凯氏定氮法

凯氏定氮法在化学分析中的应用

摘要：蛋白质是生命的物质基础，一切有生命的东西都含有不同类型的蛋白质。蛋白质又是食品的重要组成之一，也是食品中的营养素指标。它是复杂的含氮有机化合物，其溶液是典型的胶体分散体系，有两性氨基酸以肽键相互连接而成。蛋白质可以用酶、酸或碱水解，最终水解产物为氨基酸，其中赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸在人体内不能合成，称为必须氨基酸【1】。他们对人体起很重要的生理功能作用。

在国家标准中，对蛋白质的测定一般采用凯氏定氮法。下面对蛋白质、凯氏定氮法以及粮油中粗蛋白的测定进行说明。

关键词：凯氏定氮法、粗蛋白、粮油、测试

蛋白质：蛋白质为人体补充蛋白质，是人体不可缺少的重要营养素，是唯一可帮助身体形成新组织的营养素，可制造肌肉、血液、皮肤和各种身体器官，蛋白质约占人体体重的20%。最主要具有以下多种功效：1.提供多种氨基酸，帮助身体制造新的组织以替代老化组织抗衰老。2.通过增加血红蛋白和胶原蛋白改善皮肤弹性和透明度红润度。3.调节血液血红蛋白向细胞输送氧和各种营养素，促进机体生长。4.调节体内水分的平衡。5.为免疫系统制造对抗细菌和感染的免疫球蛋白和荷尔蒙。6.在体内制造各种蛋白酶，有助将食物转化为能量，恢复疲劳。7.均衡提高人体所需的八种必需氨基酸。

不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同。故各种不同的蛋白质含氮量也不同。一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮相当于6.25份蛋白质。此数值（6.25）称为蛋白质换算系数【2】。不同种类的粮食油料其蛋白质换算系数也有所不同，如小麦为5.70，谷物及豆类为6.25。

在国家标准中粮食油料中粗蛋白质的测定采用凯氏半微量定氮法。该法是1883年由丹麦化学家凯道尔（Johan、kjedahl）【3】创立的。该方法适于以测定任何形态（固体、液体）的样品。而且具有很高的准确度和精密度。因此在食品分析、饲料分析、粮食品质分析及种子品质鉴定和生化研究工作中得到广泛应用。

前景：蛋白质是食品中重要营养指标【4】，各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同。一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。测定食品中蛋白

质的含量对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、指导生产、优化食品配方、提到食品质量具有重要意义。

凯氏定氮法：凯氏定氮法是测定含氮的有机物质（如面粉、谷物、肥料、生物碱、肉类中的蛋白质、土壤、饲料以及合成药物等）中氮含量的重要方法。测定

时将有机试样与H

2SO

4

共煮进行消化分解，为提高沸点促进分解加入K

2

SO

4

，通常

还加入CuSO

4

（或汞盐）作催化剂，以提高消化效率。消化时有机物中的C转变

为CO

2，H转变为H

2

O，而N则转变成NH

3

，H

2

SO

4

被还原成SO

2

和H

2

O,NH

3

与过量的

H 2SO

4

结合成（NH

4

）

2

SO

4

或NH

4

HSO

4

保留在溶液中，消化液用过量的浓NaOH处理后，

再用蒸馏法测定NH

4

+。对于含有硝基、亚硝基或偶氮基等的某些有机化合物，在消化前先用还原剂如亚铁盐、硫代硫酸盐及葡萄糖等进行处理，使氮定量转化为铵离子。

目前在我国的国家标准（GB）及国际标准方法中仍却仍凯氏定氮法为标准的检验有机化合物中的含氮量的方法。

优点：1.可用于所有食品的蛋白质分析，2.操作相对简单。3.试验费用低。4.结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。5.有改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微凉的蛋白质

缺点：1.最终测定的是总有机物氮，而不只是蛋白质氮2.试验时间太长（至少需要2小时才能完成）3.精度差、精度低于双缩脲法4.所有试剂有腐蚀性

粗蛋白含量的测定

1.测定原理

凯氏法的基本原理是将含有蛋白质的样品与浓硫酸共热使其分解。其中的氮元素反应生成铵盐，铵盐再与浓硫酸作用，放出的氮气经硼酸吸收后，用盐酸标准溶液滴定硼酸溶液所吸收的氮，计算出试样含氮量，乘以相关的蛋白质换算系数，即得到蛋白质的含量。

（1）消化蛋白质与浓硫酸混合加热，蛋白质被炭化分解，其中的碳被氧化成二氧化碳，所含的氮则转变成氨，并与硫酸化合形成硫酸铵残留于消化液中。

有机物（含N、C、H、O、P、S等元素）+H

2SO

4

—

加热

- CO

2

↑+(NH

4

)

2

SO

4

+H

3

PO

4

+SO

2

↑+SO

3

↑

由于上述反应进行很慢，消化需要很长的时间，加入催化

剂可加速反应，硫酸铜是常用的催化剂，硫酸钾能提高硫

酸的沸点，常将它们混合使用，起加速氧化，促进有机物

分解的作用。

（2）蒸馏 消化所得的硫酸铵加碱蒸馏，氨又被释放出来。（NH 4）

2SO 4+2NaOH=2NH 3·H 2O+Na 2SO 4

NH 3·H 2O=NH 3↑+H 2O

(3) 吸收与滴定 生成的氨用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后，指示剂颜色变化，再用盐酸滴定，直至恢复到原来的氢离子浓度为止，用去盐酸的物质的量即相当于样品中氮的物质的量。

2NH 3+4H 3BO 3=(NH 4)2B 4O 7+5H 2O

(NH 4)2B 4O 7+2HCl+5H 2O=2NH 4Cl+4H 3BO 3

将含氮量乘以蛋白质换算系数，即为粗蛋白质含量。

2.仪器与用具

50mL 凯氏烧瓶；1000mL 园底烧瓶；万用电炉；100mL 锥形烧瓶；5mL 微量滴定管，刻度0.01mL ；50mL 容量瓶；5mL 移液管；10mL 量筒；洗耳球；凯氏微量蒸馏装置。

3. 试剂

（1） 浓硫酸+过氧化氢+水混合液 在100mL 水中缓慢加入浓硫酸200mL ，冷却后加入30%过氧化氢300mL ，混匀备用。此液存放阴凉处可保存一个月。

（2） 混合催化剂 10g 硫酸铜（CuSO 4.5H 2O ）,100g 硫酸钾，0.2g 硒粉，在

研钵中研细，通过孔径0.45mm 筛，混匀后备用。

（3） 40g/100mL 氢氧化钠溶液。

（4） 2%硼酸溶液。

（5） 0.01mol/L HCl 溶液

（6） 甲基红乙醇溶液 称取0.1g 甲基红置于研钵中，加入少许95%乙醇。

（7） 次甲基红乙醇溶液 称取0.1g 次甲基蓝溶于80mL95%乙醇中。临用时将以上两液按2+1比例混合即成。在酸域呈紫红色，Ph5.5时无色，在碱域呈绿色。