蛋白质的复性
蛋白质复性ProteinRefolding
第十章蛋白质复性Protein RefoldingOff-pathwayk I k A U I NAk N On-pathway 蛋白质体外复性的主要挑战：操作条件抑制聚集体生成，提高复性收率。
主要影响因素l变性剂浓度（脲、盐酸胍）l氧化还原剂浓度、比例l pHl蛋白质稳定剂（甘油、海藻糖…）l蛋白质浓度l杂质种类和含量l变性剂浓度（脲、盐酸胍）l蛋白质聚集抑制剂（聚乙二醇、表面活性剂…）l盐的种类、浓度l混合效率l温度体外复性研究的核心问题1、模仿体内蛋白质折叠过程：构建适于蛋白质正确折叠的环境，设计能够促进蛋白质正确折叠、抑制折叠中间体聚集的折叠助剂2、发挥体外折叠的独特优势：构建体内不可能存在的独特环境，实现高效复性和分离纯化：色谱、反胶团、膜、双水相系统、沉淀……降低变性蛋白质溶液中变性剂的浓度，创造适宜的氧化还原环境（氧化还原电位），可引发蛋白质折叠复性；基本条件：－变性剂浓度：盐酸胍< 2 mol/L脲< 4 mol/L－GSH/GSSG 4/0.4 mmol/L ~ 5/5 mmol/L （例）ü直接稀释、透析、流加4.1 稀释复性复性缓冲液变性液蛋白质变性剂水、助剂Refolding bufferDenatured proteinPumpMagnetic stirrer 37 o C提高复性收率，且终浓度较高。
蛋白质复性特点－稀释复性小结低浓度下进行复性操作有利于提高活性收率；浓度提高则聚集体生产速度加快，复性收率下降；流加复性有利于实现高浓度下的高收率复性；存在适宜的变性剂浓度，使复性收率最大；抑制聚集体的生成，是提高复性收率的关键！In vivo protein folding体内折叠：是在一系列折叠酶、分子伴侣和水解酶的辅助下完成的。
F. Baneyx, M. Mujacic: Nature Biotechnology, 2004, 22: 1399折叠助剂（Folding aids）l蛋白质体内折叠是在各种折叠调解因子（modulators）和蛋白酶的共同作用下完成的；l调解因子：分子伴侣（chaperones)和折叠酶（foldases）体外蛋白质复性的策略l体外复性应模仿体内折叠过程。
蛋白质变性与复性
蛋白质相互作用与复合物分离
蛋白质变性
利用变性剂分离和纯化蛋白质复合物 中的各个组分，有助于研究蛋白质之 间的相互作用和复合物的组成。
蛋白质复性
在研究蛋白质相互作用和复合物分离 后，通过复性技术将蛋白质恢复其天 然状态，可用于进一步的功能和结构 研究。
蛋白质优化与改造
蛋白质变性
通过蛋白质变性技术可以去除非必需的氨基酸残基或引入突 变，从而优化蛋白质的稳定性、活性或选择性。
蛋白质复性
复性后的蛋白质可用于进一步的功能和结构研究，以验证优 化和改造的效果。
人工酶设计与合成
蛋白质变性
在人工酶设计与合成过程中，利用变性技术可以去除天然酶中的非必需部分，提 高酶的活性和选择性。
蛋白质复性
复性后的酶可用于催化特定化学反应，以验证人工酶的活性和效果。
生物制药与疫苗开发
蛋白质变性
医疗领域
改进蛋白质检测和诊断技术，提高疾病诊断的准 确性和效率，为患者提供更好的医疗服务。
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蛋白质变性与复性
目录
CONTENTS
• 蛋白质变性 • 蛋白质复性 • 蛋白质变性与复性的应用 • 蛋白质变性与复性的研究进展 • 蛋白质变性与复性的挑战与前景
01 蛋白质变性
定义
蛋白质变性是指蛋白质在某些物理和 化学因素作用下，其特定的空间构象 被破坏，导致理化性质发生改变，生 物学活性丧失的现象。
复性后的蛋白质溶解度增加，有利于其在溶液中的稳 定性。
Байду номын сангаас
03 蛋白质变性与复性的应用
蛋白质结构与功能关系
蛋白质变性
通过改变蛋白质的理化条件，使其空间构象发生改变，从而改变其生物学活性。 有助于研究蛋白质的结构与功能关系，深入了解蛋白质在生物体内的生理作用。
蛋白质复性名词解释
蛋白质复性名词解释蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，是构成生物体各种组织和器官的重要成分。
蛋白质的功能多样，可以参与生物体内的酶催化、结构支持、运输、通信、能量存储、免疫防御等重要生理过程。
蛋白质的复性是指它的折叠状态和三维结构。
蛋白质synthesized 是在生物体内通过一系列复杂的生物化学反应合成的，但它不是以线性链的形式存在，而是经过折叠和组装形成复杂的三维结构。
这个过程被称为蛋白质的折叠，而折叠之后形成的三维结构就是蛋白质的复性。
蛋白质的复性是非常关键的，因为它决定了蛋白质的功能和稳定性。
如果蛋白质的复性受到破坏，它可能失去原有的生物活性和功能。
例如，当蛋白质的复性受到变性剂（如酸、碱、高温等）的作用时，蛋白质的结构可能会发生改变，导致其在生物体内无法正常发挥作用。
蛋白质的折叠和复性是一个自发的过程，在正常生理条件下，蛋白质可以自行正确地折叠成其稳定的复性。
但有时蛋白质的折叠过程会出现错位或失败，导致其形成不正确的复性。
这种情况下，被称为蛋白质的错折，错误复性的蛋白质可能会失去原有的功能，甚至产生有害的效应。
蛋白质折叠和复性的控制是一个复杂的过程，涉及到多个层面的调节。
通常，蛋白质的折叠主要由其氨基酸序列所决定，不同氨基酸之间的相互作用力（如氢键、离子相互作用、范德华力等）在折叠过程中扮演重要的角色。
此外，还有一些蛋白质专门参与蛋白质折叠和复性的分子辅助工具，如分子伴侣和分子伴侣辅助因子等，它们能够帮助蛋白质正确折叠和达到稳定的复性。
总之，蛋白质的复性是指其折叠和组装成稳定的三维结构的过程，它对蛋白质的功能和稳定性起着关键作用。
探索蛋白质复性的机制对于理解生物大分子的结构与功能具有重要意义，也对于研究蛋白质相关疾病和开发药物具有重要价值。
名词解释蛋白质的复性
名词解释蛋白质的复性蛋白质的复性：现象与意义在生物化学领域中，蛋白质的复性是一个广泛而重要的研究课题。
复性是指蛋白质经历一系列空间结构和功能的调整，重建其原有的三维结构以及所能发挥的功能。
本文将探讨蛋白质复性的现象、机制以及其在生物体内的意义。
1. 蛋白质的复性现象复性是蛋白质遭受外部环境的一系列不良条件（如高温、极酸或极碱性条件、化学变性剂等）后，通过一定机制修复并重获原有结构与功能的过程。
在这个过程中，蛋白质的一级、二级和三级结构受到损伤，导致其失去正常功能。
蛋白质的复性可以发生在细胞内部和细胞外部。
在细胞内，复性通常由分子伴侣和分子伴侣系统促进，如分子伴侣热休克蛋白HSP70、HSP90等。
这些分子伴侣通过与蛋白质相互作用，引导失去结构的蛋白质重新折叠成正确的形式，并防止其在复性过程中发生聚集。
2. 蛋白质的复性机制复性过程涉及多个事件和步骤，其中最为关键的是解聚和折叠。
解聚是指复性过程中产生的不正常和不稳定的蛋白质聚集体分解为单体。
这个步骤由分子伴侣和其他调节蛋白质负责。
折叠是指蛋白质通过一系列无序到有序的结构变化，重新将其折叠成正确的三维构象。
折叠的过程中，分子伴侣系统与其他辅助蛋白质（如折叠辅助酶和蛋白激酶等）相互作用，协助和促进正确的二级和三级结构的形成。
此外，糖基化也被认为是蛋白质复性的关键机制之一。
在糖基化过程中，糖链与特定氨基酸残基结合，形成糖蛋白复合物。
这种复合物不仅能帮助维持蛋白质的稳定性，还可促进正确的折叠。
3. 蛋白质复性的意义蛋白质的复性在维持生物体内正常的生理功能中起着至关重要的作用。
在细胞内，复性可以防止异常蛋白质的聚集和沉积，减轻内环境的毒性。
此外，蛋白质复性还与许多重要的生物过程密切相关。
例如，蛋白质折叠失常与多种神经性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病相关。
了解复性过程可以帮助我们深入了解这些疾病的发生机制，并为研发相关的治疗方法提供新的思路。
另外，蛋白质复性也对生物技术领域具有重要意义。
蛋白质复性技术
一、基本原理
• （4）色谱复性：在色谱的过程中实现复性， 称为色谱复性法。优点在于，色谱固定相 对变性蛋白质吸附性能低，甚至完全消除， 变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集， 产生沉淀。提高复性质量和活性收率。在 蛋白质复性 的同时可使目的蛋白质与杂质 蛋白质分离，达到复性和纯化的双重效果。
一、基本原理
蛋白质复性
一、基本原理
1、包含体 • 是指以大肠杆菌为宿主细胞的基因表达产物由 于不能分泌到细胞外，而在细胞内聚集形成的 没有生物活性的固体颗粒。 • 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体 元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、 ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以 及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很 高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶 性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
一、基本原理
• （2）洗涤：为了除去包含体上粘附的杂质， 如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包含体， 通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或 盐酸胍会使包含体溶解，如2M尿素洗涤。 此外可以用温和去垢剂洗涤去除膜碎片和 膜蛋白。
一、基本原理
• （3）溶解：一般用强的变性剂如尿素、盐 酸胍通过离子间的相互作用，打断包含体 蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使 多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素， 因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使 尿素不能溶解的包含体溶解，而且尿素分 解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲 酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。
一、基本原理
3、蛋白质复性
• 由于包含体中的重组蛋白缺乏生物学活性， 加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构 破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。 通去除还原剂使二硫键正常形成。
一、基本原理
10蛋白质复性
200
180
160
Spe,不被任何膜 所包围。细胞破碎后,包含体呈颗粒状,致密,低 速离心就可获得。欲获得天然活性态的目标产 物,必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目 标蛋白恢复应有的天然活性。
包含体的形成和性质
1 包含体的形成 2 包含体的性质 3 包含体的优点
包含体形成的原因
主要是高水平表达的结果。 在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白
包含体的纯化和溶解
溶解
变性剂： 5～8mol/L盐酸胍、8mol/L尿素 硫氰酸盐、表面活性剂（十二烷基磺酸钠，十六 烷基三甲基氯化胺等）
还原剂： 1～100 mmol/L的二硫苏糖醇； 1～200 mmol/L的β-巯基乙醇或半胱氨酸
蛋白质复性
热力学驱动； 分子内折叠和分子间聚集的动力学竞争过程。
体外复性研究的核心问题：
1、模仿体内蛋白质折叠过程： 构建适于蛋白质正确折叠的环境，设计能够促进蛋 白质正确折叠、抑制折叠中间体聚集的折叠助剂 （Folding aids，folding modulators）
2、发挥体外折叠的独特优势： 构建体内不可能存在的独特环境，实现高效复性和 分离纯化：
色谱、反胶团、膜、双水相系统、沉淀……
盐酸胍 < 2 mol/L 脲 < 4 mol/L
－GSH/GSSG 4/0.4 mmol/L ~ 5/5 mmol/L ✓ 直接稀释、透析、流加
直接稀释（Direct dilution）：
将少量变性蛋白质溶液直接加入到较大体积的 复性缓冲液中，变性剂浓度降低，蛋白质开始 复性；
蛋白质浓度一定的条件下，稀释倍数和混合效 率是影响复性收率的重要因素。
活性剂） （4）离心沉降回收包含体 （5）根据需要，重复上述步骤（3）和（4），直至达
12 蛋白质复性
复性有关理论
两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分 子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的 疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构 的蛋白质分子。 按拓扑学观点认为：虽然蛋白质内部基团相互作 用复杂，使得不同蛋白质的折叠复性过程不相同，但 不同蛋白质多肽链穿越空间的形式可能会是相同或类 似。实验中也发现，蛋白质拓扑结构的氨基酸序列不 改变对蛋白质的折叠速度等参数影响很很少。因此， 该理论认为，蛋白质的折叠过程的许多参数及其折叠 机理可能与蛋白质的拓扑结构有密切关系。
包涵体加工流程
机械破碎法
包涵体提 取
离
心
去除细胞碎片 （ 膜蛋白和脂类等）
如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化 的一个难题
包涵体的洗涤
• 为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀 • 常用去污剂Triton X-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如 2mol/L尿素或盐酸胍等，注意：过高浓度的尿素或盐酸胍 会使包涵体溶解）洗涤以除去脂类和膜蛋白。 • 如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA
• 3）变性剂浓度和复性时间
• 在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L 盐酸胍、 8mol/L Urea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐酸胍和 Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的疏水相互作 用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用的形成。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长的一 段时间，I就可以慢慢地向N转化
包涵体形成的几种可能性
研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成 包涵体。 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其 在细胞内溶解度时沉淀； 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫 键不能正确配对； 3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译 后修饰酶及分子伴侣等)不足； 4）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、Pro 含量越高越容易形成包涵体。 5）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。 6）丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不 佳时，容易形成包涵体。
蛋白质复性的条件及影响因素_cropped
蛋白质复性的条件及影响因素_cropped摘要蛋白质复性是一个过程 ,存在中间阶段 ,此阶段的各种相互作用力决定了蛋白质能否复性。
蛋白质复性要求有一定的条件 ,如 p H、温度、离子强度、蛋白质浓度等。
另外多种添加剂能促进蛋白质复性 ,其中包括表面活性剂、低浓度变性剂、分子伴侣蛋白和各种氧化还原对 ,但对于不同蛋白质 ,因其结构及理化特性不同 ,采取不同复性方法 ,可以使其达到最佳复性效果。
关键词蛋白质 ; 结构与复性蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分,某些脯氨酸异构酶在含有脯氨酸的变性蛋白结构质中被证明对复性有辅助作用。
来源于不同物种中子物质 ,易受外界条件的影响发生变性。
随着基因的同一蛋白质在氨基酸排列顺序上会存在不同程度工程技术的发展 ,许多实验通过将目的蛋白基因转入原核或真核表达体系进行表达的方法 ,得到需要的差异 , 但其折叠方式却有很大的保守性。
Wal23 的蛋白质 ,这大大丰富了蛋白质的来源。
但这些蛋 lace 研究了来源于大肠杆菌、人和乳酸杆菌的二氢白质 ,由于表达体系本身的原因 , 或实验过程的处叶酸还原酶的复性 ,虽然这 3 种蛋白在氨基酸顺序理 ,多以无活性的形式存在 ,需要进行复性。
因此 , 上只有 30 %相同 ,但是却具有相同的复性途径和两对蛋白质复性的研究必然的成为从基础的实验室生个中间体。
蛋白质的空间结构由一系列化学键来维物工程研究到最终临床应用过程中不可避免的一系 ,其中二硫键是维系蛋白质结构完整的重要共价步。
本文将目前国内外对各种蛋白质复性方面的研键 ,二硫键的打开或错误搭配会引起蛋白质高级结究作一综述。
构的丧失 ,恢复二硫键结构是蛋白质复性的重要一步。
在蛋白质的复性过程中 ,存在一系列的结构相 1 蛋白质的结构与复性 ,这些中间体分子表面有许多疏水基团似的中间体蛋白质在一定的氨基酸顺序的基础上形成非常暴露 ,对聚集较敏感 ,易于形成沉淀。
同时 ,分子内复杂的空间立体结构 ,其组成中的氨基酸本身的特部氨基酸之间存在使蛋白质正确折叠的天然作用性是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础 , 力 ,蛋白质的复性过程就是这些中间体向两个方向尤其是处于关键部位的氨基酸 ,对蛋白质的生物学 4 选择性的演变过程,蛋白质复性效率就取决于正功能有根本的影响 ,例如镰刀型红细胞贫血症中血确折叠和变性聚集之间的竞争。
蛋白质复性
选用复性方法的原则：在包含体蛋白质的复性中， 若利用盐酸胍或尿素溶解包含体，应首先考虑通 过调节盐酸胍或尿素的浓度来获得满意的复性效 果。只有在复性效果不佳的情况下才考虑其他添 加剂。 表面活性剂、添加剂的去除是必须考虑的问题。
蛋白质复性（二）
本章内容
包含体的形成和性质 包含体的纯化和溶解 稀释复性、辅助因子的作用 分子伴侣和人工分子伴侣
本章重点
蛋白质复性的概念 包含体的概念及性质 蛋白质折叠的简化动力学模型（形成的机理） 包含体体内抑制策略 包含体分离纯化的一般方法和步骤 包含体的溶解方法 稀释复性的原理 蛋白质复性中常用的辅助因子及其作用
1.稳定天然态蛋白质的结构，降低错误 折叠蛋白质的稳定性
如甘油
2.提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度 (稳定性)
如低浓度变性剂、聚乙二醇（PEG)、表面活 性剂
辅助蛋白质复性的稀释添加剂
分类 低浓度变性剂 氨基酸 表面活性剂 物质名称 盐酸胍(0.5-2mol/L) 尿素(1-4mol/L) L-精氨酸 聚乙二醇 Triton X-100 十二烷基磺酸钠 十六烷基三甲基溴化胺 月桂醇麦芽糖苷 吐温 磷脂
4 蛋白质复性（了解）
1961年，Anfinsen发现，在自由能驱动下， 变性后的牛胰核糖核酸酶(RNase A)可在体外 通过空气氧化自发形成正确的二硫键。 提示了蛋白质一级结构和高级结构的关系。 蛋白质的一级结构含有其折叠成熟所需的全部 信息，变性的蛋白质在一定条件下可以完全自 发地恢复活性。 变性蛋白质溶解在高浓度变性剂中，降低变性 剂浓度至非变性浓度范围，就可引发蛋白质折 叠复性。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
蛋白质变复性.
目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。
基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
第10章 蛋白质复性
几种常见的工艺路线（一）
机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨） 高压匀浆、高速珠磨）
离心提取出包含体
加变性剂溶解
除变性剂复性
特点是利用了包含体与细胞碎片的密度差， 特点是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用 离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分 开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复 获得了干净的包含体， 这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、 性。这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、 热原、内毒素等杂质， 热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单 从这个角度上讲， 了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯 化亦有好处。 化亦有好处。 缺点是要经过几次离心才能除去大部分的细胞 碎片，加工时间较长。 碎片，加工时间较长。
目标蛋白的复性
蛋白质复性：以包含体形式表达的蛋白， 蛋白质复性：以包含体形式表达的蛋白，需要在分离回收 包含体后，溶解包含体使其肽链伸展， 包含体后，溶解包含体使其肽链伸展，然后在合适的溶液 环境下使目标蛋白质恢复天然构型和活性， 环境下使目标蛋白质恢复天然构型和活性，这一过程成为 蛋白质复性。 蛋白质复性。 常用复性方法： 常用复性方法： 1、稀释复性：将蛋白质溶液稀释，降低变性剂浓度。 、稀释复性：将蛋白质溶液稀释，降低变性剂浓度。 2、添加剂辅助复性：添加具有抑制蛋白质聚集体的生成。 、添加剂辅助复性：添加具有抑制蛋白质聚集体的生成。 3、分子伴侣辅助复性：抑制蛋白质错误折叠和聚集。 、分子伴侣辅助复性：抑制蛋白质错误折叠和聚集。 4、反胶团复性：反胶团溶解变性蛋白质，将变形蛋白质分子 、反胶团复性：反胶团溶解变性蛋白质， 彼此分割开，阻止分子间相互作用。 彼此分割开，阻止分子间相互作用。 5、色谱复性：利用色谱技术将蛋白质与变性剂分开，同时凝 、色谱复性：利用色谱技术将蛋白质与变性剂分开， 胶的网络结构阻滞蛋白质分子间的相互作用。 胶的网络结构阻滞蛋白质分子间的相互作用。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备( 1)查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
(2)如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
( 3)透析Buffer 的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体( Inclusion Bodies，IB)。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑： (1)退一步，优化表达条件；(2)接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCI(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT150mM NaCI, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液，因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯装40-60ml裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来.菌多就延长超声时间(全程冰浴)。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
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蛋白质的复性
为什么要进行蛋白质的复性？
外源基因导入E.coli等宿主细胞并表达蛋白质产 物（ r-干扰素，白细胞介素-2，人生长激素等） 时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质 的活性。所以要进行蛋白质的复性。
1.什么是包涵体？ 2.为什么选择原核表达系统（特别是 E.coli ）？
蛋白质复性
蛋白质复性的主要步骤：
破碎细胞
分离出包含体
溶解包含体
目标构建的构型复原。
包含体颗粒内并不一定多是表达产物，也可能含有其
他杂物，核酸，脂类，杂蛋白等.
蛋白质复性
Hale Waihona Puke 主要蛋白质复性的基本步骤和联合实验如下：
（1）机械破碎（高压匀浆，高速珠磨法）
离心法提取出包含体
加变性剂溶解
除变性剂复性。
（2）机械破碎
蛋白质复性
预防包含体形成的方法 2. 通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性. 为了使外源蛋白在E.coli细胞中可溶性，人们在培养
条件的优化方面进行了多方面的探索。 （I）通过降低培养温度可以使人干扰素2和干扰素γ
的可溶性组分提高。这些蛋白在37℃下表达时以包 含体形式存在，当将培养温度降到23~30℃时,其可 溶性组分可达30%~90%。
蛋白质复性
包含体复性的方法
影响复性蛋白产率的因素： (1) 复性蛋白的浓度,为防止蛋白质分子间发生聚 集 , 复 性 蛋 白 的 浓 度 要 尽 量 稀 , 一 般 控 制 在 25-75 ug/mL为好. (2) 复性缓冲液要保持适当的氧化还原条件.一般 GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比为1为好. (3) 复性缓冲液的pH要通过实验来确定最适值. (4) 复性溶液中要加入适当的labilizing 试剂,如L 精氨酸,可提高复性产率.
蛋白质复性
预防包含体形成的方法 1. 形成分子伴侣
? 分子伴侣是什么
参与协助新生肽链体内折叠的一类蛋白质，包括：核质素，热休克蛋白 60 家 族 （ Hsp60 ） ， 热 休 克 蛋 白 70 家 族 （ Hsp70 ） ， 热 休 克 蛋 白 90 家 族 （Hsp90）和其他种类的分子伴侣
? 分子伴侣对新生肽链折叠的促进作用
蛋白质复性
包含体的溶解
包含体是不溶于水的，为了获得可溶性的蛋 白质，首先要使其溶解，通常用强的蛋白质变性 剂。对于不同的蛋白质可采用不同的方案，需经 实 验 后 确 定 。 一 般 可 用 5~8mol/L 尿 素 或 5~8mol/L的盐酸胍溶解包含体，使非共价聚集的 蛋白质分子间分离；当包含体内蛋白质多肽链中 含有半胱氨酸时,宿主菌破碎后,在空气的氧化作 用下,蛋白质分子内部和分子间及与杂蛋白分子间 可形成二硫键,该键是一种很强的键,为使蛋白质 充分溶解,也可用低pH值(pH7.2~7.05)加含巯基 的试剂(0.1%~1%)巯基乙醇或二硫苏糖醇和适量 的SDS(1%SDS),使蛋白质完全还原,呈溶解状态, 为蛋白质的复性作好准备.
有多种可选择的质粒；
重组遗传背景清楚，基因表达易于控制；
蛋白表达量高（可达总蛋白50％）；
但原核表达系统也有一个问题，很多外源蛋白在E.coli细 胞内表达时往往以不溶的，无活性的包含体形式存在。若 能解决包含体问题，原核表达系统就可得到更广泛的应用。
蛋白质复性
现就包含体形成的预防、纯化、复性和测 定作一综述。
折叠促进剂
L-Arg, PEG, 去污剂, 尿素和盐酸胍
蛋白质复性
复性操作方法： 2.稀释和透析复性 稀释法：将溶液稀释，导致变性剂的浓度降 低，小分子折叠助剂浓度增大。蛋白质开始复性。 透析法：利用透析或电渗析超滤除去变性 剂，使蛋白质开始复性。 缺点：透析时间长，易形成蛋白质沉淀。
蛋白质复性
1.预防包含体形成的方法 2.包含体的纯化 3.包含体的溶解 4.包含体的复性
蛋白质复性
预防包含体形成的方法 由于包含体内的蛋白质是非折叠状态的聚 集体，不具生物活性，因此要获得具有生 物活性的蛋白质必须将包含体溶解，释放 出其中的蛋白质，并进行纯化、复性。近 年来人们已开始着手寻找各种方法去防止 包含体的形成。
蛋白质复性
蛋白质复性
包含体的形成
包含体（inclusion body,IB）是外源基因在原核细胞中表达时，尤 其在大肠杆菌细胞中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶 性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与细胞质中的其他 成分有明显的区别。 包涵体的形成比较复杂，有些机理还不清楚； 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或 环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 (1)包含体的形成与细胞内蛋白质的生成速率有关，新生成的多肽浓 度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白 质的聚集体； (2)包含体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、 pH值、离子强度、氧化还原电势及蛋白质转运系统的功能等因素有 关。 (3)大肠杆菌的生长过程在受到某些因素的影响时，其本身蛋白质的 表达也可出现异常，造成蛋白质的聚集从而形成包含体。 (4)重组蛋白的氨基酸组成.一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体， 而 脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
蛋白质复性
包含体的形成 蛋白质的产量是折叠和凝聚竞争的平衡，蛋白质凝聚的 成因是由于重组蛋白分子之间的疏水作用，而疏水作用 也决定了凝聚物的浓度； 二硫键的形成则决定了凝聚物本身体积的大小。蛋 白质在折叠过程中，本应于分子内部的疏水区之间相互 作用、碰撞，形成不正确的的折叠而导致凝聚，从而形 成包含体。
蛋白质复性
包含体复性的方法
影响复性蛋白产率的因素：
(5) 复性温度也是一个影响因素,一般在低温下(410℃)进行. (6) 为防止聚集发生,复性时,可采取分步加入变性 蛋白的操作方法. 在溶液中变性-复性方法受各种因素的影响,且对 不同蛋白质所需的最适条件可能又不相同,因此对 于一个特定重组蛋白的复性要通过实验找出最适 条件.
流加稀释复性 复性液中蛋白质初始浓度=0.边流加、边 复性。故变性蛋白质浓度始终保持在较低 水平，有利于提高复性收率，且终浓度较 高。
蛋白质复性的影响因素
浓度
增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行
温度
蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（＞40℃） 蛋白质的聚集将十分严重
pH值
通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免 与蛋白的pI值相近
疏水键的相互 作用强度
蛋白质复性
包涵体形成的机制：
U←→I←→N
U：指完全去折叠的状态，
I：指折叠中间体（也称融球态 molten globule state）
N：指天然的成熟的状态
蛋白质复性
Mitraki和King提出了以下包涵体的形成模型：
IPf为可溶的、部分折叠的早期中间体 IPm未可形成单体的中间体 IPf*为形成包涵体的形式
①使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力； ②在肽链折叠过程中通过与折叠中间体上暴露的疏水区域结合而防止肽 链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径
? 应用分子伴侣的策略
可采用表达外源基因的同时，共表达分子伴侣的策略。例如，GroES和 GroEL可显著提高D-核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶（rubisco）的折叠、 组装效率，从而提高可溶性重组蛋白的产量；也能提高可溶性乙酰辅酶A脱 氢酶的产量和组装效率；对可溶性β-葡萄糖苷酶的表达也有提高
蛋白质复性
包含体的纯化 含有包含体的大肠杆菌细胞膜的结构常
发生改变，脆性增加，故可利用一些简单 的方法使宿主菌释放出包含体。可用溶菌 酶、匀浆或超声波等酶法、物理学的方法 使细胞裂解。由于包含体密度高，可用短 时的低速离心（1000~12000g）将其与细 胞碎片等物质分离。
蛋白质复性
包含体的纯化 若采用密度梯度离心技术则可得到纯度较 高的包含体。如果得到的包含体含有较多 的杂质，可用含常用盐和去污剂 （TritonX-100）的溶液进行洗涤，使污染 的膜蛋白等杂质溶解，得到含杂质较少的 包含体。
蛋白质复性
蛋白质复性
路线2的特点：
方法（2）：应用膜分离技术，用微孔膜除去可 溶性蛋白质，但载留细胞碎片和包含体。优点： 可进行封闭式操作，不污染环境，也不受环境污 染，耗能少。缺点：膜的堵塞和浓度极化常导致 可溶性蛋白质的滞留，这项技术问题较多。
蛋白质复性
路线3的特点： 方法（3）：所用试剂即可以破菌，又可以溶解 包含体。将两道工序合为一道，节省了设备和时 间，比前两者更适合实验室操作。 缺点：混有杂质，不易分离。
蛋白质复性
包含体的形成的优势 形成包含体对克隆基因的表达产物蛋白质具有保 护作用，大肠杆菌可产生蛋白质水解酶，可降解 不稳定的多肽，许多可溶性的重组蛋白质对这些 酶敏感，使得利用细菌作为表达宿主时受到限制， 然而隔离在包含体内的蛋白质可免受蛋白酶的降 解作用；此外对宿主菌有毒性的重组蛋白以无活 性聚集体的形式存在也可以降低对宿主菌的毒害 作用。
（III）改变培养基的渗透压、降低pH值等方法也可 以达到减少包含体的目的。通过优化发酵条件改 善基因表达产物的方法虽然可行，然而也需要对 具体问题进行具体分析、实验。
蛋白质复性
预防包含体形成的方法
3．通过基因突变技术，在蛋白分子中产生氨基 酸取代，来增加重组蛋白的可溶性。
此方法的前提是氨基酸的取代不能使蛋白的活性 受到影响。通过氨基酸取代，改变蛋白质表面荷 电性质，减少蛋白分子之间聚集，从而防止包含 体的形成。 如上所述，多种因素影响外源基因的可溶性表达 。对于如何获得天然构象和活性的可溶蛋白质的 技术方法，目前均无统一的模式，只能通过具体 实验来确定。
优势: 包含体可避免被水解酶水解
蛋白质复性