临床检验技师考试综合辅导资料：流式细胞术简介

临床免疫学：流式细胞术

用流式细胞仪测量液相中的悬浮细胞或颗粒的一种现代分析技术，可在细胞保持完整的情况下，精确、快速地对流动中的单个细胞进行分子水平的多参数、定量分析，并可对特定群体进行分选。
流式细胞术的基本工作原理
根据待测细胞的生物学特性或细胞生化成分，选择特定荧光染料或与荧光染料耦联的多/单克隆抗体标记细胞，以激光作为激发光源，利用显微荧光光度测定技术、光电技术以及计算机技术测定流动相中单个细胞受激后的光信号来分析细胞的物理、生化、免疫、分子生物等多种特性，并可根据某些特征进行细胞亚群分选。
结合后，其荧光强度能够反映细胞表达抗原的情况，从而对细胞亚群或功能进行分析； ✓荧光素直接标记DNA,可以得到相对的DNA含量，进而对细胞周期进行分析；
荧光染料的选择
仪器所配置的激光光源的波长，即荧光素的激发光谱；
荧光素的发射光谱与检测器的接收光谱；
染色细胞的抗原表达的相对密度；
2. 荧光信号：当激光光束照射在通过检测区的细胞上
时会产生两种荧光信号：一种是细胞自身在激光照射下发出的微
弱荧光，称为细胞自发荧光；另一种是标记在细胞上的荧光素，经激
发光照射后产生的荧光信号，称为特异荧光，
荧光信号的意义
荧光信号可以反映细胞的不同生物学特征 ✓比如荧光素标记的抗体在与细胞上的对应抗原特异性
3、用单阳性管依次调节相关通道荧光之间的补偿，如FL1-%FL2， FL2-%FL1
阴性对照：未染色的待分析标本；
同型对照（抗体）：与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量、相同类、亚类和型的未免疫的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
阳性对照：
数据的显示和分析

流式细胞术简介

流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。

其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。

概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。

FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。

1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。

1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。

于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。

这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。

1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。

其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。

1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。

1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。

临床分析利用流式细胞术鉴定免疫系统异常

临床分析利用流式细胞术鉴定免疫系统异常免疫系统是人体重要的防御机制，负责抵御各类病原体的入侵和维护内环境的稳定。

但有时候，免疫系统可能出现异常，导致各类疾病的发生。

为了准确诊断和治疗免疫系统异常，临床医生常常会利用流式细胞术进行分析。

本文将介绍流式细胞术在免疫系统异常鉴定中的应用及其重要性。

一、流式细胞术简介流式细胞术是一种通过分析单个细胞的形态、表面标记物及分子水平的技术。

它基于细胞在流式细胞仪中以单个细胞为单位通过激光束的原理，通过激发荧光染料和细胞表面抗原的结合来鉴定和定量细胞的特定标记物。

流式细胞术具有高通量、高灵敏度和多参数的特点，因此成为了免疫学研究和临床诊断中的重要工具。

二、流式细胞术在免疫系统异常鉴定中的应用1. 免疫细胞亚群分析通过流式细胞术可以对免疫系统中的不同亚群细胞进行鉴定并进行计数。

比如，淋巴细胞亚群中的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在机体的免疫应答中发挥重要作用。

通过流式细胞术，可以准确计算不同亚群细胞的比例，发现其中的异常情况。

2. 细胞膜受体表达分析流式细胞术可以分析细胞表面的受体表达情况，通过检测特定抗体和荧光染料结合的情况，确定免疫细胞受体的表达水平。

例如，通过检测CD25和CD127的表达，可以辨别调节性T细胞和效应性T细胞的比例，从而判断机体免疫应答的状态。

3. 免疫细胞功能分析除了表面标记物的分析，流式细胞术还可以评估细胞的功能状态。

通过检测细胞的细胞因子分泌和细胞凋亡情况，可以确定免疫细胞的活性和功能。

这对于鉴定免疫系统异常非常重要，因为某些疾病可能导致免疫细胞功能的异常改变。

三、流式细胞术在免疫系统异常鉴定中的重要性流式细胞术作为一种高灵敏度和高特异性的技术，对于免疫系统异常的鉴定至关重要。

它可以帮助医生确定疾病的类型、分期和风险等信息，为定制个体化的治疗方案提供支持。

同时，流式细胞术还可以监测治疗效果、预测预后和评估疫苗免疫应答等方面起到重要的辅助作用。

流式细胞术概念

流式细胞术概念
流式细胞术是一种先进的生物技术，能够快速、准确地分析大量细胞，提供细胞的多功能性信息。

它是一种在液流中进行的细胞分析技术，通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞表面的蛋白质、细胞内部的活性物质等进行检测，从而实现对细胞性质的精确分析。

流式细胞术的基本原理是将细胞悬浮在液体中，然后通过特异性的抗体标记目标细胞，再通过激光束照射被标记的细胞，测量产生的荧光信号或其他物理化学信号，从而对细胞进行定量和分选。

在流式细胞术中，细胞以单个形式流过激光束，这样每个细胞都会被激光束照射并产生荧光信号，这些信号被光电倍增管收集并转换为电信号，最后通过计算机进行数据处理和分析。

流式细胞术具有以下优点：
1. 高速度：流式细胞术可以同时处理大量细胞，每秒钟可以分析上千个细胞。

2. 高灵敏度：它可以检测微量的蛋白质、DNA等物质，灵敏度非常高。

3. 多功能性：流式细胞术可以同时检测多个细胞特性，可以进行多参数定量分析和分选。

4. 广泛适用性：它可以应用于各种类型的细胞，包括淋
巴细胞、肿瘤细胞、干细胞等。

流式细胞术在医学、生物学、环境科学等领域都有广泛的应用。

在医学方面，它可以用于检测和分选肿瘤细胞、淋巴细胞等，为临床诊断和治疗提供帮助。

在生物学方面，它可以用于研究细胞的发育和分化过程，探索生命奥秘。

在环境科学方面，它可以用于检测空气和水中的微生物污染，评估环境质量。

总之，流式细胞术是一种非常强大的生物技术，可以对大量细胞进行快速、准确的分析，为科学研究提供重要的数据支持。

流式细胞术介绍

流式抗体选择技巧
抗体使用剂量（elabscience为例）： 1.以test为计量单位的抗体，即每100μl样本有106个细胞加入1 test对应体积抗体即可；
2.以μg为计量单位的抗体，需要根据说明书计算出每次加入多少μg的抗体。
流式抗体选择技巧
弱表达对高亮度，反之也是
实例解析：
四川赛因斯特生物科技有限公司
1.用阳性样本 2.用公司已有的验证过的抗体做对比，比如已知PECD4抗体是有效的，用来验证FITC-CD4的抗体 3.加阳性试剂，如检测JC-1，ROS
4.流式抗体与配色
配色的八大原则：
1) 弱表达抗原选择强荧光染料；强表达抗原搭配弱荧光染料 2) 弱表达抗原放在被干扰最小的检测通道，强表达抗原放在对其它通道干扰较小的检测通道； 3) 互斥抗原可以放在相互干扰较大的检测通道，按抗原密度匹配染料即可； 4) 共表达抗原避免放在相互干扰的通道； 5) 上下级抗原—上级避免对下级造成干扰，反之则是可行的；（如CD3与CD8） 6) 将多色参数分配到更多路激光上，以减少每路激光分配的荧光染料种类； 7) 胞内抗原标记优先选择小分子荧光素。 8) 最好增加一个dump channel或细胞活性染料四川赛因斯特生物科技有限公司
• 样本制备：单细胞悬液（天然，机械研磨/消化）；5×105～1×107cells/ml，约0.5～1ml，300目筛网过滤。
与仪器匹配的荧光染料或荧光素偶联抗体
流式细胞仪分类
2.流式细胞仪的基本组成-三大系统
光电系统和滤光片
光电系统和滤光片
散射光检测的原理
前向散射光（FSC）是细胞通过激光检测区侧向散射光（SSC）是细胞通过测量区时90度
5.流式细胞术的应用

流式细胞术

流式细胞术
流式细胞术是现代生物学中一项重要的技术。

它是一种针对单个细胞进行分析的高通量技术，可以分析细胞表面和胞内分子的表达、功能状态和亚细胞定位等信息，广泛应用于免疫学、细胞学、肿瘤学等领域，尤其在流行病学、诊断学和临床治疗中发挥着重要作用。

流式细胞术的基本原理是：将单个细胞通过高压速度流动进入光束中，利用各种光学、光电、电子学以及计算机技术，对其进行精密的测量和分类。

细胞进入光束时，会被加上一个荧光标记，从而使光线反射出细胞的特征，这些特征被探测器捕捉到之后，被转换成电信号，通过计算机处理分析，最终得到细胞的信息。

流式细胞术的优点在于它具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高自动化和较低的样品消耗等优点。

同时，流式细胞术也存在一些局限性，如需要专业的应用和分析软件、标记试剂的选择和设计、实验条件的控制等问题。

流式细胞术常常被用于单个细胞表型和功能的分析。

针对免疫学，它可以用于细胞免疫表型的分析，了解细胞表面受体、淋巴亚群体等重要的表型信息。

同时，流式细胞术也可以用于肿瘤学的研究，检测瘤细胞表面受体和异质性表达。

在临床诊断中，流式细胞术可以用于血液学和肿瘤学等领域中单个细胞的感染或肿瘤状态的分析，为诊断和治疗提供重要的信息。

总的来说，流式细胞术是一种应用广泛、非常重要的技术。

无
论是在研究领域中分析细胞的性质，还是在临床领域中进行个性化治疗，流式细胞术都扮演着至关重要的角色。

我们相信，在不久的将来，随着流式细胞术技术的更进一步完善和发展，该技术的应用范围将会更加广泛，为生命科学领域的发展注入更多的动力。

临床检验技师临检基础知识讲解：流式细胞术

流式细胞术（flowcytometry，FCM）是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术，使被测溶液流经测量区域，并逐一检测其中每一个细胞的物理和化学特性，从而对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。

首先，待测细胞经处理或染色后被压人流动室，与此同时，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能被包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在包绕下单行排列，依次通过检测区域。

在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。

这两个光源信号分别反映了细胞体积的大小和内部的信息。

经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模，数转换器。

将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，经计算机处理，可将分析结果显示在屏幕上。

为了保证细胞单个排列地逐一通过检测区域，鞘流技术在流式细胞术中被广泛应用。

根据层流理论，由于两种液体的流速和压力不同。

在一定条件下样品溶液与包裹它的鞘液在流动中可以保持相互分离并且同轴。

同时鞘液流可以加速样品溶液中颗粒的流动并迫使他们的流动轨迹保持在液流的中轴线上，使细胞单排列地逐一通过检测区域，这便是所谓的液流聚焦原理。

流式细胞术

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是从70年代逐渐兴起的一种利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞等生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。

它是集现代物理电子技术、激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞荧光技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技分析检测技术，具有检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本等优点，已被广泛应用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中都发挥着重要的作用。

一、流式细胞术的基本原理待测样品（如细胞、染色体、微生物或人工合成微球等）经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过鞘液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，依次通过流动室检测区域。

以不同波长的激光作为激发光源，垂直照射检测区域的样品流，被荧光染色的生物颗粒在其照射下，产生散射光和激发荧光，它们同时被前向光电二极管和侧向90°方向的光电倍增管接收。

前向小角度的光散射信号（forward scatter, FSC）反映了细胞体积的大小；侧向90°方向的光散射信号（side scatter, SSC）反映了细胞内颗粒的复杂情况；激发荧光信号代表了所标记的被测细胞内部颗粒的信息。

这些光信号被转化成电信号，传送到计算机，经A/D 转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存到计算机上，以备脱机后的数据处理和分析。

细胞的分选则是指根据所测定的各个参数将指定的细胞亚群从细胞主群体中分离出来的一种方式。

具体的操作是在流动室的喷口上方配有一个超高频的压电晶体，产生的振动能使喷出的液流形成均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。

将这些液滴充以正负不同的电荷，让其在高压电场的作用下发生偏转，落入各自的收集容器中，而不予充电的液滴则落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

流式细胞术(贝克曼)

个体化医疗
通过将流式细胞术与基因组学、蛋白质组学等技术相结合，未来有望实现个体化医疗的精准诊断和治疗。这将为患者提供更加定制化的治疗方案，提高治疗效果和生存率。
THANKS
感谢观看
血液学研究
造血干细胞研究
利用流式细胞术研究造血干细胞的自我更新、分化等过程，有助于血液疾病的诊断和治疗。
白血病分型与诊断
通过流式细胞术对白血病细胞进行分型和鉴别，有助于白血病的诊断和治疗。
红细胞与血小板检测
利用流式细胞术检测红细胞和血小板的数量和质量，有助于贫血和出血性疾病的诊断和治疗。
04
流式细胞术的优缺点
优点
快速
灵敏度高
流式细胞术可以在短时间内处理大量样本，提高了检测效率。
流式细胞术能够检测到低浓度的细胞，灵敏度较高。
多参数分析
自动化程度高
流式细胞术可以对细胞进行多参数分析，包括细胞表面抗原、细胞内蛋白质和DNA 等。
流式细胞术通常采用自动化仪器进行操作，减少了人为误差和操作时间。
发展历程
20世纪50年代
流式细胞术的原理被提出，并开始应用于细胞计数和大小测量。
20世纪80年代
计算机技术的引入，实现了自动化数据分析。
20世纪70年代
荧光染料和荧光显微镜的引入，使得多参数检测成为可能。
21世纪
高通量测序技术的发展，推动了流式细胞术在基因组学和蛋白质组学领域的应用。
应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、细胞因子等，研究免疫细胞的分化、发育和功能。
血液学研究
用于检测血液细胞，诊断血液疾病，如白血病、淋巴瘤等。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的表面标志物、基因突变等，为肿瘤的诊断和治疗提供依据。

流式细胞术简介

数据分析
—设门 —设定阴性与阳性群体的界限 —确定阳性与阴性细胞群体 —统计阳性或阴性细胞群体的百分率，
平均荧光值，绝对数或抗体结合数
如何设定阴性与阳性的界限
直方图
散点图
流式细胞术的细胞学应用
细胞结构
细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量蛋白质含量染色体分析
Review
SSC
Data Processin
g
FL4
FL2
FSC FL1 FL3
Review Questions
1. Which of the following fluorochromes cannot be used with the FACSCalibur?
a. DAPI (ex. 345 nm, emits 455 nm) b. Propidium Iodide (ex. 536 nm, emits 617 nm) c. Alexa Fluor 647 (ex. 650 nm, emits 668 nm)
Optics
• Excitation optics consist of:
Lasers Lenses and mirrors that route the laser light to the
fluidic stream
• Collection optics consist of:
Filters that direct the signals to the appropriate optical detectors
流式细胞仪系统
简介 —通过流式细胞仪我们可以得到以下信息
- 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度

流式细胞术

• 凋亡： • 由于凋亡细胞核酸内切酶活化， DNA 降解，细胞 DNA 减少，因而可在 G0/G1 峰前出现一个亚二倍体峰，也就是凋亡峰。检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。
2 细胞表型分析：
• 细胞表型的分析得益于单克隆抗体的产生及发展，现在CD系统已有247种之多。细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一般用直标法，也可用间标法。荧光探针多为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、 APC等。
四、流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，并通过专用的DNA分析软件，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。
• 肿瘤诊断： • DNA 异倍体的出现是癌变的一个重要标志，细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此，临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和 DNA 倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。
应用血小板无力症诊断： CD41/CD61缺失或异常巨大血小板综合征诊断： CD42a/CD42b缺失免疫性血小板减少性紫癜诊断： PAIgG 血栓前状态与血栓性疾病诊断：血小板活化异常
4 红细胞疾病诊断
网织红细胞计数与应用 • 网织红细胞是未完全成熟的红细胞，胞浆中仍残留有不同含量的 RNA 。 RNA 含量越高，网织红细胞越幼稚，反之，则接近于成熟红细胞。网织红细胞是反映骨髓红系造血的指针。用荧光染料噻唑橙(Thiazole Orange，TO)可使活体网织红细胞中 RNA 染色，用 488nm 激光激发后发射绿色荧光， FCM 分析其荧光强度的大小可测量网织红细胞的数量和RNA含量。主要用于贫血筛查。 • 睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的诊断 • 红细胞表面CD59缺失

流式细胞术简介

FCM是集现代电子物理技术、激光技术、电子计算机技术和流体力学等于一身的高科技仪器，开创了荧光技术的又一个崭新的领域。近年来，此项技术发展十分迅速。具有更高灵敏度、更高分辨率、双激光、多荧光参数分析的仪器不断问世，并在朝着经济实用、操作简便、小巧精制、自动化程度高的方向发展。确信，流式细胞分析技术进一步与其它技术的结合，将极大的推动生物医学的发展。
FACS Vantage DiVa
FACSAria
The BD FACSAriaTM cell sorter sets a new standard for high performance flow cytometry. Based on a revolutionary new design in instrumentation, this easy-to-use benchtop system delivers high-speed sorting and multicolor analysis.
BD公司自从1974年第一台商用流式细胞仪问世一直致力于流式细胞仪的创新。 BD FACSCanto™ benchtop flow cytometer继承了这个传统。它的主要特这是： 1. 真6色容纳能力——从少量的样品量中获取每个细胞更多的信息。 2. 敏感性(<50 MESF PE, <100 MESF FITC*) ——解决最微弱的events。 3. 快速(10,000 events/sec) — 加速稀少事件的获取。 4. Low carryover (<0.1%) — 使样品污染最小化。 5. 更换透镜键盘化 —不用工具更换滤光片。 6. Fixed optical alignment — 免除用户调节。 7. 日常管理自动化 — 为科研节约更多时间。

流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.

Counts
Event #
FL1 FITC
1
10
2 700
3 720
4
15
……
0…………10…………100…………1000 FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。
FL-2(-)
FITC 单标
PE 单标
FL-2(PE)
FL2 - %FL1 FL-1(FITC)
FL1 - %FL2 FL-1(ion
FL-1(FITC)
After Compensation
FL-1(FITC)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光：荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态，再回到低能态时释放出的光。
＜激发波长
Excitation wavelength

流式细胞

写在课前的话流式细胞术融合了流体动力学、激光技术、电子工程、计算机技术和单克隆抗体染色技术等多学科的知识，成为一个专门的领域。

它不仅应用于细胞生物学、植物学、分子生物学、生物化学、微生物学等理论科学的研究，以及血液学、免疫学、病理学、肿瘤学、遗传学等临床医学的疾病诊断和治疗，而且可以应用于农林畜牧养殖业及环境、食品、药品等检测等，因此学习其原理极其重要。

一、流式细胞术概念(一) 概念流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是上世纪70年代的一项高新技术，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。

其研究对象为生物颗粒，包括各种动物植物细胞、微生物及人工合成微球等。

研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并同时进行定量的一项技术。

目前这项技术已广泛应用于生物学和医学的各个领域，已成为细胞学分析领域中不可替代的重要工具。

(二) 流式细胞术的特点1. 快极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。

2. 准可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。

3. 精通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。

（三）流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM ）操作流程流式细胞术的操作流程简单概括为：培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织、骨髓、外周血、脱落细胞等不同类型的样品。

首先制备成单细胞悬液后，再经过荧光染色就可以上机进行检测。

如果需要分选，可以通过细胞分选把感兴趣的细胞分选出来进行进一步培养或者进行其他生物学行为的研究。

流式细胞术

流式细胞术流式细胞术(flow cytometry)是利用流式细胞仪(flow cytometer)快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术。

流式细胞仪通过接收激光照射后液流内细胞的散射光信号和荧光信号反映细胞的物理化学特征，如细胞的大小、颗粒度和抗原分子的表达情况等。

原理：流式细胞术是特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流,产生的光信号被多个接收器接收,一个是在激光束直线方向上接收到的散射光信号(前向角散射),其他是在激光束垂直方向上接收到的光信号,包括散射光信号(侧向角散射)和荧光信号。

液流中悬浮的直径从0.2~150μm的细胞能够使激光束发生散射光,细胞上结合的荧光素被激光激发后能够发射荧光。

散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收,根据信号的强弱波动就能反映出每个细胞的物理化学特征。

三大要素：流式细胞术有三大要素,分别为流式细胞仪、样品细胞和荧光染料或者荧光素偶联抗体。

流式细胞术是在流式细胞仪上操作的,流式细胞仪根据其功能的不同可以分为分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪,前者只能流式分析,不能分选纯化目标细胞,后者能够同时进行流式分析和流式分选。

检测对象：流式细胞术检测的对象是细胞,而且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞,即单细胞悬液。

流式细胞术不能直接检测组织块中的细胞，要检测脏器或组织中的细胞,必须先用各种方法将脏器或组织制备成单细胞悬液,然后标记上荧光素偶联抗体,才能被流式细胞仪检测。

流式细胞术不能直接检测分子,但是用人工合成的颗粒代替细胞,然后将该分子的抗体与人工颗粒结合，可以间接检测分子,如用CBA法检测细胞因子等。

流式细胞术可以定量检测样品细胞的物理化学特征,其定量是以光信号为基础的,通过分析接收到的激光照射到细胞后的散射光信号和荧光信号完成定量分析。

样品细胞只有标记荧光染料或者荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号,从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱情况等化学特征,否则只能通过分析散射光信号得到样品细胞体积大小和颗粒度等物理特征。

一.流式细胞术概述

一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。

它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。

在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。

流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。

BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。

EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。

二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。

2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。

3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。

4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。

医学专题流式细胞术描述

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1.流式细胞术分析的基本原理
前向散射与侧向散射是细胞的固有属性，暂称为物理属性。
荧光信号是人们通过不同手段将荧光物质结合在细胞上，是人为属性，暂称为化学属性。
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R1：淋巴细胞 R2：单核细胞 R3：粒细胞 R4：红细胞裂解碎片和少量血小板
将目的细胞群圈定（即设门），然后将门内细胞以FSC或SSC为横坐标，荧光信号为纵坐标的散点分布图表示出来，此图中细胞会出现在与其 FSC或SSC相应的位置，并只可能表现两种情况：荧光信号弱或无、荧光信号强或有。
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补偿对照
由于光谱的重叠，对于多色分析样本必须设置补偿对照。补偿对照主要用于多色分析时荧光光谱重叠的补偿调节。
补偿对照是将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本反应，一一进行单色标记，以测定荧光信号的重叠并作适当调节。
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2.一套完整的流式细胞术检测样本设置
细胞数的百分比。
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分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群
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3.流式细胞仪荧光补偿设置
以FITC、PE双色分析为例：
（1）先调节阴性对照管（即同型对照IgGFITC、IgGPE）：先将原补偿清零，通过调节电压，使阴性群落在FITC和PE 双阴性区。阴性对照的作用是，调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。
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看图技巧：
1.先看横、纵坐标，了解检测目的；
2.看图形分布，直方图峰形越往右移，代表其荧光强度越强；
3.M1的确定是根据阴性对照细胞的基础荧光域值设定的，峰形右移，荧光信号大于基础荧光域值（M1），表示阳性（M2）；