小鼠巨细胞病毒感染对仔鼠学习记忆能力的影响和其机制研究

摘要
【目的】
研究仔鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）颅内感染对海马局部Ca2+与蛋白激酶C（PKC）表达水平的影响。

【方法】
体外细胞培养法制备MCMV Smith株，细胞病变法（CPE）测定病毒致半
）。

ELISA法筛选MCMV IgM、IgG均阴性的BABL/C小数细胞感染量（TCID
50
鼠，雌雄小鼠交配受孕，待分娩后随机选择乳鼠分为病毒组和对照组，于生后24小时内分别颅内注射病毒悬液10微升和等量无菌生理盐水。

观察各组幼鼠的生存发育情况，待14d后各取两组10只仔鼠，无菌采集仔鼠脑组织，采用PCR法检测有无MCMV感染。

其余仔鼠待其70d后无菌采集海马组织，应用免疫组化技术及荧光分光光度计法分别检测PKC蛋白及Ca2+浓度的表达，并用光学显微镜观察海马组织的病理学改变。

【结果】
1.病毒组和对照组仔鼠脑组织感染率分别为90%及0%，x2=16.36，P<0.05；病
毒组与对照组成活率分别为28.17%及100%，x2=0.003，P<0.05。

2.病毒组和对照组海马神经元细胞内的Ca2+浓度分别为221.48±21.36及118.75
±40.85，t=10.957，P<0.05。

3.病毒组和对照组蛋白质表达水平分别为0.12±0.02及0.14±0.03，t=2.766，
P<0.05。

4.海马病理学组织切片可见病毒组神经细胞表达明显减少、排列紊乱，细胞形
态不一，部分细胞核固缩、浓染。

【结论】
1.仔鼠颅内注射MCMV可导致颅内感染，并使其存活率降低。

2.仔鼠颅内感染MCMV可导致海马PKC蛋白表达量及钙离子浓度异常改变，并
出现神经元数目减少等病理改变。

这可能是MCMV感染致仔鼠学习记忆能
力下降的重要机制之一。

【关键词】
巨细胞病毒；小鼠；学习记忆能力；海马
Abstract
【Objective】
To establish a murine model due to MCMV infection and explore effect of PKC and Ca2+ in hippocampus of mice of MCMV infected mice.
【Methods】
The Smith strain of MCMV was passaged in NIH/3T3 cells in vitro and TCID50 of the virus was quantitated in the light of CPE.MCMV –free BABL/c mice were screened by ELISA assay of MCMV –specific IgM/IgG antibodies.After overnight mating,pregnant mice were separately bred.The newborn pups were randomly divided into two groups:MCMV-infected group (infected group),which was intracerebrally inoculated with viral suspension in the first 24 hours after birth,and experimental control group(control group),which was injected with sterile 0.9% sodium chloride of equal volume.After 70 days,single cell of hippocampus was isolated,the protein’s expression of PKC and the intracellular free calcium level in hippocampus were measured by means of Immuohistochemistry technology and fluorospectro-photometer.
【Result】
of the virus was 105.22/0.1ml.40 in the 142 pups of the infected group
1.TCID
50
survived with notable anomaly 2 weeks after birth,while all the pups of the control group normally developed.
2. The intracellular free calcium level in hippocampus were 221.48 ± 21.36(infected) and 118.75 ± 40.85(control),respectivly(p<0.05).
3. The protien’s expression of PKC in the two groups were 0.12±0.02（infected）and 0.14±0.03 (control),respectively(p<0.05).
4.Tissue pathology of hippocampal nerve cells shows that the virus was significantly reduced, with disorder, different cells, some nuclear pyknosis, strong staining.【Conclusion】
1.Intracranial injection of rats can lead to intracranial MCMV infection, and reduce their survival.
2.The dysfuction of PKC and Ca2+ in the hippocampus may play an important role in the MCMV infected brain.
【Keywords】
Cytomegalovirus; mice; infection; hippocampus
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。

对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。

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日期：年月日
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本论文属于
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学位论文作者签名：指导教师签名：
日期：年月日日期：年月日
前言
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus , HCMV)属疱疹病毒科β亚科, 是巨细胞包涵体病(cytomegalic inclusion disease , CID) 的病原体，颗粒直径200nm。

HCMV是有包膜的DNA病毒，为双链线性DNA分子，基因组长约240KB，是人类疱疹病毒中基因组最大的一种病毒。

在人群中感染非常普遍，发达国家人群感染率为40%～60%[1]，发展中国家几乎达到100%[2]。

由于与人类免疫系统共同进化，HCMV侵入人体后形成多种独立机制逃避宿主免疫系统的识别和清除，在体内长期潜伏或呈低度增值状态。

当宿主免疫功能低下时，易出现原发感染或潜伏-激活。

免疫状态低下人群（如AIDS、器官移植、恶性肿瘤和妊娠等）可出现全身播散型感染、甚至致死性感染[3,4]。

孕妇由于机体内分泌及免疫状态的改变，易发生HCMV原发感染或继发感染。

孕妇感染后，病毒可通过胎盘或宫颈传播，引起胎儿宫内感染。

在我国“八五”和“九五”科技攻关项目研究中，通过对武汉、沈阳、上海地区1万余妇女的筛查，发现孕妇HCMV感染率高达79.53%～96.74%，其中具有较大宫内传播风险的活动性感染孕妇占调查总数的6%～8%，其子代35%出现宫内感染，先天性感染儿的流产、早产、畸形、死胎以及出生后智力发育落后等发生率显著增高[5,6]。

先天性感染儿中，约10%为症状性感染，表现为FGR、黄疸、肝脾肿大、瘀斑或紫癜、血小板减少、肺炎。

症状性感染儿约70%可存活，但其中90%以上有明显的神经系统后遗症，感音性耳聋占50%，视网膜脉络炎及眼球萎缩占20%、智力低下和其他神经系统异常占30%。

90%感染儿出生时无症状，其中约10%～15%将在1～2年或数年后出现神经性耳聋、智力低下等神经系统后遗症[7,8]。

神经系统发育落后影响子代生活质量，无法进行产前诊断，因而受到医务人员以及孕妇、家属的高度重视，深入认识其发病机制成为早期诊断、早期干预的基础。

HCMV是一种嗜神经病毒，感染后可通过激活小胶质细胞[9]、阻止/诱导神经细胞凋亡[10]、影响神经细胞生长分化及迁移[11,12]等多种途径导致中枢神经系统发育异常。

学习记忆是脑的高级神经活动，既是认知活动的组成部分，也是重要的智力因
素。

学习和记忆涉及大脑的内嗅皮层、海马、边缘系统等多钟结构，任一部分损伤均可造成学习记忆能力损害。

而大脑边缘系统尤其是海马在信息整合、储存和传递过程中起着至关重要的作用，是维持机体正常学习记忆的非常关键的结构。

海马的长时程增强（long-term potentination,LTP）是学习记忆的神经基础，是突触部位传递效能增强的一种现象，是突触可塑性的表现形式 [13]。

LIP的形成包括诱导和维持两个阶段，Ca2+信号系统及蛋白激酶C（PKC）系统在这两个阶段中起着重要的作用。

突触前和突触后神经元内Ca2+的增高均与LTP的发生及维持有关。

①LTP诱导期需要Ca2+向突触前神经元细胞内内流，促进突触前神经递质释放；②LTP维持期需要突触后神经元细胞内Ca2+引起的多种蛋白激酶激活及其级联反应，从而增强神经递质、突触素合成；③LTP的维持还需要Ca2+参与的与记忆有关的基因转录和蛋白质合成。

而PKC是一个复杂的、与Ca2+/磷脂相关的酶系家族。

使用特异性抗体标记技术
研究发现，海马是PKC含量最丰富的区域之一，有些与细胞膜结合，有些存在于细
胞浆内。

Ca2+浓度升高可以激活PKCβ，使底物B250磷酸化，磷酸化的B250加速囊
泡与突触前膜融合，从而促进递质释放。

NMDA受体也是PKC的作用底物，PKC使NMDA受体亚单位NR1的C末端磷酸化，从而调节NMDA受体功能。

NMDA受体在中枢神经系统发育过程中，参与神经元迁移、存活及突触连接建立。

有学者[14，15]认为，认知障碍是由于细胞静息态[Ca2+]
过高启动了细胞凋亡机制，引发迟发性神经元坏
i
过高可能提高了突触传递的阈值、易化突触的抑制、死；大鼠海马细胞静息态[Ca2+]
i
影响突触传导、神经递质释放和信号转导等，从而导致了学习、记忆功能障碍。

而PKC 在细胞凋亡中的作用主要是促进细胞的增殖分化，抑制细胞凋亡[16]。

PKC表达降低
影响细胞增值分化，所调控的受体表达下降，可影响正常突触可塑性形成，导致信
息传递和储存障碍，影响学习记忆能力。

因此我们推测，海马细胞中Ca2 +及PKC表达异常可能与CMV感染导致神经系统发育障碍有关。

由于CMV具有严格的种属特异性，建立相应的动物模型是研究HCMV感染致病机制的重要手段。

小鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）的基因结构
及表达产物的功能研究较为全面，且与HCMV具有相似的生物学特性，基因组亦具
有较高的同源性，其生物学特性、致畸性和致病性相似[17]，其自然宿主近交系小鼠
具有遗传背景较清楚，妊娠期较短（19～21d）、价格低廉等优势，这使得采用MCMV 建立小鼠感染模型进行CMV感染机制的研究成为可能。

在以往的研究中，我们成功建立了颅内接种MCMV感染新生小鼠的动物模型，发现MCMV能在颅内活动性复制,并采用行为学实验证实MCMV感染可导致仔鼠生长发育障碍，学习记忆能力下降[18]。

在前期实验的基础上，本文重点应用免疫组化及荧光分光光度计法检测海马组
织中的PKC蛋白表达水平及Ca2 +浓度，并观察海马组织形态学改变，从而探讨CMV 感染对子代学习记忆能力的影响及其可能的发生机制。

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18.张英，闻良珍。

巨细胞病毒感染小鼠行为学及脑皮质CaMmRNA 表达的改变。

中国优生与遗传杂志，2005，13（10）：19-20.
第一部分小鼠巨细胞病毒感染性病毒量测定
材料与方法
1. 细胞：小鼠胚肺成纤维细胞（murine embryo fibroblast,MEF）NIH/3T3株购于中国
典型培养物保藏中心（Chinese Type Culture Collection,CTCC），按常规细胞培养
方法进行细胞复苏、培养、传代。

2. 病毒：MCMV Smith株，购于中国典型培养物保藏中心（CTCC），在实验室传代
增值。

3. 主要试剂
(1) 细胞生长液：
高糖（Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM, Gibco) 培养液用0.22µm 滤膜过滤，添加新生牛血清（NCS,Gibco）、青霉素（Amresco）、链霉素（Amresco），浓度分别为10%（传代培养）、100U/ml、100µg/L，用5%NaHCO
3
溶液调PH 值至7.2～7.4。

(2) 细胞维持夜：
高糖（Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM , Gibco)培养液用0.22um 滤膜过滤，添加新生牛血清（NCS,Gibco）、青霉素（Amresco）、链霉素（Amresco），
浓度分别为3%（传代培养）、100U/ml、100µg/L，用5%NaHCO
3
溶液调PH值至7.2～7.4。

(3) D-Hanks液：
每1000ml含KCL 0.4g、KH
2PO
4
0.06g、NaCL 8.0g、NaHCO
3
0.35g、Na
2
HPO
4
・12H
2
O
0.08g，高压蒸汽灭菌。

(4) 消化液：
为0.25%胰蛋白酶溶液，每1000ml含胰蛋白酶 2.5g、NaCL 8.0g 、NaHCO
3
0.35g、
Na
2HPO
4
・12H
2
O 0.08g、KCL 0.4g、KH
2
PO
4
0.06g，用1N NaOH溶液调PH值至
7.2左右，0.22um滤膜过滤消毒。

(5) 冻存液：
DMEM7ml，血清2ml，二甲基亚砜（DMSO,Sigma）1ml。

4. 主要仪器与设备
超净工作台（苏州净化设备公司）
37℃、5%CO
培养箱（德国Heraeu）
2
超低温冰箱（日被SanYo公司）
倒置显微镜（日本Olympus）
水浴箱（上海精密仪器仪表有限公司）
血球计数板（上海精密仪器仪表有限公司）
细胞培养板（武汉凌飞公司）
50ml，25ml玻璃培养瓶（江苏玻璃仪器厂）
台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）
高压蒸汽灭菌器（上海医用分析仪器厂）
5. NIH/3T3细胞传代培养
1)将冻存的细胞迅速放入38℃水浴箱中，在1min内完全融化，然后无菌取出细胞，
1000r/min离心5～10min，弃去上清液。

培养箱，37℃、2)加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1x109/L，置5%CO
2 80%湿度条件下培养。

3)次日取80%瓶底铺满或接近汇合成片的细胞1瓶,吸弃残余的生长液。

4)向瓶内注入D-Hanks液5～7ml，轻轻转动培养瓶，吸弃残余的生长液。

5)向瓶内加入消化液2～3ml，以盖满瓶底为限。

倒置显微镜下观察，发现细胞质
回缩，细胞间隙增大后，吸弃消化液，加入适量新鲜生长液以终止消化。

6)用吸管轻轻吸取生长液反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

计数
板计数细胞后，把细胞悬液分成两等份分别转入2个50ml培养瓶，置37℃、5%CO
2培养箱培养并按上述方法传代备用。

6．MCMV毒株制备
1)倾去已生长成单层NIH/3T3细胞培养瓶中的生长液，取MCMVSmith毒株悬液100
μL接种至单层NIH/3T3细胞上。

置37℃、5%CO
培养箱吸附1.5h后，更换维
2
持液，置培养箱中继续培养，每3天换液一次。

2)每天在倒置显微镜下观察细胞病变（cytopathgenic，CPE），当80%～90%细胞发
生CPE时，用力振荡培养瓶使贴壁细胞脱落，与上清一同吹打均匀后，分装为1ml/支于冻存管中，-80℃保存备用。

使用前反复冻融三次，离心，取上清病毒液。

3)病毒致CPE表现：细胞变圆、肿胀、核变大、细胞间界限不清，多个细胞融合
形成巨大细胞，可见成“枭眼”状改变的病毒包涵体，培养液中可见漂浮的脱壁细胞。

4)CPE程度判定标准：-示细胞无病变，+示25%的细胞出现病变，++示25%～50%
的细胞出现病变，+++示50%～75%细胞出现病变，++++示75%～100%细胞出现病变。

7. MCMVSmith病毒株感染性滴度测定（CPE法）：
1)取生长良好的NIH/3T3细胞，经消化液消化后，用生长液调整细胞浓度为
2x105/ml。

2)接种至96孔细胞培养板，0.2ml/孔，置37℃、5%CO
培养箱培养至细胞长成单
2
层片状。

3)用维持液将病毒原液按10倍间距梯度稀释。

4)吸弃各孔培养液，每孔中接种稀释病毒悬液100μL，稀释度分别为10-2～10-10，
每个稀释孔设6复孔，另设正常细胞对照4孔。

培养7d～14d，逐日观察并记录CPE情况。

5)用Read-Muench公式计算MCMV致半数细胞感染量（tissue culture infectious dose
）。

50,TCID
50
= Ig高于50%病变率的最高稀释倍数+距离比例x Ig稀释系数Ig TCID
50
距离比例=（高于50%病变率—50%）/（高于50%病变率—低于50%病变率）
结果
根据MCMV感染性滴度测定结果（见表1），计算TCID
50。

在本实验中，距离
比例=（66.7-50）/（66.7-10）=0.29，稀释系数=10，IgTCID
50
=Ig106+0.29xIg10=6.29，
因此MCMV毒株的TCID
50
为106.29/0.1ml。

表1 MCMV感染性滴度测定结果
累计
病毒接种阴性阳性
稀释度孔数孔数孔数阴性阳性病变比病变率
（%）
10 6 0 6 10-3 6 0 6 10-4 6 1 5 10-5 6 2 4 10-6 6 3 3 10-7 6 3 3 10-8 6 6 0 10-9 6 6 0 10-10 6 6 00 22
016
111
37
64
9 1
15 0
210
27 0
22/22 100
16/16 100
11/12 91.7
7/10 70
4/6 66.7
1/10 10
0/15 0
0/21 0
0/27 0
讨论
HCMV活动性感染的人体，病毒在人体细胞内大量复制，24h内依次产生即刻早期抗原、早期抗原、晚期抗原，复制完成后成熟病毒颗粒释放到细胞外，再进入另一易感细胞[1]。

许多细胞对HCMV易感，如内皮细胞、上皮细胞、DC细胞、纤维细胞及胃肠道平滑肌细胞、肝细胞。

胚胎期和新生儿期的神经细胞和唾液腺细胞最敏感，之后以上皮细胞、纤维母细胞和骨髓母细胞最为敏感[2]。

体外研究以成纤维细胞最易感。

因此本次实验通过MCMV Smith株体外感染小鼠成纤维细胞株NIH/3T3细胞，从细胞形态学角度研究CMV感染引起细胞的病理改变。

由于受固相琼脂覆盖层的限制，病毒只能从原始感染细胞向邻近感染细胞扩散，在倒置显微镜下见到接种病毒的细胞出现了形态异常，细胞变圆、肿胀、核变大、细胞间界限不清，多个细胞融合形成巨大细胞，可见成“枭眼”状改变的病毒包涵体，培养液中可见漂浮的脱壁细胞。

而对照组细胞形态呈梭形、透明、细胞间界限清、细胞生长仍呈良好的单层。

然后用细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE法）将病毒原液按10倍梯度稀释，观察病变情况，并用Reed-Muench公式计算MCMV 致半数细胞感染量[3]。

因此，我们对MCMV经易感动物细胞内传毒增殖后，其毒力恢复且更易感染小鼠，为MCMV颅内感染模型的建立打下了基础。

参考文献
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第二部分 MCMV颅内感染仔鼠学习记忆能力改变的机制研究
一、建立MCMV颅内感染仔鼠的模型
材料与方法
1.细胞与病毒
第一部分常规制备培养传代的MCMV毒株用于本实验，使用前将病毒感染性滴度/10μL。

调整为100TCID
50
2.主要试剂
小鼠巨细胞病毒IgM抗体酶免检测试剂盒（珠海海泰生物制药有限公司）小鼠巨细胞病毒IgG抗体酶免检测试剂盒（珠海海泰生物制药有限公司） DNA提取试剂盒（北京博大泰克生物科技公司） PCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司）核酸分子量Marker （北京天根生化科技有限公司）琼脂糖（武汉凌飞科技有限公司）
3.主要仪器
DG3022型酶联免疫检测仪（上海医用分析仪器厂）
台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）
双向通风超净工作台（苏州净化设备公司）
4800型PCR扩增仪（美国Perkin Elmer公司）
凝胶电泳分析系统（英国UVP公司GDS-8000型）恒压恒流电泳仪、电泳槽（北京六一仪器厂）
高压蒸汽灭菌器（上海医用分析仪器厂）
微量加样器（10μL）（上海医用分析仪器厂）
BS系列精密电子天平（德国sartorius赛多利斯）
移液器（德国eppendorf）
动物手术器械一套
4.实验动物
4.1 动物来源
SPF级BALB/C雌雄小鼠，8～10周龄，体重20～25g，被毛白、短、洁净密实，毛色光滑，举动敏捷活泼，双眼明亮，外生殖器发育成熟，购于湖北省疾控中心。

雌雄小鼠分笼在同济医院实验动物中心超净生物层流架内饲养一周，使其适应新的环境和管理。

4.2 实验动物筛选
无菌采集小鼠尾静脉血0.5ml，用ELISA方法检测小鼠外周血中MCMV特异性抗体IgM、IgG，测定结果均为阴性者列为实验对象。

ELISA操作步骤如下：
1)每份血液标本离心后提取血清20μL。

2)ELISA试剂盒放置室温平衡20～30min，用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释10倍。

3)将样品稀释液0.1ml加入洁净小管内，分别加10μL血清，充分混匀。

4)用板条固定于板架上，先加入2孔阳性对照，100μL/孔。

然后用样品稀释液将
血清稀释10倍，每孔加入稀释后血清100μL。

另留一孔不加任何液体做空白对照。

置37℃30min。

5)甩净孔中液体，洗板3次，每次停留1min后甩净拍干，除空白对照孔外，每孔
加酶标物1滴，置37℃30min。

6)甩净孔中液体，同上洗板3次，拍干后各孔加呈色液A、B各一滴，置37℃避
光10min。

每孔立即加入终止液1滴。

混匀后用酶标仪450nm读数。

5.建立MCMV颅内感染仔鼠模型
取上述筛选的小鼠，适应性饲养1w后，雌雄2：1配笼，待母鼠怀孕后与雄鼠分离单独喂养。

待其足月分娩后，取当天出生的乳鼠按窝随机分为对照组50只和病毒组142只，24小时内对照组颅内注射无菌生理盐水10微升，病毒组颅内注射MCMV 毒液10微升。

术后观察仔鼠生存状况，并于不同时间断头处死。

注射方法:左手持镊固定乳鼠头部，2.5%碘酊涂擦颅顶两次，右手持微量注射器沿矢状缝中点缓慢进针，深度2-3mm，于3-5min内将10微升液体推注完毕，注意稳定针头，注射完毕沿进针途径缓慢退针[1]。

6.检测仔鼠脑组织感染率
6.1 基因组DNA的提取
1)取14d龄仔鼠两组各10只断头处死，将25mg脑组织置于匀浆器中，再加入100
μL裂解液，充分匀浆。

2)加入20μLRNaseA/蛋白酶k液，迅速充分振荡混匀。

3)55℃温浴15～45min，其间来回颠倒数次。

加入10μL3M NaAc（PH4.8）。

4)加入1250μL结合缓冲液，充分振荡混匀。

5)12，000rpm离心2-3分钟。

将上清液加入到离心吸附柱中去，放置1分钟。

12，
000rpm离心30sec。

6)倒掉收集管中的废液，再加入600μL漂洗缓冲液。

12，000rpm离心30sec。

7)重复上述步骤2～3次后，倒掉收集管中的废液，12，000rpm离心3min。

8)取出离心吸附柱，将其套入一干净的1.5mlEp管，加入50μL洗脱缓冲液。

放置
1min，12，000rpm离心30sec。

取出Ep管，其中即是基因组DNA。

6.2 PCR法检测
1)引物：扩增片段MCMV立即早期因子Ⅰ，引物序列来源于PubMed Genebank的
早期外显子基因序列，用Prime5.0软件自行设计，分析其可行性良好，由上海生工生物工程公司合成。

上游序列：GTTCTTGCGTGTTGTTGCTCG
下游序列：GCGTTGACGGATGCCTGAT
扩增片段长368bp.
2）反应体系（25μL）：
双蒸水 14.5μL
10xbuffer 2.5μL
氯化镁 2.5μL
上游引物 1.0μL
下游引物 1.0μL
dNTP 1.0μL
模板 2.0μL
Taq酶0.5μL
3）反应条件：94℃预变性10min，94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸1min 反应30个循环，最后72℃延伸10min。

4）反应的特异性：每次反应均设阴性对照（PBS代替样本模板），阳性对照（MCMV 培养上清液）。

5）结果判定：取反应产物5μL，在配加了溴化乙锭1.5%琼脂糖凝胶上电泳30min 电压80v，紫外灯下观察，拍照。

7.统计学处理分析
计数资料用x2（卡方）检验，所有数据用SPSS13.0统计学软件进行分析，以P<0.01表示差异有统计学意义。

结果
1.两组仔鼠脑组织感染率：
图2-1为14d龄仔鼠脑组织MCMV PCR电泳图，其中阳性对照在368bp处可见明显的扩增条带，阴性对照未见扩增条带，提示：实验特异性良好。

病毒组感染率90%（9/10）,对照组感染率0%（0/10）,x2=16.36,p<0.01。

提示：两组仔鼠脑组织感染率有显著性差异，经颅内接种MCMV可导致仔鼠脑组织感染。

图2-1 PCR电泳图
1：阳性对照；2～4：病毒组标本；5：阴性对照；6～8：对照组标本
2.两组仔鼠存活率：
病毒组存活率28.17%（40/142），对照组存活率100%（50/50），x2=0.003，P<0.01。

提示：颅内接种MCMV毒株可导致仔鼠死亡。

二.海马神经元[Ca2+]i的荧光测定
材料与方法
1.细胞与病毒
第一部分常规制备培养传代的MCMV毒株用于本实验，使用前将病毒感染性滴度调整为100TCID
50
/10μL。

2.主要试剂
1)Fluo-3/AM：为Sigma 公司产品，用二甲亚砜(DMSO)配成0.25mmol/L 储备液，
分装后置－20℃避光保存。

2)磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g 氯化钠、0.2g 氯化钾、1.44g 磷酸氢二钠
（Na
2HPO
4
・12H
2
O）、0.24g 磷酸二氢钾，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、
15分钟高压灭菌。

3)Hank's 液：取氯化钠80g、磷酸氢二钠（Na
2HPO
4
.12H
2
O）0.6g、氯化钾4.0g、
磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁（MgSO
4・7H
2
O）2.0g、葡萄糖10g、无水氯化钙1.4g，
加水至1000ml,混匀，调pH7.2, 经121℃、15 分钟高压灭菌，4℃保存。

4)D－Hanks液：每1000 ml含KCL 0.4 g、KH
2PO
4
0.06 g、NaCl 8.0 g、NaHCO
3
0.35
g、Na
2HPO
4
·12H
2
O 0.08 g，高压蒸汽灭菌。

3.主要仪器
荧光分光光度检测仪（日本津岛RF-5301PC）台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）高压蒸汽灭菌器（上海医用分析仪器厂）恒温水浴箱（上海医用分析仪器厂）
EBA20台式离心机（Hettich公司）
动物手术器械一套
4.荧光测定[Ca2+]i原理
双波长激发荧光探针Fluo-3因有较强的亲水性而难以进入细胞，在其负性基团部位结合上亲脂的乙酰羧甲基酯成为Fluo-3/AM后，与细胞温孵时容易透过细胞膜，胞浆内酯酶可将Fluo-3/AM水解为Fluo-3，后者与胞浆内游离钙离子结合，形成Fluo-3-Ca2+复合物，Fluo-3及其与Ca2+结合的复合物，其最大激发波长分别为380nm 和340nm，荧光强度随着Fluo-3和Ca2+结合的增加而减少，即荧光强度与游离钙离子浓度成反比，据此可以测定游离钙离子浓度（[Ca2+]i）。

5.实验步骤
1)取第一部分建立的仔鼠模型病毒组及对照组仔鼠70d龄各12只，断头处死后，
立即冰上取小鼠海马组织，将海马组织用冰冷的生理盐水洗2 次，再用Hank's 液冲洗2~3 次，剪碎后置于5~8倍体积质量分数、浓度为0.125%的胰酶中。

2)37℃恒温水浴消化30min，消化过程中轻轻吹打。

后1500r/min离心5min，吸去
胰酶。

加入4℃含10%小牛血清的DMEM终止消化反应。

吹打细胞20次后，过200目筛网。

滤液以1500r/min离心2次，每次5min，弃上清。

3)沉淀用D-Hanks液洗2次，1500r/min离心5min，弃上清。

细胞计数，将细胞浓
度调节于1x106/ml，定容1ml。

4)取上述细胞悬液1ml，预温5min后，加4μLFluo-3/AM使终浓度为2μmol/l。

37
℃恒温避光孵育45min，吸出上述负载液。

5)D-Hanks 液洗涤细胞两次；最后用3 ml 含钙离子的Hanks 测定液（mmol/L：NaCl
140.000；KCl 4.765；CaCl
15.652；Glucose 53.763；HEPES 5.000；pH7.0～7.2）
2
悬起细胞。

上机检测。

6)应用双波长显微荧光分光光度计测定海马神经细胞Ca2+浓度，测定条件：激发波
长340 nm 和380 nm，激发光栅1.5nm;发射波长为505 nm，观察不同条件下荧光强度的变化，根据下式[2]计算海马神经细胞[Ca2+]i：
[Ca 2+]i =Kd x (F D /F S ) x [R-Rmin/Rmax-R] (nmol/L)
公式中Kd 是Fluo-3与Ca 2+反应的解离常数，生理条件下Kd 为224 nmol/L ；R ＝F340/F380；Rmax 为Fluo-3饱和时产生的最大荧光比值，用1%Triton X-100（1ml 细胞悬液加10% Triton X-100 100 µl ）进行测定；Rmin 为Fluo-3游离时形成的最小荧光比值，用50mmol/L EGTA （1ml 细胞悬液加500 mmol/L EGTA100µl ）进行测定；F D 、F S 分别代表Ca 2+为零和饱和状态下，在380nm 波长测定的荧光强度。

在340nm 和380nm 波长下，测定荧光值（F ）各为两次，取其平均值。

6.统计学方法
所有数据用SPSS13.0系统软件包分别求出指标的平均数和标准差，用x ˉ ±s 表示每项检测指标的水平。

各组之间各对应指标的差异性检验用t 检验，规定P<0.05为统计学差异有显著性。

结 果
病毒组与对照组仔鼠海马神经细胞Ca 2+浓度分别为221.48±21.36nmol/L 及118.75±40.85 nmol/L ，t=10.957，P<0.05。

提示：颅内接种MCMV 可能导致仔鼠海马组织神经细胞Ca 2+浓度显著升高。

三、海马组织中的PKC 蛋白表达
材料与方法
1.细胞与病毒
第一部分常规制备培养传代的MCMV 毒株用于本实验，使用前将病毒感染性滴度调整为100TCID 50/10μL 。

2.主要试剂
4%多聚甲醛 （武汉凌飞科技有限公司）
二甲苯 （武汉凌飞科技有限公司）
无水乙醇 （武汉凌飞科技有限公司）。