PCR报告

cDNA
cDNA cDNA cDNA cDNA
1112.0
1297.2 1165.1
22.24
25.94 23.3
12.25
14.33 12.87 12.971/12.525 14.523/14.245
1.82
1.81 1.81 1.81/1.81 1.81/1.81
1172.1/1133.2 23.442/22.663 1313.9/1289.1 26.278/25.782
一、准备磁珠
磁珠重悬： 充分混匀磁珠液，取适量磁珠液 至 1.5ml tube（20、50ul/tube）， 放于磁架，30 sec，去上清液。 移去磁架，加入lysis buffer（50ul裂解液）洗一次， 放于磁架，30sec，去上清液。
二、准备细胞
细胞保存（pbs 浸液氮）至-80℃。 -80℃取出冰盒融化，加入lysis buffer 150ul（cell+lysis+pbs）2min后浸入LN2 室温下逐渐融化。 200ul 枪头简单吹打切断DNA 10-20次 Sample 1000>y 50ul
加样10ul 2016.7.11
PCR 45cyc 100V 20min 2%胶
2016.4.21
M
Bcl
Bax
Sox2
Oct4
Nanog
Gapdh
M
Bcl
Bax
Sox2
Oct4
Nanog
Gapdh
loadingbuffer 2ul 加样10ul （45cyc左T右C）
2016.4.22
时间 2016.4.21
Sample 27囊T组GQ 30囊C组GQ cDNA cDNA
2 vol 4 vol 2 vol 1 vol 1vol 10vol
85 ℃ ，5min
五、PCR
得到cDNA 20ul ， cDNA Primer F Primer R Kit DDW total 简单离心混匀 on ice box 进入PCR cycle， 95 ℃ 95 ℃ 60 ℃ 72 ℃ 72 ℃ 4 ℃ 5min 30s 30s 30s 7min +00 1 cyc 46 cyc 1 cyc 盖加热 T=100 ℃ 2 ul 1 ul 1 ul 12.5ul 8.5 ul 25 ul
样品中加入 Tris-HCL（10ul，pipe），65-80 ℃，5min 放于磁架，取出上清液 至无Rnase tube（含有mRNA8-9ul ，*place on ice at least 1 min）
四、cDNA合成
1. Mix：Primer solution （DDW配引物，稀释分装10 mM/L） DEPC.W 4vol ---OligodT 1vol 1vol 10mM dNTP 1vol 1vol total RNA 3vol 8vol total 10vol 65 ℃ thermal cycler for 5 min and ice box fou 1min*
C（ug/ul） 843.0/851.9
A260 16.86/17.039
A280 9.47/9.49 1.78/1.79
M Bcl-2 Gapdh Bax 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp
M Nang Oct4
PCR tube
2. 2xRT mix（superscript III） 10x RT buffer 2mM MgCL2 0.1M DTT RNaseOUT（inhibitor） superscriptIII RT total 3. + 20 ul， 50 ℃ ，50min 4. 测cDNA 浓度
Baidu Nhomakorabea
G Na+G Bax Bcl Oct Sox M
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
loadingbuffer 2ul 10ul加样
未加loading buffer 加样10ul
2016.4.15
PCR循环对比试验
时间 Sample C（ug/ul） A260 A280
M 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
GT
GC
BclT BclC BaxT BaxC
ST
SC
OT
OC
NT
NC
加loadingbuffer 2ul，加样10ul（45cyc左T右C）
2016.5.4
时间 2016.5.3
Sample 30囊T组YC 27囊C组YC cDNA cDNA M G
NT
BC
M
G
Bcl
Bax
M
Sox2
Oct4
Nanog
未加loadingbuffer Gapdh加样6ul， 其余加样8ul （45cyc左T右C）
未加load加样5ul 2016.5.6
时间 2016.5.9
Sample 18囊T组XC 18囊C组XC M GT GC Bcl cDNA cDNA Bax
C（ug/ul） 1272.5/1275.2 1091.3/1111.7
A260 25.499/25.504 21.827/22.233
A280 14.037/14.050 12.105/12.375 1.81/1.82 1.80/1.80
M
G
Oct4
Sox2
Nanog
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
未加loadingbuffer 加样8ul （45cyc左T右C）
2016.5.9
时间 2016.7.11
Sample 囊T组JL 囊C组JL cDNA cDNA
C（ug/ul） 921.9/934.5 1096.3/1084.3
A260 23.048/23.363 27.409/27.108
A280 12.709/12.946 15.112/14.824 1.81/1.80 1.81/1.83
提mRNA，反转录cDNA 浓度参考
时间
2016.4.11
Sample
80w cell L：cDNA
C（ug/ul）
843.0/851.9
A260
16.86/17.039
A280
9.47/9.49 1.78/1.79
2016.4.15
2016.4.21 2016.5.3
150embryo
27囊T组GQ 30囊C组GQ 30囊T组YC 27囊C组YC
电泳胶： 15孔 20ml 2 % （0.7-1.2 %），保鲜膜 扎眼， 不烫手时add gold view 1ul 加样： 样品 10ul ，loading buffer 2ul混匀 ，marker（D2000） 5ul running 20min (测试结果发现，可以不用加loadingbuffer，加样5-10ul)
2016.4.25
时间
2016.5.3
Sample
30囊T组YC 27囊C组YC cDNA cDNA
C（ug/ul）
1172.1/1133.2 1313.9/1289.1
A260
23.442/22.663 26.278/25.782
A280
12.971/12.525 14.523/14.245 1.81/1.81 1.81/1.81
C（ug/ul） 1297.2 1165.1
A260 25.94 23.3
A280 14.33 12.87 1.81 1.81
M
Bcl
Bax
Sox2
Oct4
Nanog
Gapdh
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
loadingbuffer 2ul 加样10ul （45cyc左T右C）
Sample 囊胚T 27 囊胚C 30 M cDNA cDNA
C（ug/ul） 1297.2 1165.1 S.T S.C
A260 25.94 23.3
A280 14.33 12.87 1.81 1.81
N.T N.C Bcl.T Bcl.C O.T O.C
Bax.T Bax.C G.T G.C
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
三、mRNA
Sample 至处理后的磁珠tube，轻轻混匀 1min，至磁架2min，除去 上清液 室温下 buffer A 洗两次： 1.移去磁架，加入300 ul（buffer A)轻轻混匀 放于磁架，静置1-2min，待清液磁珠彻底分离，除去清液。 2.buffer A重复洗一次 室温下buffer B 洗一次： 移去磁架，加入150 ul（buffer B)轻轻混匀，place on ice 10min 放于磁架，静置3-5min，待清液磁珠彻底分离，除去清液。
C（ug/ul） 1172.1/1133.2 1313.9/1289.1 Bcl Bax
A260 23.442/22.663 26.278/25.782 M Sox2
A280 12.971/12.525 14.523/14.245 Oct4 Nanog 1.81/1.81 1.81/1.81
GT GC
Sox2 Gapdh
100bp
10ul加样 2016.4.11
2016.4.12
时间
2016.4.15
Sample
150embryo cDNA
C（ug/ul）
1112.0
A260
22.24
A280
12.25 1.82
M G Na Sox Oct Bcl Bax M
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
2016.4.15
150embryo
cDNA
1112.0
22.24
12.25
1.82
N
G
Sox
Sox
M G N 46cyc 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
40cyc 40cyc 25cyc 30cyc
10ul加样
胚胎 体细胞 2016.4.20
时间 2016.4.21
2016.5.9
18囊T组XC
18囊C组XC
cDNA
cDNA
1272.5/1275.2 25.499/25.504
1091.3/1111.7 21.827/22.233
14.037/14.050
12.105/12.375
1.81/1.82
1.80/1.80
时间 2016.4.11
Sample 80w cell L：cDNA