核酸检测基本 知识

核酸检测基本知识

1.什么是核酸检测

核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。

核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息

和传递遗传信息。

2.核酸的分类

核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。

3.核酸的组成

DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P，5种元素组成。DNA是绝大多数生物的遗传物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人的DNA却是很长的，约有3X10^9个核苷酸。

4.核酸的功能

在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的

作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物

合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列

重大生命现象中起决定性的作用。

DNA与RNA都是核酸，它们在化学组成上有什么区别如

下：

DNA与RNA的比较DNA RNA

主要存在部位细胞核细胞质

基本组成单位脱氧核苷酸核糖核苷酸碱基种类A、G、C、T A、G、C、U

五碳糖种类脱氧核糖核糖

核苷酸链两条脱氧核苷酸链一条核糖核苷酸链

5.检测方法

核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检

测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生

物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核

酸检测。

目前主要使用的方法有以下几种：

a.核酸序列依赖性扩增法

NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性

核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。

整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA 杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火,在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量

扩增。

b.转录介导的扩增技术

TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。

c.连接酶酶促链式反应(LCR)

LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种

探针扩增技术，是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩

增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交,当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基

突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。

d.多聚酶链反应检测法(PCR)

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特

异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配

对与半保留复制原理，合成1条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获

得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次

循环的模板。每完成1个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIV RNA,需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA，继而以cDNA为模板进行PCR扩增即可，这样的反应称为RT-PCR。

e.实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

本技术的原理是使用荧光基团标记探针,5′端标记荧光基团R,3′端标记淬灭基团Q,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合

在模板上,荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引

物之间,利用Taq酶的5′3′外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到,一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了

PCR从半定量到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。

f.支链DNA检测法——bDNA

bDNA是定量检测血浆中的HIV1型RNA的一种方法。bDNA是指人工合成的带有侧链的DNA片段,在其每个侧链上

都可以标记被激发的标记物。将HIV的RNA通过离心从病毒

颗粒中释放出来,然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕

获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合,又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别

与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。在微孔中形成HIVRNA寡核苷酸复合物。再加入1种化学发光底物孵育后可

放大化学发光信号。通过发光强度来定量,因为发光强度与样品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在扩增物的交叉污染,这较PCR是一大进步。bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针,可以方便地检测HIV某些变异株,但灵敏度不及PCR，提高bDNA灵敏度是一大难点。

检测步骤

HIV核酸定性检测技术，其检测过程分为核酸提取、逆

转录合成cDNA、PCR扩增反应、扩增产物定性分和结果判定

和完成报告单。

6.实验室检测具体步骤如下：

a.核酸提取

使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化

仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。

b.逆转录合成cDNA