第十三章 色谱法分离原理

分配色谱法：利用组分在固定液（固定相） 中溶解度不同而达到分离的方法。
离子交换色谱法：利用组分在离子交换剂 （固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的 方法。
凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法：利用大小不 同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到 分离的方法。
最近，又有一种新分离技术，利用不同组分 与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力 进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋 白质的分离。
4、按照展开程序分类
洗脱法、顶替法、和迎头法。
洗脱法也称冲洗法。先将样品加到色谱柱头上， 然后用吸附或溶解能力比试样组分弱的气体或液体 作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能 力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使 组分彼此分离。这种方法能使样品的各组分获得良 好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可 获得纯度较高的物质。
k ns csVs
nm
cmVm
tR tM (1 k)
k tR tM tR VR
tM
tM VM
分配系数K与分配比k的关系
K cs ns /Vs k • Vm k •
cm nm /Vm
Vs
其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱型特 点的又一个参数。
➢ 固定相——CaCO3颗粒 ➢ 流动相——石油醚
色带
叶绿素色谱分离.swf
填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固 体或液体）称为固定相；
自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称 为流动相；
装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为 色谱柱。
色谱柱内分析过程.swf
1、按流动相的状态不同分为两类： (1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱
选择因子 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准 （s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值。
此时，γi/s可能大于1，也可能小于1。在多元混合物
分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的 相对保留值作为重要参数．在这种特殊情况下，可用 符号表示：

tR2 t R1
式中tR2′为后出峰的调整保留时间，总是大于1的。
操作技术
1.层析纸和层析板
特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是 用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200～250 目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥 后即可使用。
2.展开剂
由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离 氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸： 水=4：1：1。
(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。
(3)其它色谱方法 薄层色谱和纸色谱
凝胶色谱法：测聚合物分子 量分布。 超临界色谱: CO2流动相。 高效毛细管电泳: 九十年代快速发展、特别适 合生物试样分析分离的高效 分析仪器。
2、 按分离机理分类
吸附色谱法：利用组分在吸附剂（固定相） 上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法。
例如，对填充柱，其β值一般为6～35；对毛细 管柱，其β值为60～600。
分配系数K及分配比k与选择因子的关系


tR ( B) tR( A)

k(B) k ( A)

K (B) K (A)
通过选择因子把实验测量值k与热力学性质 的分配系数K直接联系起来，对固定相的选择
具有实际意义。
如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组
3、 按固定相的外型分类 柱色谱：固定相装于柱内的色谱法 平板色谱：固定相呈平板状的色谱，它又 可分为薄层色谱和纸色谱。
纸层析和薄层层析分离过程
纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方 法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。
纸层析和薄层层析流 动相的移动是依靠毛细作 用。
将试样点在色谱滤纸或 层析板的一端，并将该端 浸在作为流动相的溶剂（ 常称之为展开剂）中，随 着溶剂向上的移动，经过 试样点时，带动试样向上 运动。
分离方法
分离法
色谱分离法 电泳分离法
气相色谱法 液相色谱法 超临界流体色谱法
毛细管电泳法 毛细管电动色谱法
第十三章 色谱法分离原理
第一节 概述
1903年俄国植物学家茨维特在研究植物叶的色素成 分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻 璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中 各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法 因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的 分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人 们沿用至今。
A
B
顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相 中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组 分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动 相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力 的强弱顺序，依次顶替出固定相。吸附或溶解能 力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。
AB
迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或 溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出， 其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二 组分混合物，以此类推。
3. 点样
用微量注射器或玻璃毛细管吸取一 定量试样点在原点上。试样点的直径 一 般 应 小 于 5mm 。 可 并 排 点 多 个 试 样同时展开。
4.显色、检测
有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅 笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘 蒸气熏或氨水熏等。
特点及应用
分配系数K是指在一定温度和压力下，组分在固定
相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即
溶质在固定相中的浓度 k 溶质在流动相中的浓度
cs cm
分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的， 它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：固 定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的 仪器无关。
分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的
K或k值相差越大，则分离得越好。
两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先 决条件。
从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：
（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含 组份的最少个数； （2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进 行定性分析；
(3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定 量分析； （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价 色谱柱分离效能的依据； （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和 流动相)选择是否合适的依据。
Y1/2 = 2.354σ
3. 基线宽度Y 色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距， 如图中IJ的距离．它与标准偏差。的关系是：
Y = 4σ
六、分配系数K和分配比k
1 ．分配系数K 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和 流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的 分离是基于反复多次的吸附-脱附过程。 分离过程经常用样品分子在两相间的分配来 描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。
五、区域宽度 色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的 函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色 谱峰区域宽度通常有三种方法：
1. 标准偏差σ 0．607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图中EF距 离的一半。
2. 半峰宽Y1/2 峰高一半处对应的峰宽，如图中GH间的距离。 它与标准偏差σ的关系是：
AB
浓 度
A
B
沿柱移动距离 L
若要使A、B组分完全分离，必须满足以 下三点：
一、两组分的分配系数必须有差异； 二、区域扩宽的速率应小于区域分离的 速度； 三、在保证快速分离的前提下，提供足 够长的色谱柱。
第一、二点是完全分离的必要条件。作为一 个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移 动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起 区域扩宽的各种因素。
流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。
色谱流出曲线.swf
二、基线 柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记 录值，即图中O—t线．稳定的基线应该是一条水 平直线。
三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示， 如图中B′A 。
四、保留值
1．死时间tM （死体积 VM ） 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时， 从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间， 如图 O′A′。因为物质不被固定相吸附或溶解， 其流动速度将与流动相的流动速度相近。
• 平板色谱简单、方便、及操作费用低， • 可以在一块层析板上同时展开多个试样及 将多条滤纸同时展开。 • 采用方形薄层板还可以方便的进行二维展 开，即按一般方法展开后，改变方向和展开 剂再次展开，进一步改善分离效果。 • 试样一般不需要经过预处理即可分离。
缺点:
• 缺点： 分离效率较低，不适用挥发性 试样分离。定性定量不便。 • 应用：平板色谱法在染料、农药、医药 、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基 酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分 析中经常被使用。也可Fra Baidu bibliotek用于无机离子的 分离。还经常作为高效液相色谱的一种预 试方法。
塔板理论的假设： (1) 在每一个平衡过程间隔内，平 衡可以迅速达到；这一小段间隔的 柱长称为理论塔板高度。 (2) 将流动相看作成脉动（间歇） 过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽 略； (4) 每次分配的分配系数相同。
所需的时间，所以tR′实际上是组份在固定相中停留 的总时间。
保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份
的保留时间常受到流动相流速的影响。
4．相对保留值γ2.1
某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值 之比，称为相对保留值
2.1

t
R

2
t

R1

VR2 VR1
由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关， 而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因 此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使 用的定性数据。
2.分配比 k
分配比又称容量因子，它是指在一定温度和 压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固 定相和流动相中的质量比。即
组分在固定相中的质量 k 组分在流动相中的质量
ms mm
k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当 于柱的容量大，又称分配容量或容量因子。它是衡量 色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定 于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变 化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。
塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系 数恒定为前提，故称为线性色谱理论。
一、塔板理论-柱分离效能指标
1.塔板理论 （plate theory）
半经验理论； 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连 续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程 的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程 ）；在每一个塔板上，被分离组分达到一 次分配平衡。
✓ 缺点： 对未知物分析的定性专属性差 需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)
第二节 色谱有关术语
一、色谱流出曲线和色谱峰 当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与 固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的 差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异， 不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先 后不同的次序从固定相中流出，由柱后检测器输 出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱
第三节 色谱法基本原理
下图是 A、B两组分沿色谱柱移动时， 不同位置处的浓度轮廓。
AB
浓 度
A
B
沿柱移动距离 L
图中KA>KB ，A组分在移动过程中滞后。
随着两组分在色谱柱中移动距离的增加， 两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分 的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。 显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是 不可避免的。
A A+ B
色谱法的特点
✓ 优点：“三高”、“一快”、 “高一选广择”性——可将性质相似的组分分开 高效能——反复多次利用组分性质的差异产生 很好分离效果 高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析 分析速度快——几~几十分钟完成分离一次可以 测多种样品 应用范围广——气体，液体、固体物质化学衍 生化再色谱分离、分析
u L tM
2．保留时间tR （保留体积 VR ）
试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经 历的时间，称为保留时间，如图 O′B。它相 应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。
3．调整保留时间tR′（调整保留体积VR′） 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调
整保留时间。
即 tR′= tR - tM 由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随 流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留