分子生物学检测技术要求与质量控制

蛋白质检验区
— 功能及要求
蛋白质分离纯化区
➢主要功能：用于蛋白质的分离与纯化。 ➢工作区域要求：蛋白质纯化应具备低温 工作的场地，如4℃冷房和/或层析柜等。
蛋白质分离纯化区
➢主要功能：蛋白质分析检测
control test
阳性结果
阴性结果Leabharlann Baidu
检测工作流程
实验室样品到样验收（确定是否具备检验的基 本条件）混样获取测试样品à测试样品的制 备（待检状态） 核酸和/或蛋白等目标物质 的提取 PCR实验（包括扩增和产物分析）和 /或蛋白质检测结果判定结果表述（出具检 验报告）
实验室质量控制和质量保证
－ 避免各类实验污染
避免扩增产物污染 PCR扩增反应液中加入UDG酶，以dUTP代替dTTP
可防止以前PCR扩增产物所致的遗留污染。 避免RNase污染（RNA检测）
戴口罩和手套； DEPC； 高温烘烤； RNase抑制剂 避免操作过程污染
实验室质量控制和质量保证
－工作人员操作要求
应具备良好的分子生物学专业技术操作规范。 方向：试剂贮存和准备区样本制备区核酸 制备区扩增区扩增产物分析区
实验室质量控制和质量保证
－仪器设备要求
各实验区域应有专用的仪器设备，同一 区域内的仪器设备、物品和工作服应有明 显标记，避免与其他区域的仪器设备混用。
➢工作区域的压力要求：未设缓冲间的试剂贮存和 准备区，工作区域为正压。
➢注意事项：当试剂经质检合格后，应将其分装贮 存备用，贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内 一次测定所需的扩增反应数决定。用于扩增的试剂 应冰冻贮存。
核酸检验区各区功能
— 样品制备区
➢主要功能：实验室样品的混样和测试样品的制备。
实验室质量控制和质量保证
－试剂要求
除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不 含DNA、DNase和RNase的分析纯或生化试剂。
实验用水应符合GB 6682-92中一级水的规格。去 离子水的电阻应达到18.2Ω。
商品试剂盒应注明到货日期，对所收到的试剂盒 应按规定的贮存条件存放。
实验室质量控制和质量保证
试剂质检包括①有无污染，是否存在假阳性； ②使用弱阳性对照标准物质检测试剂的扩增效 果。
实验室质量控制和质量保证
－ 防止污染
严格实验室分区
对实验室进行功能分区，各区的工作服、实验 用具和实验记录本应区分标记，不能混用。
样品管理
送检样品的包装应完好并有明确的标识；在对 实验室样品进行混样、测试样品的制备和称量 过程中应避免交叉污染。
❖ 核酸检验区
试剂贮存和准备区; 样品制备区; 核酸制备区
扩增区; 扩增产物分析区
❖ 蛋白质检验区
蛋白质分离纯化区
蛋白质检测区
❖ 其它区域
设置洗涤消毒室（洗涤、消毒、制备纯水和/ 或双蒸水、制冰等）、高速/超高速离心机室、 低温/超低温冰箱室等。
核酸检验区各区功能
— 试剂贮存和准备区
➢主要功能：原装试剂和配制试剂的贮存，所有试 剂的配制与分装。
实验过程的质量控制
实验室质量控制和质量保证
－ 实验过程的质量控制
实验室环境对照 阴性质控对照
核酸提取空白对照：核酸提取过程中不加样品的空白管； PCR试剂对照：不含DNA/cDNA模板的PCR扩增反应液试剂； 阴性目标DNA对照：即为内源基因对照，与测试样品等同处理。 阳性质控对照 检验PCR反应是否正常进行（试剂+设备）
分子生物学检测技 术要求与质量控制
宁夏疾病预防控制中心 二O一O年五月
实验室技术要求
❖总体要求 ❖质量控制 ❖质量保证
实验室总体要求
❖ 实验室分区要求 ❖ 实验室工作人员要求 ❖ 安全防护 ❖ 废弃物处理 ❖ 结果判断与验证
实验室分区要求 —设施和环境要求
各工作区域设置缓冲间，缓冲间的压力为负压（或 上设抽风装置），与其相连的工作间为正压，工作间 与缓冲间之间宜安装磁性连锁装置。
不同功能的核酸检验工作区应是分隔独立的工作室， 并有明显的标志，各区间不能直通。各区之间如果是 紧密相连，需安装物品传递舱。
每个工作区域的顶部应安装紫外灯，紫外灯的波长 为254 nm，安装数量为每20 m2安装一支40W的紫外 灯，灯与地面的距离不宜超过（2.0±0.1）m。
实验室分区要求
—工作区域的设置及要求
➢工作区域的压力要求：未设缓冲间的样品制备区， 工作区域为负压或减压，可安装排风系统。
➢注意事项：此区应远离其它实验操作区，所用的 器具在使用前应经过彻底清洗并高压消毒，防止交 叉污染。
核酸检验区各区功能
— 核酸制备区
➢主要功能：核酸的提取纯化与贮存；核酸含量的 测定；测试样品DNA的保存。
➢工作区域的压力要求：未设缓冲间的核酸制备区， 工作区域为负压或减压，可安装排风系统。
➢注意事项：严格限制无关人员出入并减少在本区 内走动；加样应在超净工作台（生物安全柜）内进 行，超净工作台的气流方向宜选择垂流式；巢式 PCR的第二次加样必须在此区进行。
核酸检验区各区功能
— 扩增产物分析区
➢主要功能：扩增产物的测定 ➢工作区域的压力要求：未设缓冲间的扩增产物区，工 作区域为负压或减压，应安装排风系统。 ➢注意事项：此区是最主要的扩增产物污染来源，应远 离其它实验操作区。 若实验仅采用全自动扩增检测仪（如实时荧光定量PCR 仪），可将扩增区与扩增产物分析区合并为一个区。
－试剂配制
实验室配制的试剂应在容器上标明试剂名称、浓度、 配制时间、保存条件、失效日期及配制者姓名。
所用试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后高压灭 菌保存，不宜高压灭菌的试剂应过滤（0.22 μm） 除菌；PCR主混液、引物、探针应避免反复冻融。
实验室质量控制和质量保证
－试剂配制
实验室应确定关键试剂，并在使用前进行质量 检测。关键试剂包括：核酸提取试剂、RNase、 蛋白酶K、阴性对照标准物质、阳性对照标准 物质、Taq酶、各种限制性内切酶、引物、探针、 菌种、阳性质粒。
➢注意事项：已纯化的核酸应保存于－20℃或－ 80℃，避免反复冻融；阳性和阴性标准物质DNA可 调整至常用的使用浓度后分装并冷冻保存。
核酸检验区各区功能
— 扩增区
➢主要功能：PCR扩增反应体系的配制和模板的加 入，核酸扩增。
➢工作区域的压力要求：未设缓冲间的扩增区，工 作区域为负压或减压，可安装排风系统。