高效液相色谱法-讲义
高效液相色谱的基本参数讲义
空柱管体积（Vc ) * 总孔隙度（εT)
to=
流动相体积流速（F c)
= π/4 *d²c *L * εT/Fc
计算孔隙度
4
§2 选择性指标( )和相对保留值()
´= t r(2) / tr(1) =(1+ k´(2)/(1+ k´(1)) = t r '(2) / tr' (1) = k´(2) / k´(1) ´作为选择性指标比 直观
溶质在流动相中的浓度(nm/Vm)
nm Vs
ns, nm 溶质在固定相和流动相中的量
2
(3) 调整保留时间
tr´= tr - to
V = VR - Vm
(4) 容量因子 (k’)
固定相中容质的量(ns)
k´=------------------------
流动相中容质的量(nm)
K = k´(Vm/ Vs)
色谱柱接连流出分离良好的色谱峰，所能够分离 的最大组分数。
为了使总分离效能指标能直接与所分析组分的 多少相关联，可以采用峰容量（P）来评价色谱柱。 色谱条件一定时，在指定的时间内，能够在色谱柱 中流出的满足分离度要求的等高色谱峰的个数。
20
21
快速色谱
tr(last) = H /u * Nmin (1+k‘last )
▪ 颗粒度越小柱效越高
• 颗粒度控制着分离的 质量
▪ 更小的颗粒度：
• 使最高柱效点向更高 线速度方向移动
• 有更宽的线速度范围
▪ 降低颗粒度不但可以 增加柱效，同时也增 加分离速度
如果填料的颗粒继续演变……
更小的颗粒度……
被n)
Linear velocity(u,mm/sec)
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
第二十章 高效液相色谱法
第二十章高效液相色谱法一、内容提要高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱的基础上引入气相色谱的理论和技术，并加以改进而发展起来的一种高压、高效、高速、高灵敏度的色谱分析方法。
其定量分析方法与气相色谱法相同。
高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和记录数据处理系统构成。
根据不同的分离对象常选择不同的固定相和流动相，常用的固定相为化学键合固定相，流动相通常用恒流或梯度洗脱方式洗脱组成。
其定量方法同气相色谱法。
本章重点是高效液相色谱法与经典液相色谱法和气相色谱法的比较，高效液相色谱仪的组成及仪器操作注意事项；难点是定量分析方法。
二、习题（一）判断题（F ）1．高效液相色谱中的流动相是分析成败的关键，它直接关系到柱效和分离度。
（T）2．紫外检测器是HPLC中应用最普遍的检测器。
（T）3．对于亲脂性试样的分离，合适的高效液相色谱类型为反相液－液色谱。
（T）4．在高效液相色谱中，采用梯度洗脱可提高色谱的分离度。
（T ）5．在高效液相色谱中采用进样阀进样可以降低进样过程对整个系统的扰动。
（F）6．高效液相色谱仪，通常是直接在层析柱上进样的。
（T ）7．化学键合相，可克服固定液的流失。
（T ）8．HPLC法中常用η较小的流动相。
（F）9．化学键合相，对极强的酸具有很好的稳定性。
（T ）10．化学键合相的优点是耐溶剂冲刷。
（F ）11．高效液相色谱柱可以是任意形状的。
（二）单选题1．在高效液相色谱中，最常用的检测器是（A ）A．紫外检测器B．荧光检测器C．示差折光检测器D．电导检测器E．蒸发光散射检测器2．在高效液相色谱中，适用于紫外检测器作流动相最合适是（A）A．在波长190nm以上无吸收峰B．在波长为254nm以上无吸收峰C．在波长为365nm以上无吸收峰D．在波长为280nm处无吸收峰E．以上均非3．在高效液相色谱中，为了获得较高柱效能，常用的色谱柱是（A ）A．直型柱B．S型柱C．U型柱D．螺旋形柱E．不规则型柱4．高效液相色谱与经典液相色谱的主要区别在于（B ）A．高温B．高效C．柱短D．上样量少E．流动相5．高效液相色谱与气相色谱仪比较，增加了B）A．恒温器B．高压泵C．程序升温D．检测器E．自动进样器6．在高效液相色谱中，范氏方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略不计（D ）A．涡流扩散项B．流动相的传质阻力项C．固定相的传质阻力项D．分子纵向扩散项E．以上均非7．下列固定相，能用于高效液相色谱的是（C）A．硅藻土B．氟担体C．全多孔无定形D．玻璃微球E．硅石微球8．利用高效液相色谱法对试样进行分离时，首先要选择的是（D）A．流速B．柱温C．柱压D．固定相E．检测器9．在高效液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（D ）A．几何异构体B．极性化合物C．分子量相差大的混合物D．分配比变化范围宽的复杂试样E．挥发性组分10．RP—HPLC法最常用的流动相体系是（B ）A．CH3CH2OH—H2O B．CH3OH—H2O C．CH3COCH3—H2OD．CH3COOC2H5—H2O E．CHCl3—(CH3CH2)2O（三）多选题ACDE1．在高效液相色谱中，二个溶质的分离度与下列哪些因素有关（）A．增加柱长B．改用更灵敏的检测器C．更换固定相D．更换流动相E．改变流速ABC2．常用的HPLC法中色谱柱的规格是（）A．10cm B．15cm C．25cm D．35cm E．45cmAB C E3．高效液相色谱的特点是（）A．高速化 B．高效化 C．高压化 D．高进样量 E．高灵敏度ABCDE4．高效液相色谱仪的主要组成系统是（）A．高压输液系统B．进样系统C．分离系统D．检测系统E．数据处理系统BC5．高效液相色谱法对流动相的要求是（）A．应与固定相有一定的互溶度(与固定相不互溶) B．其性能应与所用检测器相匹配C．对样品有足够的溶解能力D．应尽量选用低毒高粘度的溶剂，如乙醇E．应尽量选用高沸点的溶剂以防止操作过程中溶剂挥发ABD6．HPLC法中常用的检测器有（）A．UVD B．DAD C．FID D．ELSD E．TCDABCE7．下列关于HPLC仪中高压进样阀的叙述，正确的是（）A．进样量准确B．重复性好C．可带压进样D．死体积小E．使用方便ABCDE8．化学键合相的优点是（）A．使用过程不流失B．化学性能稳定C．热稳定性好D．载样量大E．适于作梯度洗脱（四）填空题1．高效液相色谱法的分类，按固定相的聚集状态可分为及两大类，按分离机制可分为、、、四种类型。
色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
由于硅胶比较便易。所以进行分离比较有利，同时流动相为有机溶剂，容易挥发。便于产物提取。
4. 常用于HPLC-GC联用技术
由于流动相为有机溶剂，易于汽化，所以目前90%的HPLC-GC中的HPLC部分采用LSC，进行正相HPLC。
二、液-液分配色谱法（LLC）
（一）定义
色谱分离是基于样品组分在固定液和流动相之间分配的不同色谱法称为液-液分配色谱法。
能在线检测
不能在线检测
定性定量的准确度
好
差
（二）与GC比较
1、适合于热不稳定性样品的分析
GC中使用气体为流动相，要求被测样品在气化室高温气化后方可在柱上分离，这就使得热不稳定性样品用GC分析比较困难，需衍生化以保护被测物的不稳定基团
2、有利于有机酸，碱等极性化合物的分离
这些物质用GC直接来测定时，由于有较大的极性，一方面易产生托尾的现象，另一方面，保留时间过长，因而测定困难，需利用衍生化来减小其极性后方可GC分析
（一）固定相
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
液－固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一种柱色谱类型。在吸附色谱中，样品组分（溶质）受到两种力的作用，一是固定相对它的吸附力，二是流动相的“拉力”或溶解力，即溶质处于这两相作用力场的平衡之中。吸附力强而溶解能力差时，溶质有较大的保留；反之，则较先流出色谱柱。溶质，吸附剂和流动相溶剂分子三者间的相互作用，涉及偶极之间的诱导力，静电力，氢键力，色散力，电荷转移或∏络合物形成等相互作用类型。在氧化物型极性吸附型上，静电，诱导，氢键等特殊作用力为主要的作用力，色散力微不足道。但在非极性的固定相，例如多孔碳的情况下，非特殊的色散力是固定相与溶质分子间唯一的相互作用力。
高效液相色谱分析(主要分离类型与原理)课件
• 高效液相色谱分析简介 • 高效液相色谱的主要分离类型 • 高效液相色谱的分离原理 • 高效液相色谱分析实验操作与注意事项 • 高效液相色谱分析的应用实例
目录
Part
01
高效液相色谱分析简介
高效液相色谱分析的定义
高效液相色谱分析（HPLC）是一种分离和检测复杂样品中各种组分的方法。它利用不同 物质在固定相和流动相之间的分配平衡来实现分离。
THANKS
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Part
03
高效液相色谱的分离原理
高效液相色谱的固定相与流动相
固定相
是色谱柱中的填充物，用于吸附 和固定样品中的组分。常见的固 定相包括硅胶、氧化铝、活性炭 等。
流动相
是携带样品通过色谱柱的液体或 气体，与固定相相互作用，使各 组分得以分离。
高效液相色谱的分离过程
样品在流动相中溶解并被 带入色谱柱。
实验操作前的准备
实验器材与试剂准备
确保所需的色谱柱、检测器、流动相 、样品等都已准备好，并确保试剂的 质量和纯度。
实验条件设定
仪器校准与维护
确保色谱仪器的准确性和稳定性，进 行必要的校准和日常维护。
根据实验需求，设定合适的流动相比 例、流速、检测波长等参数。
实验操作步骤与要点
样品处理
根据实验要求，对样品进 1
Part
02
高效液相色谱的主要分离类型
吸附色谱
STEP 01
原理
STEP 02
应用
利用固定相吸附剂对不同 组分的吸附能力差异实现 分离。
STEP 03
特点
固定相的吸附能力可以通 过改变流动相的组成进行 调节。
高效液相色谱(HPLCHigh Performance Liquid
高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。
国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。
高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。
其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。
目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。
一、基本原理固定相流动相AB CCBA固定相——柱内填料，流动相——洗脱剂。
HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。
通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：——分配系数亲和色谱：——亲和力吸附色谱：——吸附力离子交换色谱：——离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大小而引起的体积排阻分配色谱又可分为：正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。
用的最多，约占60～70％。
固定相（柱填料）：固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。
后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。
它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。
它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。
中国药典 高效液相色谱讲义
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
液相操作讲义gere
采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析 时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙 腈的含量)。
• 流速和柱温均可适当改变，以适应测定 的需要。如含量测定时，可适当加大流 速和提高柱温；改变柱温和流速降低均 可提高分离效果。
• 第一次测定时，应先将空白溶剂、对照 品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量 收集较长时间的图谱（如30分钟以上）， 以便确定样品中被分析组分峰的位置、 分离度、理论板数及是否还有杂质峰在 较长时间内才洗脱出来，确定是否会影 响主峰的测定。
色谱柱的使用与维护
• 阅读说明书 • 安装时注意方向 • 如何排气泡？ • 反相柱C-18或C8当用含缓冲盐或表面活性
剂的流动相后，要冲洗干净。
色谱柱的使用与维护
• 色谱柱不用、存放时，两头柱塞一定塞住，防 止柱内溶剂挥干,否则容易挥发干损伤柱子。
• 分析生化样品、血液制品和手性色谱柱时，最 好加一预柱以保护。
• d、流动相的物化性质要与使用的检测器 相适应。如使用UV检测器，最好使用对 紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产 生气泡，导致实验无法进行。
流动相为什么要脱气
• 流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中 溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当 流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而 产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏 度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致 样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解 而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成 荧光猝灭。
• 2、影响柱效的因素有哪些？ • 3、影响分离度的因素有哪些？ • 4、影响重复性的因素有哪些？
仪器
Rs
影响分离的因素
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
第二十章高效液相色谱(第五版)
基态
特点： • 灵敏度高 • 选择性高 • 不需光源
52
第四节 定性与定量
一、定性方法 • 色谱鉴定法 • 化学鉴定法
• 两谱连用鉴定法
53
二、定量方法 • 用15cm长的ODS柱分离两个组分。柱效n = 2.84104m-1；测得t0 = 1.31min；组分的tR1 = 4.10min；tR2= 4.45min。（1）求k1、k2、 、R值。（2）若增加柱长至30cm，分离度R 可否达1.5?
15
(三) 反相离子对色谱法 paired ion chromatography, PIC ion pair chromatography, IPC
定义：离子对试剂加入极性流动相中，样
品离子与反离子生成中性离子对，
使样品的K增加，改善分离效果。
16
1. 离子对试剂：
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵 或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作 为对离子；
用途：生物碱、有机酸、磺胺类药物等。
20
其它色谱法
1. 离子色谱
ion chromatography
离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一 种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制 的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料 ，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混
合阴离子的有效方法。
（2）L2 = 30cm:
R1 2 L1 ( ) R2 L2
L2 30 R 2 R1 1.33 1.88 L1 15
56
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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A2dp
A dp
B2D m2Dg BtR， BDg
Dg T或Dg
T M
C C mC sC gC l C l
Cl
df 2 Dl
DL
T
续前
2. H： P H L A C C u
B2D m
Dm
T
柱T温 低，流 大 动 B 相 相忽略
➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）next
固定液——极性→NLLC 固定液——非极性→RLLC 3．正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（NLLC） ➢ 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 ✓ 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC） ➢ 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 ✓ 适于分离非极性组分
三、化学键合相色谱法（BPC）
பைடு நூலகம்
tR
t0(1K
S Vm
)
kK S Vm
➢ 分离前提：K不等或k不等
续前
2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）
（1）硅胶
表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶 无定形 YWG
球形 YQG 堆积硅珠 YQG 3~4 μm
5~6μm 5×104 3~4μm 8×108
8×108 理想
原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物
精品
高效液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别
✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
u1cm /s时H ， u
u H， n 柱 效 ，tR 但
兼顾柱效和分选 析择 时 u1间 ml/， min
2）涡流扩散项及其影响 next
A2dp
A dp
， d p A H ， n柱 效
图示
back
续前
3）传质阻抗项及其影响
CCmCsmCs CmCs（ m 忽略固定相 ）传 注：只考虑流动相态 和流 静动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
H： P H A L C m C u C s m u
Cm
Csm
dp2 Dm
dp 2 C
Dm
Dm
T
d p C H， n 柱 效
D m H ， n柱 效
TDm C，但易产生气泡
TDm ，，柱阻
图示
三、HPLC法中分离条件的选择
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱
3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
续前
四、HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
（2）高分子多孔小球：YSG
原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
续前
3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 ✓ 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -
4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温250C左右
第三节 各类高效液相色谱法
一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（BPC）
一、液固吸附色谱法（LSC）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异
二、HPLC与GC差别
✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 ✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
✓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC • 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 • 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体
吸附的水→固定液
二、液液分配色谱法（LLC）
1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） ➢ 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用
续前
2．流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
第二节 基本理论和条件选择
热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——Vander方程
基础
一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择
一、塔板理论
H理L/n理 n理(tR)25.5(4 W t1 R2)21(6 W tR)2
Heff L/neff
neff16(W tR ' )2
5.54( tR ' )2 W12
k
t
' R
t0
neff n理(1kk)2
二、速率理论（与GC对比）
1. GC：HAB/uCu （填充柱）
或 H B/u Cu （毛细管柱）
（一）化学键合相 （二）反相键合相色谱 （三）正相键合相色谱 （四）离子对色谱和离子抑制色谱
（一）化学键合相
利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面