凯氏定氮法
凯氏定氮法
1、消化取两个凯氏烧瓶标号，一只加1.0ml蒸馏水作为空白对照，另一只加1.0ml样液。
各加硫酸钾和硫酸铜混合物约20mg、浓硫酸2ml。
烧瓶口插一漏斗（冷凝用），烧瓶置于电炉上加热。
开始时应注意火力，以免使瓶内液体冲至瓶颈。
待瓶内水气蒸完，硫酸开始分解生成SO2白烟时，适当加强火力，直至消化液透明并呈但旅色为止（约2~3h），用木夹取出，冷却，准备蒸馏。
2、蒸馏取50~100ml锥形瓶3只，先按一般方法洗净，再用蒸汽洗涤数分钟，冷却。
用移液管各加入2%硼酸溶液5.0ml和指示剂4滴。
如瓶内液体呈葡萄紫色，可再加硼酸液5ml，盖好备用。
如锥形瓶内液体呈绿色，需用蒸汽重新洗涤。
1.安全管2.导管3.汽水分离管4.样品入口5.塞子6.冷凝管7.吸收瓶8.隔热液套9.反应管10.蒸汽发生瓶微量凯氏蒸Array馏装置如图所示，蒸汽发生器内盛放有滴加数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。
加热后，产生的蒸汽经储液管、反应室至冷凝管，冷凝后的液体流入接受瓶。
每次使用前，需用蒸汽洗涤10min左右（此时可用一小烧杯盛接冷凝的水）。
然后将一只盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶放置在冷凝管的下端，并使冷凝管之管口插入酸液面下，继续蒸馏1~2min，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净，否则需再洗。
移去酸液，蒸馏1min，用水冲洗冷凝管口吸去反应室残夜。
将消化好的消化液，由小漏斗加入反应室，用蒸馏水洗涤凯氏烧瓶2次（每次约2ml），洗涤液均经小漏斗加入反应室，再在冷凝管下置一盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶，并使冷凝管口插入酸液面下0.5cm处（10mL酸液置于50~100mL锥形瓶内，液体深度不大，可将锥形瓶斜放。
冷凝管口必须插在液面下，但也不宜太深，这样，万一发生倒吸现象时，硼酸液也不致被吸入反应室内）。
用小量筒取10~15mL30%的NaOH溶液，倒入小漏斗，放松弹簧夹，让NaOH溶液缓缓流入反应室，当小漏斗内剩下少量NaOH溶液时，夹紧夹子，再加入约3mL蒸馏水于小漏斗内，同样缓慢放入反应室，并留少量水在漏斗内做水封，即可蒸馏。
凯氏定氮法
凯氏定氮法中文名称：凯氏定氮法英文名称：Kjeldahl determination定义：测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4凯氏定氮法反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4（其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法（英语：Kjeldahl method，全称凯耶达尔定氮法，简称凯氮法）是分析化学中一种常用的确定有机化合物中氮含量的检测方法。
这种方法是由凯耶达尔于在1883年发明。
凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。
要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变成无机氮，再进行测定。
一、原理：凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。
为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。
硫酸铜起催化剂的作用。
凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。
使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。
消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。
在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。
测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。
以蛋白质为例，反应式如下：消化：蛋白质+ H2SO4→（NH4）2SO4+ SO2↑+ CO2 ↑+ H2O蒸馏：（NH4）2SO4 + 2NaOH→ Na2SO4+ 2 H2O + 2NH3 ↑2NH3 + 4H3BO3→（NH4）2B4O7+ 5H2O滴定：（NH4）2B4O7+ 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4 H3BO3蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量[约在14％~18％，平均为16％（质量分数）]。
凯氏定氮法
2.4 注意事项
（1） 所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加
指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性。 （2） 若样品含脂肪或糖较多时，应注意 发生的大量泡沫 应加入少量辛醇或液体 石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外， 并注意适当控制热源强度。 （3） 若样品消化液不易澄清透明，可加 入300g/L2~3ml 过氧化氢后再加热。
消化反应方程式如下： 2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4 ＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2 COOH＋ ＋16H2O 浓硫酸具有脱水性: 浓硫酸具有脱水性:使有机物脱水后被炭化为碳、氢、 氮。 硫酸又具有氧化性: 硫酸又具有氧化性:将有机物炭化后的碳化为二氧化 碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4
③ 滴定 滴定：取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标 准溶液滴定至微红色为终点。
(V1 − V0 ) × c × 0.014 × F (5) 结果计算： W = ×100% V2 m× 100
式中W—蛋白质的质量分数，%； V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数； m—样品质量，g。
② 蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O OH＋
凯氏(Kjeldahl)定氮法
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。
1. 2 特点
凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
1. 原理
凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：
CH2COOH
| + 3H2SO4——2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
凯氏定氮法
凯氏定氮法
称取大米试样m克(0.65 g左右)（建议称取1.00-1.50g左右的样品），置于干燥的250mL 定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20mL浓硫酸，由GB/T5009.5-2003第一法，试样消化完全后（消化变绿之后继续消化半小时即可）移入100mL容量瓶中，并用蒸馏水定容，移取50 mL试样处理液加入定氮蒸馏装置中，加入50 mL氢氧化钠溶液(400 g/L)，以硼酸溶液(20 g/L) 50 mL作为吸收液，并加入3滴甲基红-亚甲基蓝指示液，蒸馏，用c (1/2H2SO4) =0.04526 mol/L硫酸标准滴定溶液滴定，同时进行空白试验，并在结果中加以校正。
计算公式：X=(V1-V2)×c×0.0140m×V50/V100×100(1)
其中：X—样品中蛋白质的含量(以氮计)，单位：g/100g；V1—试样消耗硫酸标准滴定溶液的体积，单位：mL；V2—试剂空白消耗硫酸标准滴定溶液的体积，单位：mL；c—硫酸标准滴定溶液的浓度，单位: mol/LV50—用50 mL移液管移取试样消化液的体积，单位: mL；V100—用100 mL容量瓶定容的试样消化液体积，单位：mL；m—样品的质量，单位：g0.0140~ 1.0 mL硫酸[c (1/2H2SO4) =1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位：g。
通过以上公式就能够准确的测定出大米中的蛋白质含量。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法是一种广泛用于土壤、水、肥料和动物组织中测定氮含量的方法。
该方法是由德国化学家凯斯于1883年首次提出的。
凯氏定氮法的原理是利用氮在含钾氢氧化物中的氧化反应。
将样品中的氮以铵离子（NH4 +）的形式存在，加入烧化的硫酸钾，硫酸钾中产生的氢氧根离子（OH-）将氨气与水反应生成氢氧化铵，并将硫酸钾还原成硫酸亚铁（Fe2+）。
然后向还原的溶液中滴加过量的高浓度二氧化钠，使溶液中的氢氧化铵被完全氧化成氮气（N2），同时钠离子（Na+）与氢氧根离子（OH-）中和生成水。
通过测定生成的氮气体积或气压，计算出原样中氮的含量。
凯氏定氮法的步骤如下：1. 取100g样品，加入含有15mL浓盐酸的锥形瓶中，用热板加热溶解。
2. 过滤后将滤液倒入蒸发皿中，置于水浴上加热，使溶液蒸干。
3. 将蒸干的样品装入蒸发皿，加入一定量的硫酸钾和硝酸，加热至燃烧，使硫酸钾氧化氨气和有机氮化合物，同时硝酸氧化硫酸钾。
4. 然后加入一定量的水，将溶液转移到滴定瓶中，用含NaOH的滴定液滴定溶液中的酸，使溶液呈中性。
5. 加入过量的NaOH，使氢氧化铵完全转化为氨气。
6. 用滴定管向滴定瓶中加入用水稀释过的二氧化钠，使溶液中氧化铵转化为氮气并与钠离子中和。
7. 通过测定生成的氮气体积或气压，计算出原样中氮的含量。
凯氏定氮法的优点是测定结果稳定可靠，精度高，操作简便快捷，适用于各种类型的样品。
但是，该方法存在着一些局限性，例如可能会受到含有硫酸盐或硝酸盐的干扰。
此外，由于该方法不能分离不同形式的氮，因此不能区分有机氮和无机氮。
总之，凯氏定氮法是一种简便快速、精度高的测定氮含量的方法，已广泛应用于农业、环境和生物学等领域。
凯氏定氮法
凯氏定氮实验一．实验背景柯达尔定氮法又称为凯氏定氮法。
凯氏定氮法是一种测总的有机氮的方法，可用于所有的动植物食品的分析，在国内外的应用都较为普遍，迄今被作为法定的标准检验方法。
测定的原理是：样品中的含氮有机化合物，经浓硫酸加热硝化，有机质被破坏，之中的C和H变成CO2和H2O逸出，而NH3则与H2SO4结合生成(NH4)2SO4或者NH4HSO4留在溶液中。
将溶液中的NH3碱化，游离，然后蒸出。
放出的NH3用硼酸吸收，以混合指示剂指示终点。
用H2SO4或HCL标准溶液滴定上述溶液，呈淡紫红色为终点，这样可计算出总氮量，进而计算出蛋白质的含量。
二．实验仪器和药品Hcl标准溶液、H3BO3饱和溶液、浓 H2SO4、40%NaOH溶液、 K2SO4（固体）CuSO4（固体）、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，未知样、煮解瓶。
烧瓶、升降台、锥形瓶、定氮装置三．实验步骤（1）煮解。
在煮解瓶总加入K2SO4-CuSO4(1:3)约15㎎，浓硫酸2ml：在加入未知样，在煮解瓶上加分液漏斗后在通风橱中加热煮解样品，等反应物变成淡蓝绿或几乎无色时，继续煮解30min，冷却后加入3ml蒸馏水，继续冷却。
（2）蒸馏。
在烧瓶中加入2/3的蒸馏水，沸石，2滴浓硫酸后加热。
等水沸腾后让水蒸气流遍整套装置5-10min。
用蒸馏水润洗仪器两遍。
（3）在锥形瓶中加入10ml饱和硼酸溶液，4滴混合指示剂。
在冷凝管中通冷水，末端浸入液面以下，自蒸馏瓶上端漏斗中加入煮解液，用蒸馏水淋洗煮解瓶两遍，并将煮解液全部移入蒸馏瓶中。
（4）自漏斗中加入10ml40%NaOH溶液，关闭漏斗，并用蒸馏水液封。
（5）收集约30ml蒸馏液时，测一样冷凝管末端的pH,如果是中性，则降低锥形瓶，转入下一步滴定。
（6）用0.0025mol/l 标准盐酸，用10ml微量滴定管滴定收集的蒸馏液。
终点时溶液由蓝色变为灰色。
（7）用完全相同的手续与试剂用量进行两次空白试验。
凯氏定氮法
（3）滴定过程
以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色为终点 若呈粉红色，表明已超越滴定终点，可在已滴定 耗用的标准盐酸溶液用量中减去0.02mL，每组样品 的定氮终点颜色必须完全一致。空白对照液接受瓶 内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以 不滴定。记录每次滴定耗用标准盐酸溶液毫升数， 供计算用。
（2）蒸馏，吸收过程
首先在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使 其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许 沸石以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入 反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封， 防止漏气。蒸气发生后，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸 气只能进入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由 反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置 一个锥形瓶接收冷凝水。 从定氮球发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移开煤气灯。 冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于 气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打 开废液排出口夹子放出废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下 换放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口完全浸 没在溶液中，蒸馏1～2min，观察锥形瓶内的溶液是否变色。如 不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去锥形瓶，再蒸馏1～ 2min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测 样品使用。
凯氏定氮装置图
1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管 10.蒸汽发生瓶
凯氏定氮法包括四个过程：
海能K9860全自动凯氏定氮仪
（1）消化、 （2）蒸馏、 （3）吸收、 （液晶显示屏 4、微型打印机
凯氏定氮法介绍
凯氏定氮法介绍一、定义与原理凯氏定氮法是一种测定物质中氮含量的经典方法。
其原理是利用酸在加热条件下将样品中的有机氮转化为氨，再通过与硫酸或磷酸反应生成硫酸铵或磷酸铵，最后通过滴定法测定生成的硫酸铵或磷酸铵的量，从而计算出样品中氮的含量。
二、操作流程1.样品消煮：将样品与硫酸、硫酸铜、和氧化汞一起加热消煮，使有机氮转化为硫酸铵。
2.氨的蒸馏：在凯氏定氮仪中，消煮液经过一系列反应，最终转化为硫酸铵。
再经过蒸馏，将硫酸铵中的氨释放出来。
3.吸氨：释放出来的氨被硼酸吸收，形成硼酸铵。
4.滴定：用标准盐酸溶液滴定硼酸铵，从而计算出氮的含量。
三、实验步骤1.样品消煮：称取适量样品于消煮管中，加入硫酸、硫酸铜和氧化汞，在消煮炉上加热至沸腾并保持30-60分钟。
消煮过程中要注意避免碳化，若碳化则重新进行消煮。
2.氨的蒸馏：将消煮液转移至凯氏定氮仪中，经过反应器、冷凝器、接收瓶等组件，最终将硫酸铵中的氨蒸馏出来。
3.吸氨：将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，形成硼酸铵。
4.滴定：用标准盐酸溶液滴定硼酸铵，记录滴定数据。
5.结果计算：根据滴定数据和公式计算出氮的含量。
四、仪器与试剂1.仪器：凯氏定氮仪、消煮炉、称量纸、称量瓶、容量瓶、滴定管等。
2.试剂：硫酸、硫酸铜、氧化汞、硼酸、标准盐酸溶液等。
五、结果计算根据滴定数据和公式计算出氮的含量。
具体计算公式如下：X=(V-V0)*N*0.0014/(m*10/100)其中：X为样品中氮的含量（单位为g/kg或g/L）；V为滴定样品时消耗的标准盐酸溶液体积（单位为mL）；V0为空白试验消耗的标准盐酸溶液体积（单位为mL）；N为标准盐酸溶液的浓度（单位为mol/L）；m为样品质量（单位为g或mL）；0.0014为氮的原子量；10/100为样品稀释倍数（若样品未稀释则为1）。
六、误差分析误差可能来源于多个方面，如样品消煮不完全、蒸馏过程中氨的损失、滴定时误差等。
为了减小误差，需要注意以下几点：尽量使用新鲜样品，避免样品中氮的损失；消煮过程中要保证温度和时间，避免碳化；蒸馏过程中要保证接收瓶干燥，避免氨的损失；滴定时要按照规范操作，并使用准确的试剂和设备。
凯氏定氮法
凯氏定氮法只能检测蛋白质中氮含量，不能检测氨基酸的含量。
其中蛋白质含量也只是称为粗蛋白质的含量，只是用氮的含量乘以6.25（系数）得出，不是真正的蛋白质的含量。
凯氏定氮法测氮的方法如下：1、称取0.5～1g试样（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g，无水硫酸钾（或硫酸钠）15g，与试样混合均匀，再加硫酸25ml和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加热消化15min。
2、氨的蒸馏（1）常量直接茂馏法将上述的试样消煮液冷却，加蒸馏水200ml，摇匀，冷却。
沿瓶壁小心加入40％氢氧化钠溶液100ml，立即与蒸馏装置相连．蒸馏装置冷凝管的末端应浸入50ml硼酸吸收液lcm。
加混合指示剂2滴，轻摇凯氏烧瓶，使溶液混匀，加热蒸馏，直至馏出液体积约150ml。
先将吸收液取下，再停止加热。
（2）半微量水蒸汽蒸馏法上述试样的消煮液冷却，加蒸馏水20m1转入100ml 容量瓶，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。
取2％硼酸溶液20ml，加混合指示剂2滴，使半微量蕉馏装置的冷凝管末端浸入此溶液；蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此液为橙红色，否则应补加少许硫酸。
准确移取试样分解液10～20ml注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40％氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，并在入口处加水封密好，防止漏气，蒸馏4min，使冷凝管末端离开吸收液面，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
3、滴定用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L的HCI标准溶液滴定，仍以甲基红或混合甲基红为指示剂。
在测定样本中含氮量的同时，应做一空白对照测定，即各种试剂的用量及操作步骤完全相同，但不加样本，这样可以校正因药品不纯所发生的误差，吸收氨后的吸收液立即用0.05mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。
凯氏定氮法
一、凯氏（kjeldahl）定氮法优点：用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少优点①可用于所有食品的蛋白质分析中;②操作相对比较简单;③实验费用较低;④结果准确,是一种测定蛋白质的经典方法;⑤用改进方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的蛋白质缺点①最终测定的是总有机氮,而不只是蛋白质氮;②实验时间太长(至少需要2h才能完成);③精度差,精度低于双缩脲法;④所用试剂有腐蚀性.灵敏度低适用于0.2-1.0mg氮干扰物质：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）；费时太长二Folin-酚试剂法优点：操作简便，灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。
缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。
通常测定范围是20~250mg。
三、Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
凯氏定氮法
③同时作一空白试验，从消化开始到滴定。
④消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘 贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在 的情况下消化不完全而造成氮损失。
⑤ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用 冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进 其消化完全。
⑥ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易 产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始 消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入 少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注 意控制热源强度。
(NH4)2SO4 检验
⑩蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或 黑褐色↓（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如 颜色不变可能碱不够 。
⑾蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗 管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸 收液倒吸。
⑿H3BO3吸收液的温度不应超过40℃，否则对 NH3的吸收作用减弱而造成损失。
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点， 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高 至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。
<2> 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点 指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、 汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。
<3> 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。
2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红 外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消 化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
如何测定蛋白氮？
先把非蛋白质的含氮物与蛋白质分开。一般多 采用沉淀剂（CuSO4 + NaOH，或三氯乙酸 ）， 将蛋白质沉淀析出，经过过滤（或离心分离）， 将沉淀物再用凯氏法测定含N量。
.凯氏定氮法
凯氏定氮法是一种测定食物、饮料或饲料中蛋白质含量的经典方法。
这个实验方法需要使用浓硫酸和催化剂，将样品中的有机氮转化为氨，然后通过蒸馏将氨分离出来，最后用酸滴定液滴定，计算出氮的含量。
凯氏定氮法的步骤如下：
1. 样品处理：将样品研磨并干燥，然后加入硫酸和催化剂，进行消化反应。
这个过程需要控制温度和时间，以免样品烧焦或硫酸过度氧化。
2. 蒸馏：将消化液进行蒸馏，使氨气从溶液中分离出来。
蒸馏过程中需要控制温度和压力，以确保氨气能够完全分离。
3. 滴定：将蒸馏后的溶液用酸滴定液进行滴定，根据颜色变化判断滴定终点。
终点判断需要准确控制，否则会影响测定结果。
4. 计算：根据滴定的酸滴定液的体积和浓度，计算出氮的含量。
凯氏定氮法的优点是准确性高、可重复性好，可以用于测定各种食物、饮料和饲料中的蛋白质含量。
但是，该方法也存在一些缺点，例如需要使用浓硫酸和催化剂，操作比较危险，而且实验过程中会产生有害气体。
此外，凯氏定氮法测定的是样品中的总氮含量，而并非所有的氮都以蛋白质的形式存在。
因此，在某些情况下，可能需要采用其他方法来测定样品中的蛋白质含量。
总之，凯氏定氮法是一种经典的蛋白质测定方法，具有较高的准确性和可重复性。
但是，在操作过程中需要注意安全问题，并且需要控制好各个实验条件，以保证测定结果的准确性。
凯氏定氮法
凯氏定氮法1. 简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种用于测定有机物中氮含量的常用方法。
它是以丹麦化学家尤利乌斯·凯尔达尔（Johan Gustav Kjeldahl）的名字命名的，凯尔达尔于1883年首次提出了这种方法。
该方法适用于几乎所有的有机物样品，例如农产品、食品、肥料、土壤和水等。
凯氏定氮法的优点包括简单、准确、可靠，并且适应性强。
2. 测试步骤步骤一：样品处理将待测样品称取一定量（通常1-2g），精确称量并记录质量。
步骤二：消解将样品转移到凯氏消解管中，加入适量的浓硫酸（H2SO4）。
为使反应顺利进行，可以加入一些催化剂，如汞硫化物（HgS）。
经过消解，样品中的有机氮转为无机氮盐，主要形式为硫酸铵（NH4HSO4）。
消解期间要保持适当的温度控制，一般在沸水浴中加热1-2小时，直至反应结束。
步骤三：蒸馏将消解液转移到凯氏蒸馏装置中，加入含有氢氧化钠（NaOH）和含有酚酞指示剂的接收瓶中。
蒸馏器中的氢氧化钠用于吸收硫酸铵产生的氨气，并将其转化为氨水（NH4OH）。
使用蒸馏水蒸馏样品溶液，将氨气从样品中分离出来。
通过连续蒸馏过程，将氨气捕集在接收瓶中。
蒸馏过程中，要注意控制好蒸馏速度，并确保溶液中氨气的完全转化。
步骤四：滴定将收集到的氨水与盐酸（HCl）标准溶液进行滴定，用来确定氨气的数量。
滴定过程中，使用酚酞指示剂作为指示剂，使溶液在转变至中性时由红色变为无色。
通过滴定得到的氨氮量与消解液中样品的氮量成正比。
3. 计算氮含量根据凯氏定氮法的原理，可以通过以下公式计算样品中氮的含量：氮含量（%） = 滴定液中的NH3-N浓度（mol/L） × 滴定体积（L） ÷ 样品质量（g）4. 注意事项•操作过程中要注意安全，避免与强酸和强碱接触，戴上实验手套和护目镜。
•操作前应将仪器设备清洗干净，以免产生误差。
•消解液中加入的催化剂必须少量使用，过多会导致滴定过程中的误差。
凯氏定氮法
凯氏定氮法编辑锁定凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
中文名凯氏定氮法外文名kjeldahl method分类蛋白质类型生物化学与分子生物学目录1. 1原理2. 2试剂1. 3仪器2. 4操作1. 5计算2. 6注意凯氏定氮法原理编辑蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4凯氏定氮法反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3凯氏定氮法试剂编辑所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
凯氏定氮方法
试剂：1、浓硫酸2、30%过氧化氢（H2O2）3、40%氢氧化钠（NaOH）：400g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中。
4、2%硼酸：20g硼酸溶于1000mL蒸馏水中。
5、100mL 95%乙醇：95mL无水乙醇加5mL蒸馏水。
6、定氮混合指示剂：称取0.5g溴甲酚绿和0.1g甲基红溶于100mL 95%乙醇中。
7、0.02mol/L盐酸（HCl）：1.8mL盐酸加入1000mL蒸馏水中。
操作步骤：一、消化1、称取过0.5mm筛的风干试样0.5g，置于消化管底部，用移液管加入10mL浓硫酸和1.5mL30%过氧化氢，小心摇匀，放置在消化炉中消化2-3小时。
空白样不加任何东西，别的处理都一样。
消化温度420度。
（在消化2小时后观察消化管中样品是否澄清透明，若澄清透明可停止消化，否则接着消化，3小时后停止消化）。
2、消化结束后，在消化炉中冷却半小时后，打开毒气罩，取出消化管放在消化管架上冷却至室温。
3、将消化管中液体无损的转入100mL容量瓶，定容。
4、洗净消化管，从定容后的消化液中取出10mL加入消化管底部。
准备蒸馏。
二、蒸馏1、打开全自动定氮仪预热半小时。
2、取一根消化管加入一些水，加碱，加蒸汽，让仪器运行一遍。
接收液可不用硼酸，用水代替。
3、将加有样品的消化管放入定氮仪，接收液为50mL 2%的硼酸加5滴定氮混合指示剂。
加碱，加蒸汽。
（接收液变为蓝色）三、滴定将0.02mol/L 盐酸加入酸式滴定管中，滴定至蓝色刚变为淡红色为终点。
记录消耗盐酸的体积。
计算公式：。
凯氏定氮法
总氮结果计算
X(g/dL )= (V V0 ) C 0.014 100
v1 5 50
式中：V—— 滴定试样时所需标准酸体积，mL； V0—— 滴定空白时所需标准酸体积，mL； C—— 盐酸标准溶液浓度，mol/L； V1—— 吸取试样体积，mL； 0.014—1mL 1mol/L盐酸标液相当于氮的克数。 有机氮（g/dL )=总氮—氨氮
的铵盐分解产生氨，影响结果
（6）消化时硫酸若用量多，则蒸馏时40%的氢氧化钠也要相应 增加用量。 （7）硫酸钾提高反应温度，但不可过多，否则温度过高，引起 生成的铵盐分解产生氨，影响结果。
蒸馏与吸收
水蒸气发生器： 装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml， 使水呈微红色→按上图所示搭好装置 〖注意〗 ①装置搭建好了之后要先进行检漏，利用虹吸原理。 ②在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml以使其始终保 持酸性，以防水中氨蒸出。
蒸馏、吸收的总反应式
2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↑＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
• 〖注意〗
• 加入NaOH一定要过 量，判断NaOH是否 过量的方法，看反 应室内液体颜色
加碱足量的判断
溶液会产生黑色沉淀 原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜 反应生成氢氧化铜蓝色沉淀，蓝色沉 淀在加热的情况下会分解成黑色的氧 化铜沉淀。 钠 如果没有上述现象，说明氢氧化钠 加的量不足，需要继续加入氢氧化钠， 直到产生上述现象为止。
凯氏定源 2. 烧瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5．玻璃杯 6. 棒状玻塞 7. 反应室 8. 反应室外壳 9. 夹子 10. 反应室中插管 11. 冷凝管 12. 锥形瓶 13. 石棉网
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凯氏定氮法在化学分析中的应用摘要：蛋白质是生命的物质基础，一切有生命的东西都含有不同类型的蛋白质。
蛋白质又是食品的重要组成之一，也是食品中的营养素指标。
它是复杂的含氮有机化合物，其溶液是典型的胶体分散体系，有两性氨基酸以肽键相互连接而成。
蛋白质可以用酶、酸或碱水解，最终水解产物为氨基酸，其中赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸在人体内不能合成，称为必须氨基酸【1】。
他们对人体起很重要的生理功能作用。
在国家标准中，对蛋白质的测定一般采用凯氏定氮法。
下面对蛋白质、凯氏定氮法以及粮油中粗蛋白的测定进行说明。
关键词：凯氏定氮法、粗蛋白、粮油、测试蛋白质：蛋白质为人体补充蛋白质，是人体不可缺少的重要营养素，是唯一可帮助身体形成新组织的营养素，可制造肌肉、血液、皮肤和各种身体器官，蛋白质约占人体体重的20%。
最主要具有以下多种功效：1.提供多种氨基酸，帮助身体制造新的组织以替代老化组织抗衰老。
2.通过增加血红蛋白和胶原蛋白改善皮肤弹性和透明度红润度。
3.调节血液血红蛋白向细胞输送氧和各种营养素，促进机体生长。
4.调节体内水分的平衡。
5.为免疫系统制造对抗细菌和感染的免疫球蛋白和荷尔蒙。
6.在体内制造各种蛋白酶，有助将食物转化为能量，恢复疲劳。
7.均衡提高人体所需的八种必需氨基酸。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同。
故各种不同的蛋白质含氮量也不同。
一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮相当于6.25份蛋白质。
此数值（6.25）称为蛋白质换算系数【2】。
不同种类的粮食油料其蛋白质换算系数也有所不同，如小麦为5.70，谷物及豆类为6.25。
在国家标准中粮食油料中粗蛋白质的测定采用凯氏半微量定氮法。
该法是1883年由丹麦化学家凯道尔（Johan、kjedahl）【3】创立的。
该方法适于以测定任何形态（固体、液体）的样品。
而且具有很高的准确度和精密度。
因此在食品分析、饲料分析、粮食品质分析及种子品质鉴定和生化研究工作中得到广泛应用。
前景：蛋白质是食品中重要营养指标【4】，各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同。
一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。
测定食品中蛋白质的含量对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、指导生产、优化食品配方、提到食品质量具有重要意义。
凯氏定氮法：凯氏定氮法是测定含氮的有机物质（如面粉、谷物、肥料、生物碱、肉类中的蛋白质、土壤、饲料以及合成药物等）中氮含量的重要方法。
测定时将有机试样与H2SO4共煮进行消化分解，为提高沸点促进分解加入K2SO4，通常还加入CuSO4（或汞盐）作催化剂，以提高消化效率。
消化时有机物中的C转变为CO2，H转变为H2O，而N则转变成NH3，H2SO4被还原成SO2和H2O,NH3与过量的H 2SO4结合成（NH4）2SO4或NH4HSO4保留在溶液中，消化液用过量的浓NaOH处理后，再用蒸馏法测定NH4+。
对于含有硝基、亚硝基或偶氮基等的某些有机化合物，在消化前先用还原剂如亚铁盐、硫代硫酸盐及葡萄糖等进行处理，使氮定量转化为铵离子。
目前在我国的国家标准（GB）及国际标准方法中仍却仍凯氏定氮法为标准的检验有机化合物中的含氮量的方法。
优点：1.可用于所有食品的蛋白质分析，2.操作相对简单。
3.试验费用低。
4.结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。
5.有改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微凉的蛋白质缺点：1.最终测定的是总有机物氮，而不只是蛋白质氮2.试验时间太长（至少需要2小时才能完成）3.精度差、精度低于双缩脲法4.所有试剂有腐蚀性粗蛋白含量的测定1.测定原理凯氏法的基本原理是将含有蛋白质的样品与浓硫酸共热使其分解。
其中的氮元素反应生成铵盐，铵盐再与浓硫酸作用，放出的氮气经硼酸吸收后，用盐酸标准溶液滴定硼酸溶液所吸收的氮，计算出试样含氮量，乘以相关的蛋白质换算系数，即得到蛋白质的含量。
（1）消化蛋白质与浓硫酸混合加热，蛋白质被炭化分解，其中的碳被氧化成二氧化碳，所含的氮则转变成氨，并与硫酸化合形成硫酸铵残留于消化液中。
有机物（含N、C、H、O、P、S等元素）+H2SO4—加热- CO2↑+(NH4)2SO4+H3PO4+SO2↑+SO3↑由于上述反应进行很慢，消化需要很长的时间，加入催化剂可加速反应，硫酸铜是常用的催化剂，硫酸钾能提高硫酸的沸点，常将它们混合使用，起加速氧化，促进有机物分解的作用。
（2）蒸馏 消化所得的硫酸铵加碱蒸馏，氨又被释放出来。
（NH 4）2SO 4+2NaOH=2NH 3·H 2O+Na 2SO 4NH 3·H 2O=NH 3↑+H 2O(3) 吸收与滴定 生成的氨用硼酸溶液吸收。
硼酸吸收氨后，指示剂颜色变化，再用盐酸滴定，直至恢复到原来的氢离子浓度为止，用去盐酸的物质的量即相当于样品中氮的物质的量。
2NH 3+4H 3BO 3=(NH 4)2B 4O 7+5H 2O(NH 4)2B 4O 7+2HCl+5H 2O=2NH 4Cl+4H 3BO 3将含氮量乘以蛋白质换算系数，即为粗蛋白质含量。
2.仪器与用具50mL 凯氏烧瓶；1000mL 园底烧瓶；万用电炉；100mL 锥形烧瓶；5mL 微量滴定管，刻度0.01mL ；50mL 容量瓶；5mL 移液管；10mL 量筒；洗耳球；凯氏微量蒸馏装置。
3. 试剂（1） 浓硫酸+过氧化氢+水混合液 在100mL 水中缓慢加入浓硫酸200mL ，冷却后加入30%过氧化氢300mL ，混匀备用。
此液存放阴凉处可保存一个月。
（2） 混合催化剂 10g 硫酸铜（CuSO 4.5H 2O ）,100g 硫酸钾，0.2g 硒粉，在研钵中研细，通过孔径0.45mm 筛，混匀后备用。
（3） 40g/100mL 氢氧化钠溶液。
（4） 2%硼酸溶液。
（5） 0.01mol/L HCl 溶液（6） 甲基红乙醇溶液 称取0.1g 甲基红置于研钵中，加入少许95%乙醇。
（7） 次甲基红乙醇溶液 称取0.1g 次甲基蓝溶于80mL95%乙醇中。
临用时将以上两液按2+1比例混合即成。
在酸域呈紫红色，Ph5.5时无色，在碱域呈绿色。
4.操作方法（1）消化按照含有10-30mg粗蛋白计算试样用量，一般可称取试样0.2-0.3g （W，精确到0.0001g），用蜡光纸卷着倒入50mL凯氏烧瓶中，加混合指示剂1g，同时加入硫酸+过氧化氢+水混合液3-5mL，稍加振摇，斜置于电炉上，在通风橱内加热进行消化。
开始时用低温加热，勿使瓶中泡沫超过瓶肚的2/3，待泡沫减少和烟雾变白后在增加温度保持微沸。
消化到溶液呈浅绿色的透明状时，再继续加热沸腾10min，取出待消化液冷却至室温后，加水10-20mL，再待溶液温度降到室温后，干净地转入50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀备用。
（2）蒸馏与吸收凯氏蒸馏装置如图所示。
（1-蒸馏瓶；2-冷凝管；3-三角瓶；4-回流瓶；5-漏斗；6-活塞；7-簧夹；8-烧瓶）它是由蒸汽发生器，反应瓶及冷凝管等组成。
按照图进行安装和蒸馏、吸收。
在烧瓶8（容量1000mL）内加入蒸馏水400mL和少量碎玻璃片，加5滴混合指示剂，加几滴酸液，使水呈紫红色，盖紧瓶塞，连接4、1、2并检查有无漏气。
量取30mL2%硼酸溶液，注入（100mL）三角瓶3内，作为承接器，加混合指示剂1-2滴（溶液呈灰紫红色），置于冷凝管2下面，使管尖端插入硼酸溶液1cm深处，用5mL移液管吸取5mL（V）试样稀释液，由漏斗5注入蒸馏瓶1内，再倒入蒸馏水10mL冲洗漏斗5，接着量取40g/100mLNaOH溶液1mL，由漏斗5注入蒸馏瓶1内，再用2-5mL水冲洗漏斗5，旋紧活塞，此时蒸馏瓶1内溶液总体积应不超过容积的一半。
打开电炉加热烧瓶8，打开簧夹7，关闭活塞6，使沸腾蒸汽通过4进入1，再由1进入2而流入3，待3内的溶液呈绿色时，开始记录时间，经2-3min后，将3放低，使冷凝管2下端离开液面，继续蒸馏1min，然后用少量无CO2蒸馏水冲洗冷凝管2下端，蒸馏即告结束。
蒸馏结束后，旋紧簧夹7，断绝蒸汽，这时由于管4内蒸汽压立即降低，所以瓶1内的液体则全部吸入回流管4内，然后打开漏斗5下簧夹，注入蒸馏水40-50mL于瓶1内，关闭5下簧夹，打开簧夹7，通入蒸汽加热洗涤蒸馏瓶1，再断绝蒸汽，使洗涤液回流至回流管4内，打开活塞夹6，将回流管4中废液弃去，关闭簧夹7，为下次蒸馏做好准备。
（3）滴定用0.01mol/L HCl标准溶液滴定三角瓶3中的吸收液至出现淡紫红色为止。
记录所消耗标准盐酸的毫升数。
空白试验除不加试样外，消化、蒸馏和吸收、滴定操作与样品相同。
5.结果计算粗蛋白质的干基含量按公式计算：粗蛋白质（干基%）=（V1-V）N*14*P*50/V*10000/W(100-M)式中 V—蒸馏时取用稀释的消化液体积，mL；V1—实验用去的盐酸溶液体积，mL；V—空白试验用去的盐酸溶液体积，mL；N—HCl标准溶液的浓度，mol/L；14—与0.01mL盐酸标准溶液【c(HCl)=1.000mol/L】相当的氮的质量，mg；P—蛋白质换算系数（小麦5.7，鼓舞及豆类6.25）；W—试样质量，mg；M—试样水分百分率，%。
双试验结果允许差：粗蛋白质含量在15.0%以下时，不超过0.2%；粗蛋白质含量在15.1%以上时，不超过0.4%；求其平均数，即为测定结果，测定结果取小数点后一位。
6.附注（1）消化过程中，若硫酸损失过多时，可酌量补加硫酸，勿使瓶内干涸。
（2）消化液加水稀释后，应及时进行蒸馏，否则应保存消化液，临用时加水稀释。
（3）蒸馏时加入的碱液必须过量。
（4）也可使用由0.2%甲基红乙醇溶液1份和0.2%溴甲酚绿乙醇溶液5份配制的混合指示剂（临用时混合），终点为灰红色。
参考文献【1】汪东风。
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北京：中国轻工业出版社。
【2】王肇庆。
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食品分析。
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北京：化学工业出版社，2009.【4】吴永宁。
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北京：化学工业出版社，2003.。