术用于病毒和TORCH检测
白血病免疫表型分析
FCM在血液病诊断、治疗和预后判断方面，具有 非常重要的价值。 正确区别急性髓细胞性白血病（AML）和急性淋 巴细胞性白血病（ALL）。
网织红细胞分析
基本原理：用某种荧光染料与网织红细胞内的 RNA结合，再通过流式细胞术检测被染色的网织 红细胞数目
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法 和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
（五）活检标本单细胞悬液制备
活检标本及各种内镜取材标本可制备成单细胞悬 液。
血小板计数
FCM是当前血小板研究中不可缺少的检测工具， 可用于检测血小板的多项指标。 对血小板相关的多种疾病诊断、治疗和预防，以 及抗血小板活化药物的研究、评价及治疗监测等 方面具有重要意义和研究价值。
血小板分析一般通过SSC和FSC散射光对数取样 设门。
PNH诊断
阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一种以补体介导的血 管内溶血为特征的获得性造血干细胞克隆性疾病。
激光探测器
侧向角散射光（SSC）
激光器
侧向散射光探测器
流式细胞仪的检测信号
散射光
Right Angle Light Detector Cell Complexity
Incident Light Source
Forward Light Detector Cell Surface Area
• FSC，前向角散射光，代表细胞大小 • SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度
藻红蛋白（PE） 藻红蛋白偶联物 PE-Cy5 藻红蛋白偶联物 PE-Cy7 别藻青蛋白（APC） 得州红（Texas red）
三、对照设置
一）阴性对照
确定非特异性荧光
二）阳性对照 查看抗体的有效性
四、仪器操作
一）仪器的校准 光路和流路的校准 采用荧光微球flow-check计算CV值 PMT校准 采用荧光微球flow-set校准 二）补偿调节 三）阈值设定 采用FSC指标来设定 四）上样速度
细胞分选对仪器的性能要求较高
分选是流式细胞仪的重要功能之一 分选功能的装置较为复杂 分选指标 分选速度 分选收获率
►
分选纯度
分选速度
1
每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度 为10000个/秒左右。 分选纯度
2
目标细胞占分选出细胞的百分比，分选纯度与仪 器配置和细胞是否重叠有关。纯化模式的指标。 分选收获率
（一）直接免疫荧光染色法
直接免疫荧光染色法是荧光抗体技术最基本、最 简单的方法，多用于细胞表面标志的染色分析。 优 点 ① 操作简单，方法简便、快速 ② 特异性强，与其他抗原交叉染色较少
③ 反应中只有两种因素（细胞与抗体）参与， 结果判断较简单
间接免疫采用生物素偶联抗体
（二）多参数分析时荧光抗体的组合标记
第七章
流式细胞分析仪器与技术
主要内容
1 2
流式细胞仪的工作原理
流式细胞仪的基本结构
流式细胞仪的主要性能指标 流式细胞仪应用的技术要点
3
4 5 6
Luminex技术
流式细胞术的应用
流式细胞术（flow cytometry ，FCM）是以流式 细胞仪作为检测工具，结合激光技术、计算机分 析技术、流体力学、细胞荧光染色技术和免疫学 技术等学科的理论与技术，对于处在快速直线流 动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快 速定量分析和分选的高新技术 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人 工合成微球等
流式细胞术的分析及分选原理
液流 系统 光学 原理
光学 系统
流式 细胞仪
光电转 换原理
电子 系统
测试 原理
4
激光
光电 倍增管
放大电路
流式细胞仪是集
多种技术为一体的 新型高科技仪器 激光技术 单克隆抗体技术 细胞荧光化学技术 光电测量技术 电子物理技术 电子计算机技术
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合 成及抗体标记物的发展。 多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员 的要求较高。
试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。
（三）自发荧光
自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射后 所发出的荧光。 每种细胞群都有不同水平的自发荧光，如淋巴细 胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。 自发荧光易引起信号干扰，出现假阳性结果，在 实际临床检验工作中应注意区别。
FCM的液流系统
（如何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流驱动系统：包括压缩空气泵、压力传感器、 鞘液过滤器和样本压力调节器等。
常用的液流系统中细胞流和鞘液流的驱动一般采 用正压的方法控制的，保证了鞘液的流速恒定。 鞘液以匀速通过流动室，因此整个液流系统运行 流速是不变的。
光学系统
2
包括光学激发系统和光学收集系统。
流式细胞仪的检测信号
荧光信号
激发光源 弧光灯 采用高压汞灯， 廉价、激发光谱 广泛，但在单一 谱线上能量较弱 ，且功率不够稳 定，应用受到一 定限制 激光 提供单波长、高 能量、高稳定性 的光照，是快速 、准确分析细胞 微弱光的理想光 源。现代流式细 胞仪多采用激光
光学收集系统 光学收集系统：主要由多组透镜、滤光片和分光 镜等光学元件组成，将不同波长的光信号送入不 同的探测器 1）长通滤片（long pass filter，LP ) 滤片
流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现 的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的一 个系统。
光学系统
光学激发系统
（1）散射光信号
前向角散射(Forward
（2）荧光信号
Scatter, FSC )
侧向角散射(Side Scatter, SSC)
前向角散射光（FSC）
大颗粒
激光器
激光器
小颗粒
设门策略
对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型
分选系统
流式细胞仪的分选是指从细胞群体中分离出感兴 趣的细胞，检测的任意参数都可作为分选时指定 的细胞的依据。 分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
液滴形成、充电、偏转三部分 纯化模式、富集模式、单细胞模式
第五节Luminex技术
核心技术包括xMAP技术和xTAG技术，新一代诊 断技术平台 技术特点：高通量、高速度、重复性好、线性范 围宽、敏感性高、检测物质广泛、 低样本量、检 测物质广泛、平台拓展性广
第六节 流式细胞术的应用 一、生物医学研究中的应用
淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞亚群的检测已成为某些疾病诊断、疗效 评价和免疫功能检测的常规手段。 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK细胞分析
信号检测系统
3
组成 ：光电转换器、放大器和信号处理电路 作用 ：将产生的各种光信号成比例的转换成电信 号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据 采集和分析。