血凝与血凝抑制试验标准方法
血凝抑制试验
血凝抑制试验1 适用范围本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。
本标准适用于禽流感抗体的检测（主要适用于血清样品）。
2 血凝试验2.1 材料与试剂2.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、高压灭菌器、刻度离心管、微量移液器及96孔V形微量血凝板。
2.2.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。
2.2.3 1%鸡红细胞悬液。
2.2.4 阿氏液。
2.2.5 血凝抗原、被检血清。
2.2 操作程序A. 取96孔V形微量血凝板，用微量移液器在第1孔~第12孔加25 μL生理盐水，共滴2排。
每排的第1孔加入抗原25 μL，用微量移液器，从第1孔~第11孔对抗原作系列倍比稀释：即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次后，吸出25 μL移至第2孔，再反复吹吸3次后，吸出25 μL移至第3孔，以此类推，直至第11孔。
从第11孔中吸出25 μL弃去，此孔抗原的最终稀释度为1:211（即11 log2）。
第12孔作为对照孔。
B. 每孔中加入25 μL生理盐水，再加入1%鸡红细胞悬液25 μL。
C. 将血凝板置于微量振荡器上500 r/min振荡1~2 min。
D.在室温18~25℃下静置20~40 min，或37 ℃静置15~20 min，或4 ℃静置60 min。
红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。
2.3 抗原血凝效价判定A. 在反应时间内，对照孔的红细胞全部沉淀时，观察判读血凝结果。
对于使用V形孔微量血凝板进行的试验，将血凝板倾斜70°，观察沉淀于孔底的红细胞是否沿倾斜面向下呈线状流动（红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底），以出现全部凝集（红细胞无流动）的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，该效价为1个血凝单位（HAU）。
3 血凝抑制试验3.1 血清的处理3.1.1 被检血清样品准备被检血清，包括阳性、阴性血清，置于56 ℃水浴中30~45 min，以破坏补体及血凝抑制因子。
病毒的血凝及血凝抑制试验
病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。
通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
[目的要求]掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
[材料与试剂]1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50μL定量移液器，滴头，微型振荡器。
2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]（一）血球凝集(HA)试验1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50μL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50μL；第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：μL）弃504. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。
红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。
从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二) 血球凝集抑制(HI)试验1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。
正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。
各种病毒的血凝素性质不尽相同。
某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。
某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。
病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。
血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。
而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。
血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。
以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。
各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下：1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高压灭菌备用。
2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。
血凝和血凝抑制试验操作要领
血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验是目前我国各地对新城疫、禽流感等疾病进行流行病学调查、疫病诊断、防疫监测、免疫程序制定等工作的主要依据，各大型养殖场、兽医门市、畜牧局、兽药疫苗生产厂家均可以进行操作。
该试验方法具有经济、快速、可靠、操作简便和对抗体水平进行量化的优点，能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽类血样的抗体滴度水平。
但是实验用材料不标准、操作不规范等因素也会影响到试验结果的准确性，导致试验的失败。
笔者就血凝-血凝抑制试验中关键步骤介绍如下，供同行参考。
1原理说明某些病毒具有凝聚某些动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称为血球凝集试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但是病毒的血凝可为相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制实验，具有特异性，通过HA-HI实验，可用已知的血清来鉴定未知的病毒。
2试验前准备2.196孔V型微量反应板选用规则标准的96孔V型微量反应板，V型孔底需光滑明亮，对底部磨损严重的反应板要及时淘汰。
使用前先用酒精棉擦拭干净，再用蒸镏水反复冲洗多次，在温箱中烘干备用；使用后及时将反应板用自来水反复冲洗(以孔底不留沉积的红血球为准)，再将沾有洗涤剂溶液的棉拭刷洗凹孔及板面，然后再用自来水反复冲净每个凹孔及板面，待反应板干燥后，放到2％～3％浓度的盐酸中浸泡24h以上。
2.2待检血清用于分离血清的血液必须是新鲜无污染的，采集血样后置于硅化管或一次性塑料离心管内，水平放置，保证血样与空气最大限度的接触，先置于37℃环境下半小时，再置于4℃环境下数小时，8000～10000r/min离心3~5min，将析出的血清移入清洁的包装内备用。
4℃的冰箱中冷藏可保存5d，长时间保存可冷冻存放，冷冻后会出现蛋白质局部浓缩、分布不均的现象，在检测前应充分混匀。
2.31%红细胞最好选用健康、未经过疫苗免疫的成年SPF公鸡，如若没有SPF公鸡也可以使用低抗体鸡提供的红细胞但需要更多次的洗涤(5遍以上)，建议用3只以上鸡的血液混合制备红细胞悬液。
血凝、血凝抑制试验
⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。
5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。
清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。
3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。
在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。
使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。
现⽤现配。
4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。
5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。
血凝与血凝抑制试验原理
血凝与血凝抑制试验原理
血凝与血凝抑制试验是一种常用的血液凝血功能检测方法，用于评估体内凝血系统的功能状态。
血凝试验原理：
血凝试验通常采用活化部分凝血时间（APTT）或凝血酶时间（TT）来衡量血液凝血的能力。
在血凝试验中，通过向血浆中加入一定量的凝血酶原激活体（如凝血酶），观察血浆在特定条件下形成凝块的时间。
正常血液凝固功能良好的人，凝血时间较短，血浆在凝血酶原激活体的作用下能很快形成凝块。
血凝抑制试验原理：
血凝抑制试验是为了检测某些抗凝物质（如抗凝血酶、抗凝血酶原等）对凝血系统的抑制作用。
在血凝抑制试验中，首先向血浆中加入一定量的凝血酶原激活体，观察血浆在特定条件下形成凝块的时间。
然后再加入待测的血凝抑制物质，在不同浓度下观察凝血时间的变化。
如果抗凝物质的浓度越高，凝血时间延长的程度越大，则说明该抗凝物质对凝血系统的抑制作用越强。
血凝与血凝抑制试验的原理即通过衡量血浆的凝血时间来评估凝血系统的功能状态或抑制物质的抑制能力。
血凝与血凝抑制试验标准方法
血凝抑制（HI）试验操作规程1.仪器、设备和试剂的准备1.1仪器及设备V型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的八道加样器、小圆底试管、吸管。
1.2抗原和试剂：1.2.1相应HI抗原1.2.2相应阳性血清1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液）1.2.41%鸡红细胞悬液1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血）1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm离心5分钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm离心5-10分钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。
按上述步骤，用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm离心10分钟（确保红细胞的压积）。
1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml，加入99ml生理盐水摇匀配制成1%的红细胞悬液。
（按照需要量配制）1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬液60ml，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm离心5分钟，红细胞压积应为0.6ml2．HI抗原工作液配制2.1HI抗原血凝价测定血凝试验：1．取一块V型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul，将HI抗原进行系列倍比稀释，至11孔后吸取25ul弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul生理盐水，最后每孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
表1病毒血凝试验孔号：123456789101112滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水252525252525252525252525抗原(病毒)2525252525252525252525弃去生理盐水252525252525252525252525红细胞悬液252525252525252525252525轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果图1如图1所示为禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的血凝价测定，第9孔为能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数，因此该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝价为1:5122.2HI抗原工作液配制及检验2.2.14HA100单位的抗原配制4个100%血凝单位（即4HA100）抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4图1所示禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的4HA100单位的抗原=512/4=1282.2.24HA100单位抗原的检验4HA100单位抗原的检验按表2进行。
血凝实验和血凝抑制实验报告
血凝实验和血凝抑制实验报告一、引言血液凝固是维持人体生命活动的重要生理过程之一。
当人体受到损伤时，血液会迅速凝固形成血块，以阻止出血。
然而，血液凝固过程的异常可能导致血栓形成，进而引发心脑血管疾病。
因此，准确评估血液凝固功能对于疾病预防和治疗至关重要。
二、血凝实验血凝实验是一种常用的临床实验方法，用于评估血液的凝固功能。
该实验主要通过测量血液在一定时间内凝固的程度来获得结果。
常见的血凝实验包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板计数和纤维蛋白原测定等。
1. 凝血酶原时间（PT）凝血酶原时间是评估外源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶原转化为凝血酶所需的时间来测定。
正常情况下，PT 的时间范围为11-13秒。
若PT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
2. 活化部分凝血活酶时间（APTT）活化部分凝血活酶时间是评估内源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶形成所需的时间来测定。
正常情况下，APTT 的时间范围为25-35秒。
若APTT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
3. 血小板计数血小板计数是评估血小板功能的指标。
血小板是血液中的细小细胞片段，主要参与血液凝固过程。
正常情况下，血小板计数在150-450×10^9/L之间。
若血小板计数过低，则可能导致出血倾向。
4. 纤维蛋白原测定纤维蛋白原是血液凝固过程中的重要物质，参与形成纤维蛋白凝块。
纤维蛋白原测定可以评估纤维蛋白原的含量。
正常情况下，纤维蛋白原的浓度在2-4 g/L之间。
若纤维蛋白原浓度过低，则可能导致凝血功能异常。
三、血凝抑制实验血凝抑制实验是一种检测血液凝固抑制功能的方法。
该实验主要评估抗凝血酶、抗纤维蛋白聚合酶等物质对血液凝固过程的抑制作用。
1. 抗凝血酶实验抗凝血酶是一种重要的抗凝物质，可以抑制凝血酶的活性。
抗凝血酶实验通过测定血浆中抗凝血酶的活性来评估抗凝血酶功能。
试验四血凝及血凝抑制试验
血凝现象：有些病毒表面有血凝素，可凝集人,鸡,豚鼠等动物RBC。
原理：血凝素与RBC表面相应受体结合，引起RBC凝集；
用途：①滴定病毒的血凝效价，为血凝抑制试验做准备；
②确定病毒的存在；
凝集效价：能使血球产生++凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价，
即0.25 ml病毒液含1个血凝单位。在病毒血凝抑制试验中，一般用4个血 凝单位。
(1:64) 0.25
(1:128) (1:256) 0.25 0.25 0.25
0.5%RBC 0.25
(negative control) mix, RT, 45min~1hr，observation
血凝抑制试验
血凝抑制现象： 血凝素抗体使病毒失去凝集红细胞能力的现象。作
为临床检测试验，可用于检测血清中抗体含量或鉴 定病毒。称为血凝抑制试验。
(1:160) 0.25 0.5
(1:320) (1:10) 0.25 0.5 0.25(NS) 0.5 (Serum control)
V(4U)
0.25
0.5%RBC 0.5
Mix, RT, 1hr, observation
RBC凝集状态的解释
++++: agglutination of all RBC +++: agglutination of about 75% RBC
具体方法：
Tube
NS 血清 弃 0.25ml
1
0.45 0.05 (1:10)
2
3
4
5
6
7
0.45 0.05
↘
0.25 0.25
血凝和血凝抑制实验
实验三血凝和血凝抑制实验一、实验目的与要求掌握血凝和血凝抑制实验操作及应用二、实验内容H5亚型猪流感抗体检测与分析三、实验步骤（一）血凝（HA）试验1、用微量移液枪在微量反应板的第一排1-12孔均加入50μLPBS，换枪头；2、吸取50μL抗原，加入第一孔，反复吹打5次混匀；3、从第一孔吸取50μL加入第二孔，吹打混匀吸取50μL加入第三孔，如此稀释至第11孔，从第11孔吸取50μL丢弃，第12孔作为红细胞对照；4、各孔均加入50μL0.5%鸡红细胞悬液（已充分摇匀）；5、轻轻混匀，室温25℃静置20min观察结果；（二）血凝抑制（HI）试验1、血清样品处理：先加150μL胰酶溶液于300μL血清中，56℃水浴灭活30min 后冷却至室温；加900μL高碘酸钾，混合，室温孵育15min；加900μL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min；加750μL生理盐水混合，4℃保存；2、根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4单位抗原；3、在微量反应板第5-8排的2-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；4、吸取50μL血清（编号为2-4血清、阳性血清、编号为1-4血清、阴性血清）加入第1孔，混匀后吸取25μL于第二孔，混匀后吸25μL于第三孔，依次稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL；5、各排前11孔均加入4单位抗原25μL，第12孔作为红细胞对照，室温下25℃静置30min；6、各孔均加入50μL0.5%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻摇匀，室温下25℃静置30min。
四、实验结果及分析血凝（HA）试验，从第三个孔开始显示“滴泪”第一排为阳性对照第二排为阴性对照第三排，血清5-6第四排，血清6-6参考文献[1]GB/T 27535-2011，猪流感HI抗体检测方法[S].。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验随着养殖业的飞速发展和广大养殖户科学意识的不断提高，人们普遍认识到实验室检测技术在临床应用的重要性。
下面简单介绍一下鸡新城疫微量血凝试验和血凝抑制试验的注意事项及操作方法。
应用：用于新城疫、产蛋下降综合征和传梁性支气管炎等的母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后的免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。
下面以新城疫病毒为例，介绍血凝和血凝抑制试验的方法：注意事项：一、样本要具有代表性：所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般1000只以下的鸡群采样率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。
对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。
方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸馏水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。
每只鸡采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室温下静置至血清自然析出。
二、四单位抗原的准确性：要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。
三、红血球洗脱的充分性：原则上，新城疫检测所用的红血球应来源于非疫苗免疫过的健康公鸡，但实际上却多采用免疫过疫苗的健康公鸡，有时甚至是病鸡。
因此，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，通常采用五次变速离心法：前四次为每分钟1500转，每次5分钟，最后一次为每分钟3000转，持续7～8分钟。
另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。
四、结果判定的及时性：检测中，每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。
血凝与血凝抑制试验的操作方法一、材料与仪器：新城疫抗原、1%鸡红血球、抗凝剂、生理盐水、被检血清、离心机、吸管、滴管、洗耳球、烧杯、量筒、注射器、长针头、96孔V型医用血凝板、微量移液器、微量振荡器、恒温培养箱、冰箱等。
血凝和血凝抑制试验
3. 4.
பைடு நூலகம்
0.85%生理盐水。 生理盐水。 生理盐水 被检血清，采自被检鸡的健康血清。 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、操作步骤
（一）血凝试验（HA） 血凝试验（ ）
1. 在血凝板第一排的 在血凝板第一排的1~12孔加入 孔加入50µl生理盐水。 生理盐水。 孔加入 生理盐水 2. 在第1孔中加入 病毒抗原， 在第 孔中加入50µl病毒抗原，反复吸取混匀 孔中加入 病毒抗原 后吸50µl到第 孔，如此倍比稀释直到第 孔， 到第2孔 如此倍比稀释直到第10孔 倍比稀释直到第 后吸 到第 混匀后弃50µl； 最后两孔 （ 11、 12） 为红细 ； 最后两孔（ 、 ） 混匀后弃 胞对照。 胞对照。
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25
弃 50µl /
50 / / 50
25 50
注： 11孔为病毒对照 应该完全凝集， 12孔为细胞对照 孔为病毒对照， 孔为细胞对照， 1) 第 11 孔为病毒对照 ， 应该完全凝集 ， 第 12 孔为细胞对照 ， 应该完全沉积到孔底，只有当对照成立时试验结果方有效。 应该完全沉积到孔底 ， 只有当对照成立时试验结果方有效。 以红细胞100 凝集的稀释度为判定终点。 100% 2) 以红细胞 100% 凝集的稀释度为判定终点 。 血凝抑制滴度大 于等于1 为阳性，小于1 为阴性，等于2 为可疑。 于等于1：24为阳性，小于1：22为阴性，等于23为可疑。
病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开， 2 ） 病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开 ， 血凝素呈游离状态，例如天花 牛痘、 天花、 血凝素呈游离状态，例如天花、牛痘、鼠痘等 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 3 ） 脑炎病毒 、 口蹄疫病毒等 ， 凝集红细胞的条 脑炎病毒、 口蹄疫病毒等， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 同时还要掌握反应的pH和温度等。 同时还要掌握反应的pH和温度等。 pH和温度等
血凝血抑实验操作方法
血凝血抑实验操作方法
血凝血抑实验是用于检测血液中凝血系统的功能活性以及血管壁退行性变的一
种实验方法。
以下是一般的血凝血抑实验的操作方法：
1. 准备实验材料：新鲜的血液样本（采集静脉全血，使用无抗凝剂采血管），离心管，血小板计数管，玻璃片，25ml量瓶，10ml吸管，实验药物（如凝血因子和抗凝剂），计时器等。
2. 静脉全血采血：无菌条件下，采用无抗凝剂采血管从肘静脉采集血液样本。
要确保血液样本无抗凝剂，否则可能会影响实验结果。
3. 离心采血管：将静脉全血样本转移到离心管中，进行离心，用离心管分离血浆和红细胞。
4. 准备血浆：将离心后的上清液（血浆）转移到另一个离心管中，避免污染。
5. 凝血时间测定：取一份血浆加入25ml量瓶中，并在37水浴中预热。
同时，另取一份新鲜全血作为对照。
用吸管将凝血药物垂直加入含血浆的25ml量瓶中，计时器计时，观察血浆的凝固时间。
6. 凝固酶测定：将凝血酶加入血浆中，搅拌均匀后，记录酶加入后的凝固时间。
7. 抗凝物质测定：分别加入抗凝物质（如肝素）到血浆中，搅拌均匀后，记录凝固时间。
8. 结果分析：根据实验结果，可判断凝血系统的功能活性以及抗凝系统的功能活性。
较长的凝血时间可能暗示凝血系统功能较差，而较短的凝血时间可能暗示凝血系统功能较好。
需要注意的是，血凝血抑实验是一种较为复杂的实验，需要在严格的实验条件下进行，并且实验药物的使用应遵循安全操作规范。
此外，实验结果需要结合临床病史和其他检查结果进行综合判断。
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)
B
11
2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
2.1采血 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡， 可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与 阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。 2.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃 上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分 钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过 程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过 5天。 2.3 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离 心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管 中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的PBS，用吸管反复吹吸使PBS与红 细胞混合均匀。 2.4 1%鸡红细胞液 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mLPBS， 混合均匀即可。
实验一鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法
鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。
3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。
器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。
(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。
（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。
如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。
再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。
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血凝抑制（HI）试验操作规程
1.仪器、设备和试剂的准备
1.1仪器及设备
V型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的
八道加样器、小圆底试管、吸管。
1.2抗原和试剂：
1.2.1相应HI抗原
1.2.2相应阳性血清
1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液）
1.2.41%鸡红细胞悬液
1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后
上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血）
1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm离心5分
钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm离心5-10分
钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。
按上述步骤，
用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm离心10分钟（确保红细胞的
压积）。
1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml，加入99ml生理盐水摇匀配制成1%的红细
胞悬液。
（按照需要量配制）
1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬
液60ml，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm离心
5分钟，红细胞压积应为0.6ml
2．HI抗原工作液配制
2.1HI抗原血凝价测定
血凝试验：
1．取一块V型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul，将HI抗原进行系列倍比稀
释，至11孔后吸取25ul弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul生理盐水，最后每
孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后
判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
表1病毒血凝试验
孔号：123456789101112滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照
生理盐水252525252525252525252525抗原(病毒)2525252525252525252525弃去生理盐水252525252525252525252525红细胞悬液252525252525252525252525
轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果
图1
如图1所示为禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的血凝价测定，第9孔为能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数，因此该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝价为1:512
2.2HI抗原工作液配制及检验
2.2.14HA100单位的抗原配制
4个100%血凝单位（即4HA100）抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4
图1所示禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的4HA100单位的抗原=512/4=128
2.2.24HA100单位抗原的检验
4HA100单位抗原的检验按表2进行。
检查血凝价是否准确，应将配置好的4HA100单位的抗原再用生理盐水稀释，使其稀释度为1:2、1:3、1;4、1:5、1:6、1:7。
将每一稀释度的抗原25ul加入生理盐水25ul，最后加入1%鸡红细胞悬液25ul，用微量振荡器中速振匀，置室温（20~25℃），20~30分钟后判定结果。
将血凝板在20~25℃下放置20~30分钟后，如果1:4稀释度是100%红细胞凝集终点，说明配制的是4HA100单位的抗原；如果100%红细胞凝集终点是1:5或1:6说明配制的4HA100单位抗原实际上高于4个单位；如果100%红细胞凝集终点是1:2或1:3说明配制的4HA100单位抗原实际上低于4个单位。
使用时应根据检验结果做适当调整，使抗原工作液确为4HA100单位
表14HA100单位抗原的检验
孔号：123456
4HA100抗原的稀释度1:21:31:41:51:61:7
稀释的4HA100抗原252525252525
生理盐水252525252525
1%鸡红细胞悬液252525252525轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果
2.2.34HA100单位抗原的调整
稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释倍数x原4HA100单位抗原的稀释倍数/4
图2
如图2所示，使100%红细胞凝集终点的稀释倍数为1:3，说明配制的4HA100单位抗原实际
上低于4个单位，所以调整后的4HA100单位抗原稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释
倍数x原4HA100单位抗原的稀释倍数/4=3X128/4=96
按1:96稀释禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原，制成4HA100单位抗原。
3．血凝抑制试验（HI）
3.1取96孔微量反应板，分别向1~12孔中加入25ul生理盐水。
3.2吸取25ul待检血清，加至第一孔内，充分混匀后，吸取25ul至第二孔，依次2倍稀释
至第十孔，从第十二孔中吸取25ul弃去。
3.3每块板上设置标准阳性对照和阴性对照，稀释方法同3.2
3.4分别向1~12孔中加入含4HA100单位的抗原25ul，微量振荡器中速混匀后室温（20~25℃
左右）静置20~30分钟。
3.5每孔中加入25ul1%鸡红细胞悬液，微量振荡器上轻轻震荡均匀，室温下（20~25℃）
静置20~30分钟。
3.6结果判定凝集现象表现为红细胞平铺在V型管底壁，凝集严重时红细胞膜片边缘可
能出现卷边现象。
未凝集的红细胞在V型血凝孔中呈现为明显的红色圆点。
将反应板倾斜
45度角后判定结果，当红细胞呈现泪滴状流淌且没有凝集颗粒时为100%抑制。
当阴性血清
HI效价≤2log2、阳性血清HI效价与已知结果相比误差≤1log2时，试验方可成立。
以完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度作为HI效价。
表396孔板微量法血凝抑制试验
孔号：123456789101112
血清稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照
生理盐水252525252525252525252525
被检血清2525252525252525252525弃去4HA100抗原252525252525252525252525
轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后加入红细胞悬液
红细胞悬液252525252525252525252525
轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果
图3
如图3所示，抗体1完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第10孔，故其效价为1:1024；抗体2和抗体3完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第9孔，其效价为1:512，阴性血清完全凝集，阳性血清与已知效价一致，因此该结果成立。
附：
阿氏液配方：
葡萄糖 2.05克
柠檬酸钠0.8克
柠檬酸0.055克
氯化钠0.42克
加蒸馏水至100毫升，调PH值至6.1，115度，10分钟灭菌。
4度保存。
使用比例：静脉血液与阿氏液1:1。
PBS1L配方pH7.4：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.28g，
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.15g，
氯化钠(NaCl)：8g，
加去离子水定容到1L。
抗凝剂配方：
柠檬酸钠3.8g
加蒸馏水至100毫升，10分钟灭菌。
4度保存。
使用比例：静脉血液与抗凝剂1:9。