异养硝化细菌的筛选_鉴定及其氨氮转化特性的研究
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（ School of Resource and Environmental Engineering，Anhui University，Hefei 230039 ，China）
Abstract ： A heterotrophic stain X5 with nitrification activity was isolated from the soil of Chaohu Lake． Based on physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis，the strain X5 was identified as Bacillus subtilis． The activity of ammonia nitrogen transformation of strain X5 was influenced by temperature，pH，and dosage of inoculum． Optimal ammonia nitrogen 16 h， pH7． 0 ～ 8． 0 and 6% inoculum． After enlarging the cultivatransformation capacity was observed under conditions of 25 ～ 35℃ ， tion scale，strain X5 was coinoculated with cyanobacteria in fermentation medium，and the parameters like concentration of total nitrogen （ TN） ，ammonia nitrogen（ NH4+ N） and nitrate（ NO3－ N） were measured． Results showed that the ammonia nitrogen transformation could be promoted by strain X5 when it was coinoculated with cyanobacteria． Keywords： aerobic heterotrophic nitrification； screening； identification； ammonia nitrogen； cyanobacteria
檬酸盐实验以及产硫化氢实验 。 1． 3 1． 3． 1 异养型硝化细菌的系统发育分析 细菌基因组提取 菌种 DNA 提取采用酚 氯仿异戊醇法 。将所筛选 300 r / min 条件下 菌株接种于 LB 培养基中 ， 在 37 ℃ 、 过夜培养 。取 1mL 培养液于 1． 5 mL 的 EP 管中 ， 于室 弃上清液 ， 将沉淀物悬浮 温下 8000 r / min 离心 5 min ， 于无菌去离子水中 。加入 60 μL 50 mg / mL 的溶菌酶 ， 37℃ 作用 2 h ， 110 再加入 50 μL 2 mol / L 的 NaCl 溶液 ， 3 μL 30 mg / ml 的蛋白酶 K， 37℃ 放置 μL 10% 的 SDS， 过夜 。用酚 氯仿 异戊醇 （ 25 ∶ 24 ∶ 1 ） 抽提两次 ， 用 0. 6 75% 乙醇洗涤并晾干 。 将 倍体积的异丙醇进行沉淀 ， DNA 悬浮于 50 μL 蒸馏水中 ， 4℃ 保存待用 。 1． 3． 2 PCR 扩增及测序 PCR 扩增引物为细菌通用引物 27f 及 1492R［15］。 27f 序 列 为 ： 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3' ； 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT3' ， 序列 为 ： 5'由上海生工 生物工程有限公司合成 。 PCR 反应 体 系 （ 50 μL ） 如 下： 10 × buffer 5 μL， MgCl2 3 μL， dNTP 1． 25 μL， Taq 聚 正反向引物各 5 μL， DNA 5 μL， 合酶 0． 75 μL， 用无菌水补足至 50 μL。 待 各成分均匀混合后进行如下程序的反应 ： 95 ℃ 预变性 10 min， 94 ℃ 变性 1 min， 55 ℃ 复性 1 min， 72 ℃ 延伸 1 min 40 s， 之后进行 30 个循环 ， 最后进行 72 ℃ 10 min 4 ℃ 保存 。PCR 产物在 1% 的琼脂糖凝胶上进 的延伸 ， 行电泳检测 。 1． 3． 3 序列分析及系统发育树的构建 对 16S rDNA PCR 产物进行序列测序 。 测序工作
［13 ］
： （ NH4 ） 2 SO4 0． 5 g / L， 葡
NaCl 0． 3 g / L， K2 HPO4 1． 0 g / L，MgSO4 · 萄糖 5 g / L， 7H2 O 0． 3 g / L，FeSO4 · 7H2 O 0． 03 g / L，CaCl2 · H2 O 0． 03 g / L，pH 值 7． 2 ～ 7． 4 。 加入 20% 的琼脂即成固 体培养基 ， 用于菌种的分离纯化 。 实验以 （ NH4 ） 2 SO4 作为氨氮的来源 。 1． 1． 2 菌种分离纯化方法 称取泥土样本约 2 g， 接种于 100 mL 硝化细菌富 集培养基中， 移取适量发酵液并做梯度稀释 ， 在固体平 板 （ 硝化细菌分离培养基 ） 上进行划线分离 。 培养 48 h 后， 观察菌落形态 ， 并分别挑取不同单菌落 ， 再次分 离纯化 。经多次的分离纯化后得到纯菌株 。 将所筛选 的纯菌株接种于上述液体硝化细菌分离培养基中进行 培养 ， 测定培养液中氨氮含量 ， 选取硝化效果较好的菌 株进行下一步实验 。 1． 2 1． 2． 1 菌种形态观察及生理生化实验 显微镜形态观察 对所筛选的菌种进行细菌革兰氏染色 ， 在显微镜 下观察菌株的形态和革兰氏染色情况 。 1． 2． 2 生理生化试验
［3 － 6 ］
， 但目前
这一方面的研究还仅停留在理论研究与实验阶段 。 其 中一个重要的难题是藻类的脱氮问题 。 如果直接将蓝 藻发酵 ， 其含氮物质不仅会抑制产甲烷菌的活性 ， 降低 产气率 ， 而且会给后续沼气的利用带来一系列问题 。 据文献报道 ， 通过在蓝藻中外加碳源来提高发酵原料 的碳氮比 （ C / N） ， 可以提高沼气中甲烷的产量 ， 降低氮
［14 ］
由上 海 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 完 成 。 应 用 BLAST， 将全序列与 Internet 上 Genbank 中有关的序列 进行同源性分析 。 系统发育树构建采用 MEGA4 软件 完成 。 1． 4 生物量的测定 将所筛菌种接种于已灭菌的硝化细菌分离培养基 140 r / min 条件下恒温培养 48 h ， 中， 在 35℃ ， 每隔 4 h 取样 ， 在 600 nm 下检测发酵液的光密度值 （ OD600 ） 。 1． 5 氨氮转化率的测定 氨氮的测 定 采 用 纳 氏 试 剂 分 光 光 度 法 （ HJ 5352009 ） ， 硝态氮的测定采用麝香草酚分光光度法 （ GB / T 5750． 52006 ） ， 总氮的测定采用碱性过硫酸钾紫外分 89 ） 。 光光度法 （ GB 11894-
。 对打
捞后的蓝藻进行资源化处理 ， 变废为宝 ，从而达到综 合治理的目的 ， 将是解决当前所面临的环境 、 能源等问 题的一条有效途径 ， 具有十分重要的现实意义
［2 ］
。
收稿日期： 2011 － 03 － 09 ； 修回日期： 2011 － 04 － 14 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （ 40972092 ） ； 安徽省自然科学基金项目（ 090415203 ） 作者简介： 芮传芳（ 1984 － ） ， 女， 硕士研究生， 专业方向为水体环境化学与污染治理； Email： liyc1988@ yahoo． com． cn。 通讯作者： 李玉成（ 1963 － ） ， 男， 博士后， 教授， 研究方向为环境同位素地球化学和生物地球化学，
Screening and identification of a heterotrophic nitrifying bacterial strain and its ammonia transformation characteristics
RUI Chuanfang，WU Juan，LI Yucheng
37
生 物 学 杂 志 Vol． 29 No． 1 Feb， 2012 JOURNAL OF BIOLOGY
第 29 卷第 1 期 2012 年 2 月
［2 ， 7 ］
气的比例
。但是 ， 通过降低蓝藻中的氮含量来提高
目前 ， 巢湖湖水的富营养化非常严重 ， 并伴随着蓝 藻的大量滋生， 这不仅破坏了水生生态系统 ， 而且造成 了严重的环境污染 。蓝藻死亡分解后所释放出的多种 藻毒素、 三氮物质等造成了严重的水体污染 ， 严重威胁 着公众的健康及生态系统中其它生物的生存
［1 ］
由于藻细胞中脂肪酸含量丰富 ， 因此以新鲜蓝藻 作为发酵原料生产沼气的研究已有报道
异养硝化细菌的筛选 、 鉴定及其氨氮转化特性的研究
芮传芳，吴 涓，李玉成
（ 安徽大学资源与环境工程学院， 合肥 230039 ）
摘 16S rDNA 要： 从巢湖湖底泥床中分离筛选出一株具有氨氮转化活性的异养型硝化菌株 X5 。经生理生化分析、
pH 值 序列测定及系统发育学比较 ， 菌株 X5 为枯草芽孢杆菌属（ Bacillus sp． ） 。菌株 X5 对氨氮的转化能力受温度 、 16 h， pH 值 7． 0 ～ 8． 0 以及 以及接种量等条件的影响 。实验结果表明， 菌株 X5 的最适氨氮转化条件为 ： 25 ～ 35℃ ， 6% 的接种量。将菌株 X5 扩大培养后接种于含蓝藻的发酵培养基中 ， N） 及硝态氮 分别测定总氮（ TN） 、 氨氮（ NH4 &有一定的转化作用 。 关键词： 好氧异养硝化； 筛选； 鉴定； 氨氮； 蓝藻 中图分类号： X172 ； Q939 文献标识码： A 文章编号： 2095 － 1736 （ 2012 ） 01 － 0037 － 05
C / N 的研究尚不多见 。 已有研究表明 ， 环境中存在大量硝化细菌可实现 脱氮
［8 ］
。但是， 自养硝化细菌由于生长缓慢 ， 所需生长
［9 － 10 ］
环境条件严格 处理
［10 － 12 ］
， 越来越多的研究转向异养型硝化
细菌 。目前， 筛选得到的各种硝化细菌主要用于废水 。本研究从巢湖底泥床中自行筛选获得了 并通过生理生化特性测 具有硝化作用的异养型细菌 ， 16S rDNA 序列分析对其进行了分类鉴定 。 同时， 定， 对其在不同条 件下的氨氮去除活性进行了研究 。 进 而， 本研究就该菌株对蓝藻氮素转化活性进行了初步 测定 ， 以期为蓝藻的资源化研究提供理论基础和依据 。 1 1． 1 1． 1． 1 材料和方法 异养型硝化细菌的筛选 菌种来源与培养基组成 菌种筛选所用土壤标本采自巢湖湖底 0 ～ 10cm 底 泥沉积物 ， 采样后于 4℃ 保存 。 硝化细菌富集培养基 ： 牛肉膏 3 g / L， 蛋白胨 10 g / L， NaCl 5 g / L， pH 值 7． 0 ～ 7． 2 ， 121． 3℃ 灭 琼脂 20 g / L， 菌 20 min。 硝化细菌分离培养基
生 物 学 杂 志 Vol． 29 No． 1 Feb， 2012 JOURNAL OF BIOLOGY
第 29 卷第 1 期 2012 年 2 月
doi∶10． 3969 / j. issn. 2095 － 1736． 2012. 01. 037
Abstract ： A heterotrophic stain X5 with nitrification activity was isolated from the soil of Chaohu Lake． Based on physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis，the strain X5 was identified as Bacillus subtilis． The activity of ammonia nitrogen transformation of strain X5 was influenced by temperature，pH，and dosage of inoculum． Optimal ammonia nitrogen 16 h， pH7． 0 ～ 8． 0 and 6% inoculum． After enlarging the cultivatransformation capacity was observed under conditions of 25 ～ 35℃ ， tion scale，strain X5 was coinoculated with cyanobacteria in fermentation medium，and the parameters like concentration of total nitrogen （ TN） ，ammonia nitrogen（ NH4+ N） and nitrate（ NO3－ N） were measured． Results showed that the ammonia nitrogen transformation could be promoted by strain X5 when it was coinoculated with cyanobacteria． Keywords： aerobic heterotrophic nitrification； screening； identification； ammonia nitrogen； cyanobacteria
檬酸盐实验以及产硫化氢实验 。 1． 3 1． 3． 1 异养型硝化细菌的系统发育分析 细菌基因组提取 菌种 DNA 提取采用酚 氯仿异戊醇法 。将所筛选 300 r / min 条件下 菌株接种于 LB 培养基中 ， 在 37 ℃ 、 过夜培养 。取 1mL 培养液于 1． 5 mL 的 EP 管中 ， 于室 弃上清液 ， 将沉淀物悬浮 温下 8000 r / min 离心 5 min ， 于无菌去离子水中 。加入 60 μL 50 mg / mL 的溶菌酶 ， 37℃ 作用 2 h ， 110 再加入 50 μL 2 mol / L 的 NaCl 溶液 ， 3 μL 30 mg / ml 的蛋白酶 K， 37℃ 放置 μL 10% 的 SDS， 过夜 。用酚 氯仿 异戊醇 （ 25 ∶ 24 ∶ 1 ） 抽提两次 ， 用 0. 6 75% 乙醇洗涤并晾干 。 将 倍体积的异丙醇进行沉淀 ， DNA 悬浮于 50 μL 蒸馏水中 ， 4℃ 保存待用 。 1． 3． 2 PCR 扩增及测序 PCR 扩增引物为细菌通用引物 27f 及 1492R［15］。 27f 序 列 为 ： 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3' ； 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT3' ， 序列 为 ： 5'由上海生工 生物工程有限公司合成 。 PCR 反应 体 系 （ 50 μL ） 如 下： 10 × buffer 5 μL， MgCl2 3 μL， dNTP 1． 25 μL， Taq 聚 正反向引物各 5 μL， DNA 5 μL， 合酶 0． 75 μL， 用无菌水补足至 50 μL。 待 各成分均匀混合后进行如下程序的反应 ： 95 ℃ 预变性 10 min， 94 ℃ 变性 1 min， 55 ℃ 复性 1 min， 72 ℃ 延伸 1 min 40 s， 之后进行 30 个循环 ， 最后进行 72 ℃ 10 min 4 ℃ 保存 。PCR 产物在 1% 的琼脂糖凝胶上进 的延伸 ， 行电泳检测 。 1． 3． 3 序列分析及系统发育树的构建 对 16S rDNA PCR 产物进行序列测序 。 测序工作
［13 ］
： （ NH4 ） 2 SO4 0． 5 g / L， 葡
NaCl 0． 3 g / L， K2 HPO4 1． 0 g / L，MgSO4 · 萄糖 5 g / L， 7H2 O 0． 3 g / L，FeSO4 · 7H2 O 0． 03 g / L，CaCl2 · H2 O 0． 03 g / L，pH 值 7． 2 ～ 7． 4 。 加入 20% 的琼脂即成固 体培养基 ， 用于菌种的分离纯化 。 实验以 （ NH4 ） 2 SO4 作为氨氮的来源 。 1． 1． 2 菌种分离纯化方法 称取泥土样本约 2 g， 接种于 100 mL 硝化细菌富 集培养基中， 移取适量发酵液并做梯度稀释 ， 在固体平 板 （ 硝化细菌分离培养基 ） 上进行划线分离 。 培养 48 h 后， 观察菌落形态 ， 并分别挑取不同单菌落 ， 再次分 离纯化 。经多次的分离纯化后得到纯菌株 。 将所筛选 的纯菌株接种于上述液体硝化细菌分离培养基中进行 培养 ， 测定培养液中氨氮含量 ， 选取硝化效果较好的菌 株进行下一步实验 。 1． 2 1． 2． 1 菌种形态观察及生理生化实验 显微镜形态观察 对所筛选的菌种进行细菌革兰氏染色 ， 在显微镜 下观察菌株的形态和革兰氏染色情况 。 1． 2． 2 生理生化试验
［3 － 6 ］
， 但目前
这一方面的研究还仅停留在理论研究与实验阶段 。 其 中一个重要的难题是藻类的脱氮问题 。 如果直接将蓝 藻发酵 ， 其含氮物质不仅会抑制产甲烷菌的活性 ， 降低 产气率 ， 而且会给后续沼气的利用带来一系列问题 。 据文献报道 ， 通过在蓝藻中外加碳源来提高发酵原料 的碳氮比 （ C / N） ， 可以提高沼气中甲烷的产量 ， 降低氮
［14 ］
由上 海 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 完 成 。 应 用 BLAST， 将全序列与 Internet 上 Genbank 中有关的序列 进行同源性分析 。 系统发育树构建采用 MEGA4 软件 完成 。 1． 4 生物量的测定 将所筛菌种接种于已灭菌的硝化细菌分离培养基 140 r / min 条件下恒温培养 48 h ， 中， 在 35℃ ， 每隔 4 h 取样 ， 在 600 nm 下检测发酵液的光密度值 （ OD600 ） 。 1． 5 氨氮转化率的测定 氨氮的测 定 采 用 纳 氏 试 剂 分 光 光 度 法 （ HJ 5352009 ） ， 硝态氮的测定采用麝香草酚分光光度法 （ GB / T 5750． 52006 ） ， 总氮的测定采用碱性过硫酸钾紫外分 89 ） 。 光光度法 （ GB 11894-
。 对打
捞后的蓝藻进行资源化处理 ， 变废为宝 ，从而达到综 合治理的目的 ， 将是解决当前所面临的环境 、 能源等问 题的一条有效途径 ， 具有十分重要的现实意义
［2 ］
。
收稿日期： 2011 － 03 － 09 ； 修回日期： 2011 － 04 － 14 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （ 40972092 ） ； 安徽省自然科学基金项目（ 090415203 ） 作者简介： 芮传芳（ 1984 － ） ， 女， 硕士研究生， 专业方向为水体环境化学与污染治理； Email： liyc1988@ yahoo． com． cn。 通讯作者： 李玉成（ 1963 － ） ， 男， 博士后， 教授， 研究方向为环境同位素地球化学和生物地球化学，
Screening and identification of a heterotrophic nitrifying bacterial strain and its ammonia transformation characteristics
RUI Chuanfang，WU Juan，LI Yucheng
37
生 物 学 杂 志 Vol． 29 No． 1 Feb， 2012 JOURNAL OF BIOLOGY
第 29 卷第 1 期 2012 年 2 月
［2 ， 7 ］
气的比例
。但是 ， 通过降低蓝藻中的氮含量来提高
目前 ， 巢湖湖水的富营养化非常严重 ， 并伴随着蓝 藻的大量滋生， 这不仅破坏了水生生态系统 ， 而且造成 了严重的环境污染 。蓝藻死亡分解后所释放出的多种 藻毒素、 三氮物质等造成了严重的水体污染 ， 严重威胁 着公众的健康及生态系统中其它生物的生存
［1 ］
由于藻细胞中脂肪酸含量丰富 ， 因此以新鲜蓝藻 作为发酵原料生产沼气的研究已有报道
异养硝化细菌的筛选 、 鉴定及其氨氮转化特性的研究
芮传芳，吴 涓，李玉成
（ 安徽大学资源与环境工程学院， 合肥 230039 ）
摘 16S rDNA 要： 从巢湖湖底泥床中分离筛选出一株具有氨氮转化活性的异养型硝化菌株 X5 。经生理生化分析、
pH 值 序列测定及系统发育学比较 ， 菌株 X5 为枯草芽孢杆菌属（ Bacillus sp． ） 。菌株 X5 对氨氮的转化能力受温度 、 16 h， pH 值 7． 0 ～ 8． 0 以及 以及接种量等条件的影响 。实验结果表明， 菌株 X5 的最适氨氮转化条件为 ： 25 ～ 35℃ ， 6% 的接种量。将菌株 X5 扩大培养后接种于含蓝藻的发酵培养基中 ， N） 及硝态氮 分别测定总氮（ TN） 、 氨氮（ NH4 &有一定的转化作用 。 关键词： 好氧异养硝化； 筛选； 鉴定； 氨氮； 蓝藻 中图分类号： X172 ； Q939 文献标识码： A 文章编号： 2095 － 1736 （ 2012 ） 01 － 0037 － 05
C / N 的研究尚不多见 。 已有研究表明 ， 环境中存在大量硝化细菌可实现 脱氮
［8 ］
。但是， 自养硝化细菌由于生长缓慢 ， 所需生长
［9 － 10 ］
环境条件严格 处理
［10 － 12 ］
， 越来越多的研究转向异养型硝化
细菌 。目前， 筛选得到的各种硝化细菌主要用于废水 。本研究从巢湖底泥床中自行筛选获得了 并通过生理生化特性测 具有硝化作用的异养型细菌 ， 16S rDNA 序列分析对其进行了分类鉴定 。 同时， 定， 对其在不同条 件下的氨氮去除活性进行了研究 。 进 而， 本研究就该菌株对蓝藻氮素转化活性进行了初步 测定 ， 以期为蓝藻的资源化研究提供理论基础和依据 。 1 1． 1 1． 1． 1 材料和方法 异养型硝化细菌的筛选 菌种来源与培养基组成 菌种筛选所用土壤标本采自巢湖湖底 0 ～ 10cm 底 泥沉积物 ， 采样后于 4℃ 保存 。 硝化细菌富集培养基 ： 牛肉膏 3 g / L， 蛋白胨 10 g / L， NaCl 5 g / L， pH 值 7． 0 ～ 7． 2 ， 121． 3℃ 灭 琼脂 20 g / L， 菌 20 min。 硝化细菌分离培养基
生 物 学 杂 志 Vol． 29 No． 1 Feb， 2012 JOURNAL OF BIOLOGY
第 29 卷第 1 期 2012 年 2 月
doi∶10． 3969 / j. issn. 2095 － 1736． 2012. 01. 037