ITC等温滴定量热法的操作说明资料

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等温滴定量热法讲解

等温滴定量热法讲解

– 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性,因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果,这有助于发现新现象和新规 律,特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
– ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术能提 供完全无标记且液相的分析环境,同时无需靶点高分子或配体的固定。ITC 的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数,包括结合常 数(Ka)、结合位点数(n)、摩尔结合焓(△H)、摩尔 结合熵(△S)、摩尔恒压热容(△Cp),和动力学参数(如 酶促反应的Km和kcat),用来表征生物分子间的相互作用。
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独特特点:
– 样品用量小,方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW,最小可 检测热效应0.125uJ,生物样品最小用量0.4ug,温度范围2 ℃ - 80 ℃,滴 定池体积(1.43 ml)。
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history
built in the secondhalf of the 1960s to study chemical reactions.
During the1970s, the sensitivity of instruments was in the range of mJ, and other first applications were developed such as the study of (metal + ligand) complexes [8] and the adsorption of aromatic compounds by molecular sieves .
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等温滴定量热法.

等温滴定量热法.
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰(上 图)下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时,就获得了相互作 用的完整结合等温线(下图)。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一
个变化过程的量热曲线,原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动 力学信息,它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数,包括结合常数(Ka)、 结合位点数(n)、摩尔结合焓(△H)、摩尔结合熵(△S)、摩尔恒 压热容(△Cp),和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat)
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INS
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟,并加上几分钟的响应时间), – 操作简单(整个实验由计算机控制,使用者只需输入实验的参数,如温度、 注射次数、注射量等,计算机就可以完成整个实验,再由Origin软件分析 ITC得到的数据)。 – 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏,还 可以进行后续生化分析。 – 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性,因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果,这有助于发现新现象和新规 律,特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产 生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中,通过那个细细的 管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差, 另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候,释放或者吸 收热量,因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定 在一个水平,就是baseline。因此那些用来维持Δ T1=常数的热量就被系统检 7 Page 7 测画作曲线。

ITC200简易操作指南3

ITC200简易操作指南3

ITC200简易操作指南1ITC200介绍等温滴定量热仪ITC200由控制器和主机组成。

其中主机包括塔台,滴定注射器,测量池以及清洗单元等部件。

溶液瓶是清洗单元的一部分,通过管道和清洗平台相连。

主机上方白色托盘内的金属槽内是 ITC200的样品池和参比池。

2实验准备2.1仪器的清洁操作前需要确认ITC200的样品池是否洁净,可以通过向样品池,参比池和滴定注射器中都加入脱气的超纯水,然后通过水滴水的实验观察噪音水平,确认是否洁净。

如果样品池比较脏,可使用5%-20 %的去垢剂 Contrad 70(或 Decon 90)浸泡半小时,浸泡时同时将样品池加温到50 摄氏度,以彻底去除黏附的杂质。

随后用Cell water rinse 命令,用超纯水清洗样品池。

使用 syringe wash 命令,清洗滴定注射器。

清洗后再通过水滴定实验进行确认。

2.2样品的准备滴定与被滴定样品需要溶解在完全一致的缓冲液中,如果缓冲液不一致,则需通过透析或者超滤等手段进行置换,并保留透析或者超滤尾液,作为参比缓冲液。

通常将大分子的蛋白作为被滴定样品,放于样品池中,通常浓度为 50 µM, 参比池中放入超纯水。

将小分子或相互作用的另一方装于滴定注射器中,通常浓度为样品池中浓度的10-15 倍。

3实验设计ITC200的控制软件整合了方便的实验设计的功能。

在软件的Experimental design 标签页中输入预估的相互作用的化学计量比(N),选择相互作用体系,软件将自动估计解离平衡常数(K D);输入反应焓变(ΔH)后,软件就会自动给出预估的实验结果图,以及推荐使用的样品浓度。

4实验确定实验用的样品浓度后,就可对样品池和滴定针进行加样。

4.1样品池加样取下上样针,检查是否干净,并用缓冲液润洗。

,用上样针慢慢吸取约300 ul的样品,小心去掉针管中的气泡。

将上样针垂直插入样品池,直到针头触到样品池底部,然后向上提起1 mm。

ITC等温滴定量热法的操作说明资料

ITC等温滴定量热法的操作说明资料

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INS
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一
个变化过程的量热曲线,原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动 力学信息,它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数,包括结合常数(Ka)、 结合位点数(n)、摩尔结合焓(△H)、摩尔结合熵(△S)、摩尔恒 压热容(△Cp),和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat)
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产 生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中,通过那个细细的 管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差, 另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候,释放或者吸 收热量,因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定 在一个水平,就是baseline。因此那些用来维持Δ T1=常数的热量就被系统检 7 Page 7 测画作曲线。
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics.
Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰(上 图)下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时,就获得了相互作 用的完整结合等温线(下图)。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。

等温滴定量热法

等温滴定量热法

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滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行,被滴定物可以是液体或悬 浮的固体;滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用(例如一种有机分子吸附于固体表面)引 起的。 实验数据以热谱图形式表示,它提供了有关反应中物质的量(滴定终 点)和反应物质的特性(焓变)的数据。对图进行分析,可以得知反 应容器中发生的反应的类型和数目,以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这部分内容称为热滴定,同时还可以确定反应的化学计量关 系,计算反应的热力学量,如平衡常数K(Δ G°)、标准状态下的焓变Δ H° 和熵变Δ S°,这部分内容称为滴定量热法。 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、 介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、 非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟,并加上几分钟的响应时间), – 操作简单(整个实验由计算机控制,使用者只需输入实验的参数,如温度、 注射次数、注射量等,计算机就可以完成整个实验,再由Origin软件分析 ITC得到的数据)。 – 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏,还 可以进行后续生化分析。 – 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性,因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果,这有助于发现新现象和新规 律,特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
翟丽婷 2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术(ITC)是一种监测由结合成分的添加而起始的任何

ITC(等温滴定量热)培训第一课原理介绍

ITC(等温滴定量热)培训第一课原理介绍

+
- 焓变和熵变均不利,反应不会自发进行
16 / 29-0301-14 AA
ITC 在生命科学和药物研发中的应用
• 分析生物分子的相互作用
– 证实结合以及活性 – 确定化学计量比和热力学参数
• 研究任意两个生物分子的相互作用
– 蛋白,核酸,脂质,药物,抑制剂等 – 结构生物学以及结构-活性间的关系
10 / 29-0301-14 AA
热力学 1(4)
kcal/mole of injectant
0
Ligand A into
-2
compound X
-4
-6
-8
-10
-12
-14
0
Ligand B into compound X
1
2
3
4
Molar ratio
相同的亲和力和化学计量比,但是 不同的焓变 (热量)
MicroCal™ ITC 系统 培训课程
等温滴定量热法 (ITC) 的介绍
目标
• 等温滴定量热(ITC)的原理介绍 • 介绍焓,熵和自由能的定义,理解生物分子相互作用和分子识
别 • 常用应用的介绍
4 / 29-0301-14 AA
为何使用微量热技术?
无标记
宽广的动态范围
信息丰富
使用方便
• 直接测量热量变 化 (ITC)
这告诉我们不同的结合机制
11 / 29-0301-14 AA
热力学 2(4)
DG = RT ln KD DG = DH –TDS
ΔH,焓 (enthalpy),反映氢键和范德华键 的变化
-TΔS, 熵(entropy),反映疏水作用的变化 和/或构象变化

等温滴定量热仪(ITC)

等温滴定量热仪(ITC)

无需标记、无需检测方法开发,快速获得结果
ITC 是基于复合物形成时所放出或吸收的热量的精确测定,它是在一个实验中能够同时测量所有结 合参数的先进技术。它测量在天然状态下结合伴侣的亲和力,无需使用荧光标签修饰组分或使样品 固定化。 总而言之,ITC 是与众不同的。
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) 应用研究领域目录
B
A
0 -2
ऐ዆ ( ∆H)
10 5 փ૧ ∆G ∆H -T ∆S ᆶ૧
kcal/mole ጀ෇࿿
-6 -8 -10 -12 -14 0 1 ఊܻԲ ࣅბऺଉბ (n) 2 ൕࢅ૰ (K D)
kcal/mole
-4
0 -5 -10 -Байду номын сангаас5 -20
A. ITC 测量热力学性质包括:相互作用的化学计量学(n)、亲和力常数(KD)、焓变化(∆H)、熵变化(∆S)。 B. 利用三个具有相同结合能 (∆G) 的相互作用解释热力学特征。 结合亲和力是结合焓 ( ∆H) 和结合熵 ( ∆S) 的共同作用的结果。 结合焓反映了由于氢键形成和范德华力产生的相互作用强度。结合熵是复合物形成时来自去溶剂化和构象变化的熵变化 的组合。
* 具体应用参考文献查阅可登陆
4
技术优势及应用实例 :
将药物的先导化合物的优化 带到一个新的水平
更深刻的见解
药物应该以高亲和力和选择性结合目标。传统上,先导化合物的优化一直被剖析亲和力组成的研究 所推动。然而,热力学变量 ( ∆H, ∆S) 也是结合的基础,它们能够提供有关相互作用的更深刻的见解。 MicroCal ™量热仪具有足够的灵敏度和通量用于有效测定先导化合物优化所需的所有结合参数,以 指导先导化合物的优化。

ITC

ITC

等温滴定量热法(ITC)是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术。

它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。

ITC是唯一一种能够在一次试验中同时确定所有结合参数的技术。

ITC可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力,无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰。

通过测量结合过程中的热传递,就能够准确地确定结合常数(K D)、反应化学量(n)、焓(∆H)和熵(ΔS)。

这就提供了有关分子相互作用的完整热力学信息。

ITC不仅可测定结合亲和力,还能阐明潜在分子相互作用的机制。

更深入了解结构-功能关系,让我们能够更加自信地在苗头化合物选择和先导化合物优化方面作出决策。

用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数,包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容,和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。

测量原理:等温滴定量热法用来测定各生物分子之间的反应。

该方法可测定结合亲和力、化学计量以及溶液中结合反应的熵和焓,无需使用标记。

发生结合时,热不是被吸收就是被释放,这是在配体被逐渐滴定到包含目标生物分子的样品池过程中通过灵敏量热计而测得。

热核心微量热计中有两个池,其中一个含有水,作为参比池,另一个含有样品。

微量热计必须使这两个池保持完全相同的温度。

热敏装置检测发生结合时两个池之间的温差,并反馈给加热器,由加热器来补偿该温差并使两个池恢复到相同的温度。

进行测量参比池和样品池被设定到所需的实验温度。

将配体装入一个非常精确的注射装置上的注射器中。

将注射装置插入包含目标蛋白质的样品池中。

将一系列小份配体试样注入到蛋白质溶液中。

如果有配体与蛋白质结合,则可检测到并测出几百万分之一摄氏度的热量变化。

进行第一次注射时,微量热计测量被释放的所有热量,直到结合反应达到平衡。

测得的热量与结合量成正比。

结果和数据分析在下面的示例中,反应是放热的,这就意味着样品池温度高于参比池并由此导致信号出现下行波峰。

ITC等温滴定量热法的操作说明资料

ITC等温滴定量热法的操作说明资料

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作用机理争论与分析开发
〔△G〕与总的结合亲和力直接 相关,但不能了解结合机理。
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ITC供给了〔△G〕以及〔△H〕 和〔△S〕,产生了结合机理的真 实图像。
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ITC:用生物相关模型系统架起桥梁
▪ ITC的关键优势之一是创立生物相关试验的独特力气。再没有其他技术 能供给完全无标记且液相的分析环境,同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
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▪ 滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进展,被滴定物可以是液体或悬 浮的固体;滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用〔例如一种有机分子吸附于固体外表〕引 起的。
▪ 试验数据以热谱图形式表示,它供给了有关反响中物质的量〔滴定终 点〕和反响物质的特性〔焓变〕的数据。对图进展分析,可以得知反 响容器中发生的反响的类型和数目,以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这局部内容称为热滴定,同时还可以确定反响的化学计量关 系,计算反响的热力学量,如平衡常数K(ΔG°)、标准状态下的焓变ΔH° 和熵变ΔS°,这局部内容称为滴定量热法。
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独特特点:
– 它对被争论体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件,即 具有非特异性的独特优势,
– 样品用量小,方法灵敏度和准确度高(仪器最小可检测热功率2 nW,最小可 检测热效应0.125uJ,生物样品最小用量0.4ug,温度范围2 ℃ - 80 ℃,滴 定池体积(1.43 ml)。
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ITC等温滴定量热法的操作说明解读

ITC等温滴定量热法的操作说明解读
Assessment of biological activity.
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在恒温下,注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中,两种物质相互作用,释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时,热量信号减弱,直到只观察到稀释的背景热量。
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独特特点:
– 它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件,即 具有非特异性的独特优势,
– 样品用量小,方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW,最小可 检测热效应0.125uJ,生物样品最小用量0.4ug,温度范围2 ℃ - 80 ℃,滴 定池体积(1.43 ml)。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术(ITC)是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
化学反应的热力学技术,即用一种反应物滴定另一种反应物,随着加 入滴定剂的数量的变化,测量反应体系温度的变化
ITC提供了(△G)以及(△H) 和(△S),产生了结合机理的真 实图像。
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ITC:用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境,同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
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INS
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典型的ITC数据

等温滴定量热法

等温滴定量热法

它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一
个变化过程的量热曲线,原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动 力学信息,它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数,包括结合常数(Ka)、 结合位点数(n)、摩尔结合焓(△H)、摩尔结合熵(△S)、摩尔恒 压热容(△Cp),和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat)
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ITC法测量结合/解离常数
ITC可以直接测量焓变△H,结合常数Ka,而不对反应体系产生影响,也不引 12 Page 12 入修饰基团,因此测得的结果更加可信
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作用机理研究与分析开发
(△G)与总的结合亲和力直接 相关,但不能了解结合机理。
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics.
Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.
Assessment of biological activity.
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在恒温下,注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中,两种物质相互作用,释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时,热量信号减弱,直到只观察到稀释的背景热量。

等温滴定量热法

等温滴定量热法
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟,并加上几分钟的响应时间), – 操作简单(整个实验由计算机控制,使用者只需输入实验的参数,如温度、 注射次数、注射量等,计算机就可以完成整个实验,再由Origin软件分析 ITC得到的数据)。 – 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏,还 可以进行后续生化分析。 – 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性,因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果,这有助于发现新现象和新规 律,特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
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Page 9
典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰(上 图)下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时,就获得了相互作 用的完整结合等温线(下图)。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
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独特特点:
– 它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件,即 具有非特异性的独特优势,
– 样品用量小,方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW,最小可 检测热效应0.125uJ,生物样品最小用量0.4ug,温度范围2 ℃ - 80 ℃,滴 定池体积(1.43 ml)。
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ITC法测量结合/解离常数
ITC可以直接测量焓变△H,结合常数Ka,而不对反应体系产生影响,也不引 12 Page 12 入修饰基团,因此测得的结果更加可信
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作用机理研究与分析开发

等温滴定量热法讲解

等温滴定量热法讲解

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The inflection points, which reflect the stoichiometry of the formed complexes, are close to one in case of mPEG5kad indicating that each adamantane group is associated with one β-CD molecule. This is in agreement with other reports showing a 1:1 binding stoichiometry between adamantane derivatives and β-CD . In case of mPEG5kchol, the stoichiometry was close to three, which had also been reported previously .The higher order of complexation may be due to self-association of cholesterol and/or partial inclusion of the cholesterol side chain into the β-CD cavity
We found that mPEG5k-chol exhibited a higher binding affinity than mPEG5k-ad
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules.表征小分子的相互作用

等温滴定量热法

等温滴定量热法

等温滴定量热法在一次实验中直接进行关于生物分子亲和力和热力学特性的无标记测定等温滴定量热法(ITC)是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术。

它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。

ITC是唯一一种能够在一次试验中同时确定所有结合参数的技术。

ITC可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力,无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰。

通过测量结合过程中的热传递,就能够准确地确定结合常数(K D)、反应化学量(n)、焓(∆H)和熵(ΔS)。

这就提供了有关分子相互作用的完整热力学信息。

ITC不仅可测定结合亲和力,还能阐明潜在分子相互作用的机制。

更深入了解结构-功能关系,让我们能够更加自信地在苗头化合物选择和先导化合物优化方面作出决策。

测量原理:等温滴定量热法用来测定各生物分子之间的反应。

该方法可测定结合亲和力、化学计量以及溶液中结合反应的熵和焓,无需使用标记。

发生结合时,热不是被吸收就是被释放,这是在配体被逐渐滴定到包含目标生物分子的样品池过程中通过灵敏量热计而测得。

工作原理热核心微量热计中有两个池,其中一个含有水,作为参比池,另一个含有样品。

微量热计必须使这两个池保持完全相同的温度。

热敏装置检测发生结合时两个池之间的温差,并反馈给加热器,由加热器来补偿该温差并使两个池恢复到相同的温度。

进行测量参比池和样品池被设定到所需的实验温度。

将配体装入一个非常精确的注射装置上的注射器中。

将注射装置插入包含目标蛋白质的样品池中。

将一系列小份配体试样注入到蛋白质溶液中。

如果有配体与蛋白质结合,则可检测到并测出几百万分之一摄氏度的热量变化。

进行第一次注射时,微量热计测量被释放的所有热量,直到结合反应达到平衡。

测得的热量与结合量成正比。

结果和数据分析在下面的示例中,反应是放热的,这就意味着样品池温度高于参比池并由此导致信号出现下行波峰。

随着两个池的温度恢复到同一水平,信号也回到其起点。

将第二小份配体试样注入到样品池中,同样,微量热计补偿所检测到小幅热量变化。

ITC(等温量热滴定法)

ITC(等温量热滴定法)
式中, [Xt] – 结合物的总浓度 [Mt] – 被结合物(即试样)的总浓度 V0– 样品池的有效体积 dQ – 在滴定过程中,每个滴定点对应的热量变化 K – 结合常数 n – 每个试样分子的结合位点个数
GE Healthcare 公开技术质料
ITC实验注意事项
¾ Wiseman c-parameter:表征结合反应的亲和力与ITC实验设计的关系 c = n[M]K
• 样品池最大容积: VP-ITC:1.4mL ITC200 :200μL
• 微量注射器最大容积: ITC200 :40μL
• 单次最小注射量: ITC200 :0.1μL
• 响应时间: ITC200 :10s
GE Healthcare 公开技术质料
什么是等温滴定量热法?
等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry,简称 ITC) ¾ 定义:
GE Healthcare 公开技术质料
ITC应用举例
评估蛋白产品质量
两个批次的同种蛋白与某一种标准多肽的结合活性比较
KD = 97 nM n=1
第1批蛋白产品 两次ITC实验: 样品池蛋白浓度 10μM 标准多肽50μM GE Healthcare 公开技术质料
KD = 135 nM n = 0.23
h0氢键范德华力疏水作用gehealthcare公开技术质料itc应用举例药物研发早期阶段对假正面结果的排除药物研发早期阶段对假正面结果的排除筛选能与目标蛋白tp筛选能与目标蛋白tp特异性结合的化合物已知化合物x可与目标蛋白tp特异性结合性结合根据itc得k与其他实验方法所得结果相吻合与其他实验方法所得结果相吻合因此化合物x适于进一步研究化合物x与tp的itc结果gehealthcare公开技术质料itc应用举例药物研发早期阶段对假正面结果的排除药物研发早期阶段对假正面结果的排除与tp左

等温滴定量热法(ITC)

等温滴定量热法(ITC)

等温滴定量热技术摘要:生物大分子可以和很多配体特异性结合,当物质结合时,热量要么产生,要么吸收。

生物大分子与配体相互作用的定量描述需要确定反应过程中热力学参数的变化。

相互作用过程中产生的热量变化可以用量热计定量监测。

等温滴定量热技术(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术,它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。

它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线,原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息,如结合常数(Ka)、结合位点数(n),结合焓(△H)、熵(△S)、恒压热容(△Cp)和动力学数据(如酶促反应的Km和kcat )。

这些信息提供了生物分子相互作用的真实写照。

由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化,所以ITC具有很广泛的应用,它可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。

关键字:等温滴定量热技术、相互作用、热力学商业化的测量生物分子相互作用热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。

从此这种技术被广泛应用。

在过去的20年中,等温滴定量热技术(ITC)成为研究相互作用的常用方法。

随着现代ITC仪器的发展,ITC更加灵敏、快速、易用。

分子识别是一个复杂的过程,是生命活动的基础。

生物分子识别过程需要结合反应的热力学参数来阐明。

等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化,确定反应的结合常数K B 、结合计量比(n)、反应焓变(∆H)、熵变(∆S)、恒压热容(△Cp)和动力学数据(如酶促反应的Km和kcat )等热力学参数,用来表征生物分子间的相互作用。

等温滴定量热法

等温滴定量热法

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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics.
Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产 生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中,通过那个细细的 管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差, 另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候,释放或者吸 收热量,因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定 在一个水平,就是baseline。因此那些用来维持Δ T1=常数的热量就被系统检 7 Page 7 测画作曲线。
ITC提供了(△G)以及(△H) 和(△S),产生了结合机理的真 实图像。
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ITC:用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境,同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一
个变化过程的量热曲线,原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动 力学信息,它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数,包括结合常数(Ka)、 结合位点数(n)、摩尔结合焓(△H)、摩尔结合熵(△S)、摩尔恒 压热容(△Cp),和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat)
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