外显子组测序信息分析
外显子查找方法范文
外显子查找方法范文外显子（exon）是基因组中编码蛋白质的片段，它们是基因转录后的成果。
外显子查找是基因组学领域的一个重要任务，它可以帮助我们了解基因的功能和结构，以及鉴定和研究基因突变和遗传疾病。
在过去的几十年里，外显子查找方法经历了多次技术革新，从最早的Sanger测序到现在的高通量测序技术。
下面将介绍几种常用的外显子查找方法。
1. Sanger测序：Sanger测序是一种经典的测序技术，通过反复合成DNA链并在每个碱基上加入一种特殊的标记物来测定DNA序列。
借助Sanger测序，我们可以逐个测定DNA的碱基顺序，并通过比对已知外显子序列来确定外显子的位置。
2. 基于EST序列的外显子查找：EST（Expressed Sequence Tag）是从cDNA文库中得到的短序列片段，它们通常来自于外显子区域。
利用EST序列可以通过比对已知外显子序列来推断新的外显子。
3. 基于数据库的外显子查找：利用已知的外显子序列建立外显子数据库，如Ensembl、NCBI等，可以快速比对新的DNA序列来鉴定外显子。
4. 基于高通量测序的外显子查找：高通量测序技术的发展使得我们可以快速测定大量的DNA序列，从而推断编码蛋白质的外显子序列。
常用的高通量测序技术包括二代测序技术（如 Illumina、Iontorrent）和三代测序技术（如 PacBio、Nanopore），它们通过将DNA序列拆解成短片段并进行平行测序来提高测序速度。
5. 基于RNA-Seq的外显子查找：RNA-Seq是一种利用高通量测序技术直接测定RNA序列的方法。
由于RNA是从基因组DNA转录而来的，因此RNA-Seq可以直接测定外显子序列。
此外，由于RNA-Seq还可以检测到转录后修饰和剪接等信息，因此它成为目前外显子查找的主要方法。
总的来说，外显子查找是基因组学研究中的一项重要任务。
不同的外显子查找方法有不同的优缺点，在实际应用中需要根据研究的目的、样本的可得性和测序平台的要求来选择合适的方法。
外显子测序 生物学重复-概述说明以及解释
外显子测序生物学重复-概述说明以及解释1.引言1.1 概述外显子测序（exome sequencing）是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法，其目的是对生物体中的外显子区域进行快速、准确地测序和分析。
外显子是基因组中编码蛋白质的片段，它们占据了整个基因组的仅0.5至1.5的区域，但却承载着80以上的已知致病突变。
因此，外显子测序被广泛应用于寻找蛋白质编码基因的突变，以及与遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病相关的致病突变的鉴定和研究。
外显子测序的基本原理是使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，然后利用生物信息学方法将测序结果与参考基因组进行比对和分析，从而确定样本中外显子的序列和存在突变的位置。
与全基因组测序相比，外显子测序具有较低的成本和更高的效率，因为外显子相对较小且具有较高的功能重要性，可以更准确地筛选和鉴定潜在致病突变。
外显子测序在生物学研究中的应用广泛而重要。
它不仅可以用于研究人类遗传性疾病和肿瘤突变，还可应用于农业、畜牧业和其他生物领域的基因组学研究。
通过对不同个体的外显子进行测序，我们可以了解个体间的遗传差异、突变积累和遗传进化规律，为人类进化和适应性研究提供重要依据。
然而，外显子测序也面临一些挑战。
首先，由于外显子区域相对较小，它只能提供关于外显子的信息，对非编码区域的突变鉴定有限。
其次，外显子测序在处理复杂疾病和疾病相关基因组变异时可能会遇到困难，因为这些变异可能位于基因的调控区域或与功能相关的非编码RNA中。
此外，外显子测序对测序深度和准确性要求较高，因此需要高质量的测序平台和数据分析方法的支持。
总之，外显子测序作为一种高效、准确的测序技术，在生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和应用的不断扩大，外显子测序将为我们揭示生物体的基因组变异与功能之间的关系，为疾病的早期诊断和个性化治疗提供更多可能性。
同时，对于生物学重复的研究也为我们提供了全新的视角和理解，有助于揭示生命的奥秘和进化的规律。
利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• /SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
外显子组测序数据分析流程
外显子组测序介绍外显子（exon）是真核生物基因的一部分，包含着合成蛋白质所需要的信息。
全部外显子被称为“外显子组”（Exome）。
外显子组测序（Exome sequencing）是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
由于外显子组测序捕获目标区域只占人类基因组长度的约1%，因此远比进行全基因组序列测序来得更简便、经济，目标区域覆盖度也更高，便于变异检测。
该项技术可用于以下研究1）检测疾病样本中外显子区域内高风险碱基变异位点；2）配合大样本分析，确定孟德尔遗传疾病相关外显子SNP位点和基因；3）在癌症研究过程中，检测癌症样本外显子区域内的体细胞突变位点和潜在的融合基因；4）用于种群遗传学研究的大规模样本基因组分析，检测SNP位点、LD并绘制种群图谱。
我们能提供详尽的全基因组重测序数据的处理和分析服务。
如您没有标准化的数据、只需流程中的局部分析内容或要求特立独行的数据分析思路，我们亦能满足您的要求。
数据处理和分析流程图预期结果示例图示例图1 各类型SNV在样本中的个数统计。
示例图2 不同类型外显子区域上的SNV类型统计。
示例图4 融合基因预测[1]示例图4 大量样本的GWAS分析结果[2]示例图5 肿瘤样本高频率突变基因统计[3]示例图来源文献[1]. Kangaspeska, S., et al., Reanalysis of RNA-sequencing data reveals several additional fusion genes with multiple isoforms. PLoS One, 2012. 7(10): p. e48745.[2]. Craig, J.E., et al., Rapid inexpensive genome-wide association using pooled whole blood. Genome Res, 2009. 19(11): p. 2075-80.[3]. Bea, S., et al., Landscape of somatic mutations and clonal evolution in mantle cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(45): p. 18250-5.。
外显子组测序数据分析流程
外显子组测序数据分析流程外显子组测序（Exome Sequencing）是一种用于测序所有编码蛋白质的外显子区域的技术。
外显子是基因组中编码蛋白质的区域，占据整个基因组的约1-2%。
相较于全基因组测序，外显子组测序可以更加经济高效地研究和发现与疾病相关的基因变异。
以下是外显子组测序数据分析的一般流程：1.数据质控和预处理2.比对和变异调用将预处理后的数据与参考基因组进行比对，可以使用多种比对工具，如BWA、Bowtie等。
比对后，会通过一系列的筛选步骤，利用各种变异检测算法对测序结果进行检测，包括单核苷酸变异（SNV）、小片段插入/缺失（Indel）和结构变异（SV）等。
3.变异注释在进行变异注释时，将检测到的变异与各类公共数据库（如dbSNP、ClinVar等）进行比对，以确定变异的频率和相关的临床信息。
还可以使用预测软件预测变异的功能影响和通路关联等。
4.功能分析和数据解读对于已注释的变异，需要进一步进行功能分析和数据解读。
这包括通过标准化的生物信息学和统计学方法对候选变异进行筛选，确定相关性并验证其是否对目标表型有影响。
可以使用多种工具和软件，如ANNOVAR、Variant Effect Predictor（VEP）等。
5.通路分析和功能富集通路分析和功能富集分析帮助理解变异对细胞、组织或系统功能的影响。
可以使用数据库和工具，如DAVID、GSEA等，通过GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）路径信息和其他公共基因组学数据库，对变异进行通路富集和功能分析。
6.结果呈现最后，将数据分析结果通过可视化图形、表格和注释报告等形式进行展示和呈现。
这有助于更好地理解分析结果并帮助研究人员做出进一步的研究和决策。
需要注意的是，外显子组测序数据分析流程是根据具体研究目标和实验设计而有所不同的，上述流程仅为一般参考。
外显子组测序
346: 256-259.
［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48
个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的 基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域 样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别 出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突 变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。
应用方向
孟德尔疾病研究
马布里综合症[1]：发现致病基因PIGV； 逆向性痤疮[2]：发现致病基因NCSTN； 眼皮肤白化病[3]：发现致病基因SLC24A5； 先天性肾脏和尿道畸形[4]：发现致病基因DSTYK;
复杂疾病研究
混合型低脂血症[5]：发现致病 基因ANGPTL3； 孤独症[6]：发现11 个新生突变 ……
[9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116.
应用全外显子组测序产前诊断1例罕见的条纹状骨病伴颅骨硬化症
孕妇31岁，丈夫39岁，孕2产1，平素月经规律，（5～6）/28 d，末次月经2017年8月30日。
2017年12月7日因外院“孕12+3周B 超提示胎儿颈后透明带厚度0.3 cm”转诊至解放军总医院第一医学中心，孕14+1周复查B 超提示胎儿颈部皱褶（nuchal fold，NF ）厚度 0.48 cm，余未见明显异常；孕17+4周超声提示胎儿NF 厚度 0.76 cm，下颌骨短小，胎儿透明隔腔显示不清。
孕20周超声提示胎儿左侧侧脑室1.15 cm，NF 厚度 0.61 cm，透明隔及胼胝体可见；羊膜腔穿刺取羊水20 ml 进行细胞培养，经过胰蛋白酶消化、Giemsa 染色显带，行染色体核型分析未见异常；另取羊水10 ml，提取胎儿基因组DNA 行单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array，SNP array ）检测亦未见染色体拷贝数异常。
孕22+6周超声提示胎儿左侧侧脑室增宽，宽约1.15 cm，胎儿NF 厚度 0.64 cm，孕妇和家属选择继续妊娠。
孕28周外院超声提示羊水指数33.5 cm，再次转至我院，孕31+4周超声提示胎儿双顶径9.37 cm，头围34.93 cm，左侧侧脑室1.02 cm，腹围30.07 cm，股骨长6.01 cm,羊水指数42.8 cm，脐动脉收缩压/舒张压（S/D ）2.9～4.2，收入院。
考虑不除外单基因遗传病，建议取羊水行全外显子组测序，告知为科研性质，结果回报需时较长，可能无助于处理。
夫妻双方同意行核心家系全外显子组测序及可疑致病位点Sanger 测序验证：提取羊水及夫妻双方外周血基因组DNA，质检合格后进行文库制备。
采用IDT The xGen Exome Research Panel v1.0全外显子捕获芯片实现目标序列的靶向富集，进行文应用全外显子组测序产前诊断1例罕见的条纹状骨病伴颅骨硬化症 许伊云 张鑫悦 汪淑娟 谢潇潇 周红辉 游艳琴 卢彦平（解放军总医院第一医学中心 妇产科，北京 100853）·病例报告·DOI ：10.3969/j.issn.2095-5340.2020.02.019基金项目：军队计生专项研究基金军队出生缺陷干预救助体系的研究（16JS010）通信作者：卢彦平（Email ：***************）库构建，经Illumina NovaSeq 6000系列测序仪高通量测序，目标序列测序覆盖度≥99%。
全外显子组测序鉴定一家系长岛型掌跖角化症SERPINB7基因突变分析
全外显子组测序鉴定一家系长岛型掌跖角化症SERPINB7基因突变分析作者：黄闰娣王笑宇刘成李荣华余佳林李常兴来源：《右江医学》2021年第04期【摘要】目的对一例临床诊断遗传性掌跖角化症患者进行全外显子组测序分析致病基因。
方法收集一例临床诊断遗传性掌跖角化症的临床资料，采集患者及家系成员样本提取外周血DNA，通过全外显子组测序结果筛选致病变异，进一步用Sanger测序进行家系验证。
结果一家系成员3人，患者1人，女，17岁，表现为掌跖角化症17年。
患者检测到SERPINB7纯合突变c.796C>T（p.Arg266Ter）位点，该突变导致SERPINB7基因编码的蛋白第266位氨基酸由精氨酸變为终止密码。
先证者父亲和母亲均检测到SERPINB7杂合突变c.796C>T（p.Arg266Ter）位点。
该例患者诊断为长岛型掌跖角化症（Nagashima-type palmoplantar keratosis，NPPK）。
结论 NPPK患者符合常染色体隐性遗传模式，SERPINB7 c.796C>T（p.Arg266Ter）基因纯合突变是导致该例NPPK患者的临床表型。
【关键词】长岛型掌跖角化症;丝氨酸蛋白酶抑制剂B7;基因;突变中图分类号：R758.5+3 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.04.004Analysis on SERPINB7 gene mutation in a family with Nagashima-type palmoplantar keratosis identified by whole exome sequencing[HJ2][HJ]HUANG Rundi1， WANG Xiaoyu2， LIU Cheng2， LI Ronghua3， YU Jialin1， LI Changxing4（1. Department of Dermatology， Dalang Hospital of Dongguan， Dongguan 523770，Guangdong， China;2. Department of Dermatology， Guangdong Armed Police Corps General Hospital Affiliated to GuangzhouMedical University， Guangzhou 510517， Guangdong， China; 3.Department of Dermatology， Quanzhou FirstHospital Affiliated to Fujian Medical University， Quanzhou 362000， Fujian， China; 4. Department ofDermatology， Nanfang Hospital of Southern Medical University， Guangzhou 510515，Guangdong， China）[HJ2][HJ]【Abstract】 Objective To carry out whole exome sequencing on 1 case of hereditary palmoplantar keratosis diagnosed in the clinic， so as to analyze pathogenic genes of it.Methods The clinical data of a case of hereditary palmoplantar keratosis were collected. The samples of the patient and her family members were collected to extract the peripheral blood DNA. Pathogenic variants were screened by the results of whole exome sequencing， and Sanger sequencing was used for further family verification.Results The family （3 members） included a 17- year-old female patient， characterized by palmoplantar keratosis for 17 years. A homozygous mutation of SERPINB7c.796C>T（p.Arg266Ter） was identified in the patient， which caused the protein 266 amino acid encoded by the SERPINB7 gene to change from arginine to termination code. SERPINB7 heterozygous mutation c.796C>T （p.Arg266 Ter） locus was detected in both father and mother of the patient. So the patient was diagnosed with Nagashima-type palmoplantar keratosis （NPPK）.Conclusion The NPPK patient is consistent with autosomal recessive inheritance pattern， and SERPINB7 c.796C>T（p.Arg266Ter） homozygous mutation is responsible for the clinical phenotype of this NPPK patient.【Key words】 NPPK; SERPINB7; gene; mutation长岛型掌跖角化症（Nagashima-type palmoplantar keratosis，NPPK）首先在日本报告，是一种罕见的先天性掌跖角化症，遗传模式符合常染色体隐性遗传，临床表现为掌跖等部位出现红斑、丘疹、斑块、角化，常伴真菌感染或手足多汗症[1～2]。
全基因组外显子测序及其应用
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panel全外显子组与全基因组测序的全方位对比
14
捕获探针供应商
国外较大的提供杂交捕获探针库的供应商
Agilent SureSelect
Roche NimbleGen
IDT xGen™
Twist Bioscience Human Core Exome
国内
迪赢生物
15
靶向捕获与冗余数据
液相杂交捕获技术流程图
冗余数据的产生
同源序列
目标序列
同源序列干扰
panel大小约1-2M，约占全外显子的1%-2%左右
2
检测范围与测序深度
全基因组测序 全外显子组测序 不孕不育panel
30-40X 100-150X 500X以上
3
检测方案的选择
WGS
WES panel
panel和WES，临床上如何选择？
panel具有更低廉的价格，更高的测序深度 WES具有更广泛的检测范围
表型遗传异质性较高，疾病 复杂，难以区分，需要对大 量基因进行筛查，更适合 WES或WGS。
PMID: 29398702
5
检测方案的选择
神经系统疾病/发育异常类疾病
精子异常导致的男性不育
智力障碍
小儿癫痫
线粒体病
行为异常 遗传代谢病
神经肌肉病
基因数量多达2000个以上，表型异质性高，症 状难以区分，容易误诊，更适合WES/WGS
WGS包含所有碱基，可以检测 CNV和非编码序列 panel可定制检测范围，可以加 入WES不包含的目标区域
WES测序深度还不足以区分真 假基因，深度更高的panel却有 可能做到。
23
安捷伦各版本WES对比
靶标 大小
设计 大小
V8
35.1 Mb 41.6 Mb
外显子组测序数据分析流程
外显子组测序数据分析流程第一步是测序质量控制。
测序数据通常会包含原始质量信息，例如每个碱基的测序质量分值。
在进行后续分析之前，需要对原始数据进行质量控制，以排除低质量的测序片段。
这可以通过软件工具如FastQC、Trimmomatic等来实现。
第二步是参考基因组比对。
将测序reads与参考基因组进行比对，以确定每个reads在基因组上的位置。
通常使用比对工具如Bowtie、BWA、STAR等进行比对。
比对过程中还需要考虑测序片段与基因组上的插入或缺失。
第三步是变异检测。
检测样本与参考基因组之间的差异，包括单核苷酸变异（SNV），小片段插入/缺失（indel），或其他结构变异（如倒位、插入、缺失）。
这一步可以使用工具如GATK、VarScan、FreeBayes等进行。
变异检测通常还需要进行过滤和注释，以去除假阳性和提供更多信息。
第四步是注释和解释。
注释工具可以提供关于检测到的变异的相关信息，如功能影响（是否影响蛋白质编码区域、废弃子区域等）、遗传频率（在人群中的频率）、疾病相关性等。
注释通常使用数据库如dbSNP、ClinVar、ENCODE等。
第五步是功能注释和路径分析。
通过功能分析，可以确定变异对基因和蛋白质功能的潜在影响。
这一步通常包括寻找功能相关的通路、启动子、增强子等。
功能注释工具如ANNOVAR、VEP等可以用于此目的。
第六步是检查获得的变异是否与特定疾病相关。
这可能涉及疾病数据库的查询，查找具有相似变异的疾病类型，或与具有已知疾病相关突变的患者进行比较。
第七步是对发现的相关变异进行验证。
验证可以通过其他实验室技术如Sanger测序、聚合酶链反应（PCR）、Western blot等来进行。
这有助于确认特定变异是否与所研究的疾病相关。
第八步是数据可视化和报告。
利用可视化工具如IGV、Circos等对测序和分析结果进行可视化，以便更好地理解和解释数据。
此外，还需要准备一份报告，详细说明分析过程、发现的变异以及相关的功能和疾病关联信息。
外显子组测序信息分析
外显子组测序信息分析外显子组测序技术的基本步骤包括DNA提取、文库构建、高通量测序和生物信息学分析。
首先，从样品中提取DNA，通常使用血液或组织样本。
然后，将DNA片段切割，并使用特定的引物将其扩增为文库。
接下来，将文库中的DNA片段进行高通量测序，产生大量的短读取序列。
最后，使用生物信息学工具对测序数据进行分析，以寻找变异并解读其意义。
外显子组测序的结果可以提供大量有关基因组的信息。
首先，可以检测SNV和Indel等单个碱基突变，这些突变可能与人类疾病的发生相关。
其次，可以检测到外显子区域的读框错移突变，这些突变可能会导致蛋白质的功能改变。
此外，还可以通过检测外显子区域的拷贝数变异(CNV)来揭示与疾病相关的基因缺失或复制。
最后，外显子组测序还可以帮助发现新的基因和调控元件，以及对个体之间的遗传差异和基因底物关系进行研究。
虽然外显子组测序技术已经取得了很大的成功，但仍然面临一些挑战。
首先，外显子组测序只能揭示外显子区域的变异，而无法揭示基因组的其他部分。
其次，由于测序数据的复杂性，需要进行大量的生物信息学分析，对于没有相关经验的研究者来说可能会有一定的难度。
此外，由于运营和存储测序设备的成本较高，外显子组测序对实验室和研究者的设施和经济资源要求较高。
总之，外显子组测序是一种强大的技术，可以揭示与人类疾病相关的基因变异。
通过对测序数据的分析和解读，可以帮助我们更好地理解基因组的结构和功能，为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
尽管面临一些挑战，随着技术的进步和成本的下降，外显子组测序在个性化医学和遗传学研究中将发挥越来越大的作用。
什么是WES,WGS和Panel？
什么是WES,WGS和Panel？字幕全⽂在使⽤NGS测序技术进⾏遗传学筛查时，经常会遇到WGS，WES和Panel这三个词。
是什么意思呢？WGS和WES分别是全基因组测序，全外显⼦组测序的⾸字母缩写。
Panel的字⾯意思是仪表的⾯板，⽤在NGS测序中会翻译成“基因包”。
WGS，WES和Panel有什么特点呢？打个⽐⽅来说，全部的基因组序列有3个Gb这么⼤。
如果测序数据有10个Gb的话，可以覆盖全基因组3次左右，我们称为3X测序深度。
⽽对于编码蛋⽩的外显⼦区域，只占基因组的1%，也就是30Mb⼤⼩。
10个Gb的测序数据可以达到100X以上，更不⽤提只筛查⼀部分基因的Panel了，不需要10Gb数据，只要1个Gb就可以达到1000X左右了。
数据量越少价格越便宜当然是⼀⽅⾯，Panel的⼀个很⼤的优势是测序深度⾼。
这有什么好处呢？对于某个野⽣型是GG的位点来说，假如有⼀个杂合突变，基因型就变成了GT。
在测序数据中会同时出现带有G和T的序列，它们的⽐例⼤概是⼀半对⼀半。
在进⾏遗传学检测的时候，会使⽤测序数据来推测真实的基因型。
通过和参考序列做⽐较，我们会认为该位点发⽣了杂合变异，为了防⽌被偶然的测序错误⼲扰，⾄少需要存在⼀定数量的变异序列，才能⽀持这个位置发⽣突变的结论。
这就需要该位置有⼀定的测序深度，⽐如说⾄少20X。
由于测序和分析过程中的系统偏好性，带有G和T的序列可能不是⼀半对⼀半。
与其他测序位置相⽐，也不会都是20X，⽽是呈现⾼⾼低低的样⼦。
这与基因组GC含量，捕获时的探针特异性等因素有关。
因此测序深度越⾼，存在这些问题的区域就越少，漏掉变异信息的可能性也就越⼩。
另外，⾼测序深度对发现镶嵌变异也是有利的。
变异发⽣在受精卵阶段时，不管对多少个细胞进⾏测序，变异的序列总是各占⼀半。
⽽变异发⽣在发育的中间阶段时会出现镶嵌的情况，想要检测较低⽐例的镶嵌，就需要⽐较⾼的测序深度了，可能只有基因Panel能够⽐较好的完成这项任务。
211057907_全外显子测序鉴定1例遗传性球形红细胞增多症SPTB基因新突变
㊃案例分析㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2023.07.039全外显子测序鉴定1例遗传性球形红细胞增多症S P T B基因新突变*温晓君1,李志明2,方小武1ә广东省中山市博爱医院:1.生殖医学中心;2.产前诊断中心,广东中山528403关键词:遗传性球形红细胞增多症;全外显子测序;S P T B基因中图法分类号:R446.11文献标志码:C文章编号:1672-9455(2023)07-1020-03遗传性球形红细胞增多症(H S)是最常见的遗传性溶血性贫血,其特征是外周血涂片上出现球形红细胞,具有广泛的临床表现(无症状到严重溶血),其中贫血㊁黄疸和肝脾肿大是其典型的表现[1]㊂H S在世界各地均有发病,尤其北欧和北美人群更为常见,发病率分别为1/5000和1/2000,该病在中国人群中相对罕见,相关研究报道较少[2]㊂在临床上H S基于多种临床指标进行诊断,具有高度的临床异质性,因此H S往往容易被误诊或漏诊[3],特别是在珠蛋白生成障碍性贫血高发地区㊂H S的发病机制是由基因缺陷导致红细胞膜蛋白异常,迄今为止已发现5个基因与H S有关㊂本文报道了1例中国年轻女性由S P T B基因移码突变c.4967d e l C(NM_000347)导致的H S㊂1资料与方法1.1一般资料先证者,女,21岁,因贫血及高胆红素血症入院,发病年龄18岁㊂查体发现肝脾肿大㊂实验室血液学检查结果:红细胞计数为3.43ˑ1012/L,血红蛋白为105g/L,平均红细胞体积为83.8 f L,平均红细胞血红蛋白含量为30.6p g,平均红细胞血红蛋白浓度为360g/L,总胆红素为80.0μm o l/L,直接胆红素为12.9μm o l/L,间接胆红素为67.1μm o l/L㊂葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-P D)筛查及C o o m b s试验均为阴性㊂经血红蛋白电泳,α和β球蛋白基因分析排除珠蛋白生成障碍性贫血㊂红细胞脆性试验显示,开始溶血为0.50%(正常范围0.42%~0.46%),完全溶血为0.36%(正常范围0.28%~0.32%)㊂家族史:家庭其他成员经常规检查,表观健康,血液学表型正常㊂骨髓涂片显示:(1)骨髓增生明显活跃(G=42,E=43,GʒE=0.98);(2)粒系增生,以晚幼㊁杆状粒细胞为主;(3)红系增生显著,以中㊁晚幼红细胞为主,成熟红细胞大小不一,球形红细胞较多(图1a)㊂外周血涂片显示成熟红细胞形状和大小不同,球形红细胞最常见(图1b),初步诊断为H S㊂为了进一步明确先证者溶血性贫血类型及发病机制,笔者采用高通量全外显子测序技术(W E S)对遗传性溶血性贫血相关基因进行检测㊁分析㊂注:a为先证者骨髓涂片W r i g h t-G i e m s a染色;b为先证者外周血涂片W r i g h t-G i e m s a染色㊂图1先证者的骨髓和外周血涂片结果1.2方法1.2.1外周血D N A提取在征得患者及家属知情同意后,抽取先证者及家庭成员外周血2m L于E D-T A抗凝管中,采用柱式法(B l o o d G e n o m i c D N A E x-t r a c t i o n K i t,Q i a g e n)提取基因组D N A,使用N a n o-d r o p2000和Q u b i t4.0核酸定量仪进行D N A水平和纯度的测定,最后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测D N A 是否降解㊂1.2.2高通量全外显子测序(1)D N A片段化:取基因组D N A100n g,利用超声打断仪将其随机打断成150~200b p的片段㊂(2)文库构建:对打断后的D N A小片段进行末端修复㊁磷酸化以及加p o l y A,片段两端分别连接接头后进行纯化,纯化后的每个样本分别加入不同的i n d e x,制备D N A文库,最后使用Q u b i t4.0进行文库水平测定㊂(3)测序上机:根据文库的有效水平及数据产出需求在i l l u m i n a H i S e q测序仪上进行测序㊂1.2.3生物信息学分析原始数据下机后根据不同样本的i n d e x标记进行数据拆分,将初始数据进行低质量过滤后,以N C B I人类基因组参考序列(h g19, G R C h38)为模板进行比对,采用B WA软件对单核苷酸多肽性(S N P)位点进行注释㊂1.2.4基因突变位点致病性评级根据遗传变异分类标准与指南对突变位点进行致病性评级[4]㊂1.2.5S a n g e r测序进行位点验证从全外显子测序数据筛选出与先证者临床表型相符的疑似致病变异,㊃0201㊃检验医学与临床2023年4月第20卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2023,V o l.20,N o.7*基金项目:广东省中山市社会公益与基础研究项目(2022B1002㊁2021B1082)㊂ә通信作者,E-m a i l:f x w86@126.c o m㊂Copyright©博看网. All Rights Reserved.再利用S a n ge r 一代测序技术对先证者及其家庭成员的外周血D N A 进行位点验证㊂S P T B c .4967d e l C(NM _000347)的上游引物:5'-T G T C C C A C A A G C -C T A C T C C C -3';下游引物:5'-A G A G C A C C A AT T T C C G A A G G -3'㊂扩增片段长度为494b p㊂扩增体系25.0μL :基因组D N A 约30n g,10ˑ扩增缓冲液2.5μL ,d N T P 混合物(2.5mm o l /L )4.0μL ,上㊁下游引物(10p m o l /L )各1.0μL ,L A T a q (5U /μL )0.5μL ,用无核酸酶水定容至25.0μL ㊂反应条件:(1)95ħ变性5m i n ;(2)95ħ变性30s ,62ħ退火30s ,72ħ延伸45s ,循环35次;(3)总延伸72ħ5m i n㊂P C R 产物于A B I 3500测序仪进行测序,测序结果与U C S C 数据库中S P T B 基因序列比对分析㊂2 结 果2.1 S a n ge r 测序结果及全外显子测序结果 利用S a n g e r 测序对先证者及家庭成员中S P T B 基因突变进行鉴定,证实了先证者携带该突变,但家庭其他成员均未携带上述突变㊂见图2a ㊂利用全外显子测序对该患者行进一步基因研究发现,存在S P T B 基因的1个杂合移码缺失(c .4967d e l C /p .P r o 1656L e u f s*20),即在S P T B 基因(NM _000347)第23个外显子编码区4967位置缺失了1个C 碱基,使第1656位氨基酸由脯氨酸变成亮氨酸,并在突变点后第20位氨基酸提前出现终止密码,生成一个截短的m R N A (图2b和图2c )㊂ 注:a 为H S 家系分析,黑色代表H S 患者,白色代表临床表型正常成员,箭头代表先证者;b 为S a n ge r 测序鉴定了1个新发的杂合S P T B 移码突变(S P T B :c .4967d e l C ),其他家庭成员没有携带这种突变,黑色箭头代表c .4967d e l C 突变位点;c 为移码突变的氨基酸序列预测,黑色箭头表示c .4967d e l C 突变位点,*表示提前终止密码子㊂图2 S a n ge r 测序结果及S P T B 基因移码突变的氨基酸序列预测2.2 基因突变位点致病性评级 (1)P M 2:E S P 6500种群㊁1000基因组数据㊁E x A C 数据库,以及H GM D ㊁C l i n v a r ㊁G n o m A D 数据库均未发现该突变㊂(2)P V S 1:该突变为移码突变,影响蛋白质功能㊂(3)P S 2:在家系中,该突变为新发突变,且无家族史㊂综上所述,S P T B c .4967d e l C 变异被归为致病性变异㊂3 讨 论H S 主要是由于红细胞膜蛋白及骨架蛋白相关基因突变导致的遗传性溶血性疾病,由于临床表现具有高度的异质性,且目前尚没有十分可靠的实验室指标进行确诊,因此在临床上常常被漏诊或误诊[5-6]㊂有研究报道5个与H S 相关的致病基因分别为A N K 1㊁S P T A 1㊁S P T B ㊁E P B 42㊁S L C 4A 1[7-8],但是这些基因突变位点是分散的㊁无热点突变,采用常规分子诊断方法(S a n g e r 靶向测序)进行基因突变分析具有一定的挑战性㊂随着全外显子组技术在临床诊断上的普及,以及其具有价格低,覆盖广等优势,可以一次性同时检测H S 相关基因,大大缩短了检测时间,提高了检测效率[9-11]㊂S P T B 基因编码血影蛋白的β亚基,是血影蛋白基因家族的一员,定位于14q23.3,长100k b ,由35个外显子组成,其编码的蛋白是构成红细胞膜的细胞骨架上层结构,在红细胞膜的稳定性中起着重要的作用㊂S P T B 基因突变与Ⅱ型球形红细胞增多症㊁遗传性椭圆形红细胞增多症及新生儿溶血性贫血有关㊂在欧洲国家和美国,H S 患者中约有25%由S P T B 基因的杂合变异所致㊂一般来说,S P T B 基因常见的突变类型包括无义突变㊁移码突变和剪接突变,这些突变通常能导致m R N A 缺陷或β-血影蛋白截短㊂在本研究中,先证者患轻度的溶血性贫血和高胆红素血症,骨髓和外周血涂片均发现球形红细胞,初步诊断为H S ㊂经过全外显子测序显示先证者存在1个S P T B 基因的移码突变,为c .4967d e l C ,经过一代测序验证家庭其他成员未携带突变,该突变属于新发突变,且在相关疾病数据库和人群数据库中均未被收录㊂S P T B 基因c .4967d e l C 导致了S P T B 基因编码㊃1201㊃检验医学与临床2023年4月第20卷第7期 L a b M e d C l i n ,A pr i l 2023,V o l .20,N o .7Copyright ©博看网. All Rights Reserved.的蛋白质转录提前终止,形成截短的m R N A ,使红细胞膜β-血影蛋白的功能改变,从而诱导疾病发生㊂有研究报道其他S P T B 基因移码突变通常会形成一个截短的m R N A ,从而导致H S[12-14]㊂综上所述,本研究报道了1例年轻女性H S 患者的临床表现㊁实验室检测及基因测序结果㊂全外显子测序技术能够同时对H S 所有的相关基因进行测序,使临床症状不明显㊁自发突变㊁散发的H S 能够得到及时诊断,从而降低疾病严重程度和减少不良预后㊂参考文献[1]T O L E S ,D H I R P ,P U G I J ,e t a l .G e n o t y p e -p h e n o t y pe c o r r e l a t i o n i n c h i l d r e n w i t h h e r e d i t a r y s p h e r o c yt o s i s [J ].B r J H a e m a t o l ,2020,191(3):486-496.[2]D A C O S T A L ,S U N E R L ,G A L I MA N D J ,e t a l .D i a gn o s -t i c t o o l f o r r e d b l o o d c e l l m e m b r a n e d i s o r d e r s :A s s e s s -m e n t o f a n e w g e n e r a t i o n e k t a c yt o m e t e r [J ].B l o o d C e l l s M o l D i s ,2016,56(1):9-22.[3]H E B J ,L I A O L ,D E N G Z F ,e t a l .M o l e c u l a r g e n e t i cm e c h a n i s m s o f h e r e d i t a r y s p h e r o c y t o s i s :c u r r e n t p e r s pe c -t i v e s [J ].A c t a H a e m a t o l ,2018,139(1):60-66.[4]R I C H A R D S S ,A Z I Z N ,B A L E S ,e t a l .S t a n d a r d s a n d g u i d e -l i n e s f o r t h e i n t e r p r e t a t i o n o f s e qu e n c e v a r i a n t s :a j o i n t c o n -s e n s u s r e c o m m e n d a t i o n o f t h e A m e r i c a n C o l l e ge of M e d i c a l G e n e t i c s a n d G e n o m i c s a n d t h e A s s o c i a t i o n f o r M o l e c u l a r P a -t h o l og y[J ].G e n e t M e d ,2015,17(5):405-424.[5]张勇刚,徐之良.4例遗传性球形红细胞增多症患者的临床及遗传学分析[J ].中国当代儿科杂志,2019,21(1):29-32.[6]Z HU F ,L I A N G M ,X U L ,e t a l .A t e t r a n u c l e o t i d e d e l e -t i o n i n t h e A N K 1g e n e c a u s e s h e r e d i t a r y s p h e r o c y t o s i s ;a c a s e o f m i s d i a gn o s i s [J ].G e n e ,2020,726:144226.[7]F A R I A S M G.A d v a n c e s i n l a b o r a t o r y d i a gn o s i s o f h e r e d -i t a r y s p h e r o c yt o s i s [J ].C l i n C h e m L a b M e d ,2017,55(7):944-948.[8]廖摇林,邱玉铃,邓增富等.遗传性球形红细胞增多症患者的基因突变研究[J ].中国妇幼保健,2013,36(28):6002-6004.[9]Z HA O R Q ,J I A N G F ,L I J ,e t a l .A n o v e l S P T B f r a m e -s h i f t d e l e t i o n c a u s i n g h e r e d i t a r y s p h e r o c yt o s i s i d e n t i f i e d b y n e x t -g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g i n a C h i n e s e f a m i l y[J ].I n t J L a b o H e m a t o l ,2021,43(6):e 294-e 297.[10]B O G U S L AW S K A D M ,S K U L S K I M ,MA C HN I C K AB ,e t a l .I d e n t i f i c a t i o n o f a n o v e l m u t a t i o n o f β-s p e c t r i n i n h e r e d i t a r y s p h e r o c y t o s i s u s i n g w h o l e e x o m e s e q u e n c i n g[J ].I n t J M o l S c i ,2021,22(20):11007.[11]F A N L L ,L I U J S ,HU A N G H ,e t a l .W h o l e e x o m e s e -q u e n c i n g i d e n t i f i e d a n o v e l m u t a t i o n (p.A l a 1884P r o )o f β-s p e c t r i n i n a C h i n e s e f a m i l y w i t h h e r e d i t a r y s p h e r o c y t o -s i s [J ].J G e n e M e d ,2019,21(2/3):e 3073.[12]B A R C E L L I N I W ,B I A N C H I P ,F E R MO E ,e t a l .H e r e d i -t a r y r e d c e l l m e m b r a n e d e f e c t s :d i a gn o s t i c a n d c l i n i c a l a s -pe c t s [J ].B l o o d T r a n sf u s ,2011,9(3):274-277.[13]P WR R O T T A S ,G A L L A G H E R P G ,MOHA N D A S N.H e r e d i t a r y s p h e r o c yt o s i s [J ].L a n c e t ,2008,372(9647):1411-1426.[14]I O L A S C O N A ,A V V I S A T E R A.G e n o t y p e /p h e n o t y pe c o r r e l a t i o n i n h e r e d i t a r y s p h e r o c y t o s i s [J ].H a e m a t o l o gi -c a ,2008,93(9):1283-1288.(收稿日期:2022-08-29 修回日期:2022-12-28)ә通信作者,E -m a i l :415211246@q q.c o m ㊂㊃案例分析㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2023.07.040朗格汉斯细胞组织细胞增生症合并A S X L 1突变1例徐道晶1,张 晓2,孙荣同1ә1.山东省威海市立医院检验科,山东威海264200;2.威海卫人民医院关节骨病科,山东威海264200关键词:朗格汉斯细胞组织细胞增生症; 溶骨破坏; B R A F -V 600E 突变; A S X L 1突变中图法分类号:R 446.11+3文献标志码:C 文章编号:1672-9455(2023)07-1022-03 朗格汉斯细胞组织细胞增生症(L C H )发病原因不明㊁发病率极低,相关研究甚少,该病是一种多系统起病,临床表现多样化的罕见病㊂现报道1例起源于脊柱溶骨破坏的L C H 供大家参考㊂1 临床资料1.1 一般资料 患者,男,56岁, 脂肪肝㊁酒精肝 10余年未系统治疗㊂2020年3月无诱因出现腰背部疼痛,无发热,就诊于当地医院㊂检查提示T 10压缩性骨折㊁T 5隐裂,经手术治疗好转㊂2021年10月患者无诱因出现前胸㊁后背疼痛,无发热,再次入院㊂1.2 影像学及病理学检查 P E T /C T :T 3~5椎体不同程度溶骨破坏伴软组织肿块硬化或压缩骨折,代谢活性不同程度增高或明显增高,考虑为恶性可能,建议取T 3椎体处肿物进行病理活检㊂胸部C T 提示:右肺下叶微结节,多发肺大泡,双肺少许纤维灶;T 3㊁T 5㊁T 10椎体改变㊂C T 引导下行T 3椎体肿物穿刺活检术,病理结果显示:(椎体肿物穿刺)少量纤维结缔组织,可见多处组织细胞增生,伴大量淋巴细胞及嗜酸性粒细胞浸润㊂免疫组化:细胞角蛋白A E 1/A E 3(-),波形蛋白V i m e n t i n (+),细胞增殖指数K i 67㊃2201㊃检验医学与临床2023年4月第20卷第7期 L a b M e d C l i n ,A pr i l 2023,V o l .20,N o .7Copyright ©博看网. 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「全外显子组测序分析中预处理方法和变异识别方法的比较」
全外显子组测序分析中预处理方法和变异识别方法的比较闫瑾, 潘琦, 任红(重庆医科大学附属病毒性肝炎所,重庆 4０00１０）【摘要】目的研究在外显子组数据分析中,使用不同的预处理方法和变异过滤方法对变异识别的影响。
方法ﻩ采用FＡSTX-Ｔｏolkit、Trimmoｍatｉc作为预处理方法，修饰后不同的不匹配读长(ｓiｎglｅ－enｄ rｅads)取舍策略，以及硬过滤（ｈarｄ filｔer）和变异质量得分重新校正（ＶQＳR）作为变异过滤方法对两例全外显子组数据进行变异识别,通过数据覆盖深度（DP）、识别变异的数目、Ti/Tv值和基因型一致性等数据进行比较其效果。
结果ﻩTｒimmomａtiｃ预处理后的读长的测序覆盖深度与未预处理的原始数据接近，但明显高于ＦASTＸ-Ｔooｌkiｔ预处理方法。
当DP≥１０×、基因型质量分数（GQ）≥２0时，经Trimｍoｍatic预处理后识别到的SNV数量比FAＳTX-Tｏｏlkit高，与未预处理组接近。
当包含single-enｄ读长时，FAＳＴＸ－Tｏolkiｔ组多识别的SNV数量高于（28％)Trimmomatiｃ组 (5%）。
当样本量较少时，在所有试验组中硬过滤方法滤掉的SNV要少于ＶQSＲ。
ﻩ结论Tｒimmｏmａtｉc修饰(过滤)原始序列更温和,而FASTＸ-Toolkit可能过度过滤了原始数据。
保留sｉngle-eｎd读长有利于下游变异识别。
硬过滤相较于变异质量得分重新校准表现出更高的容忍度。
[关键词] 全外显子组测序;预处理；变异识别[中图法分类号］ R8５7．3;Ｑ34４+.12Compａrisoｎof mｅtｈｏds foｒpｒｅ-ｐrocessing and variants fｉlｔｅrinｇiｎａｎalyｚｉｎg whole exome ｓequｅncing dａtaYan Ｊiｎ, Pan Ｑｉ, ＲeｎＨｏng（Institute fｏr Viraｌ Hｅpａtitis，Cｈongqｉng Medical Ｕｎiverｓity, Chｏngqｉng,400０10，China)【Abstract】 ObｊecｔiveﻩＴo ｉｎveｓｔｉｇate how diｆferent ｍethｏds ｆoｒｐre－proｃessing aｎｄｖａrｉanｔs fiｌteri ｎg aｆfｅct vａriａnts cａlｌｉｎg. MethodﻩThｒouｇh the calcｕlａtion ｏf depｔｈ of covｅrage,nuｍbｅr ｏｆ vａriａnts, Ti/Tv ratio and non－refeｒenｃe cｏncorｄａnce，we compａrｅｔhe eｆfect oｆFＡSTＸ-Toolｋｉt ａnd Tｒimmomatic in ｐｒｅpｒｏcesｓing tｈe eｘomeｄata, tｈｅ straｔegｉes of sｉnglｅ-end incｌusion aｎｄ ‘Ｈarｄ’fiｌtｅr anｄvａrianｔs qualｉtｙscoｒe ｒecalibration (VＱSＲ)in ｖariants fiｌterｂy using wｈoｌe ｅxｏｍe sequencinｇｄata ｆrom twｏｔest samｐles．Reｓult Tｒiｍmｏｍatic prｅ-pｒｏｃessed reaｄs shｏwｅd sｉmiｌaｒ deｐtｈ of ｃovｅｒage ｔo rｅads ｔｈosｅ without pｒe－ｐrｏcｅsｓiｎg, but siｇnifiｃａnｔly greater tｈan thoｓe by FASTX-Toｏlｋｉt prｅ-pｒoceｓsｅｄreads. Wｉth dｅptｈof coverage ≥１0×ａnd geｎotype quality ≥20, thｅｎumｂer ｏf ｃalleｄ SＮＶs ｉdentified by Trｉmmｏmatic was greaｔer thaｎＦASTX－Toｏlkｉt, buｔ sｉmｉlar ｔo ｔhosｅwｉthｏｕt pre－procesｓinｇ.Ｗｉth theｉｎｃlusion ｏf ｓｉngle-ｅnｄreads,tｈe ｎｕmbeｒof varｉａｎtsｉncrｅased sｉgnifｉcantly ｆor ＦASTＸ-Toolｋｉt pre－processinｇ(~28%）thanＴｒimmomａticｐｒｅ－pｒｏcｅｓsing （~5%). Ｉn tｈe aｌl settingｓ, ‘Hard’ filtｅrｉｎg filtered leｓｓ SＮVs thaｎ VQSＲfilterｉng iｎｓｍａlｌsaｍpｌe sｉze．ﻩCｏnｃlｕsiｏnﻩSeｑuｅnｃe readｓ weｒe tri ｍｍed aｎｄ/or ｆilｔered moderａtｅｌy by Trimｍomatｉc， whereaｓ iｔｓeemed to ｂe over-filtereｄｂy FASＴＸ-Tｏolｋit. Keepｉｎｇｔhｅ singlｅ-end reａdｓ is goｏd ｆor ｖariants calling ｉn tｈe downstreａmａnalyｓis．The ‘Ｈａrd’fｉlteｒｉｎg shoｗｅｄa morｅ fａvｏｒaｂle tｏｌeraｂｉlｉtｙ pｒo ‘ＶQＳR’fiｌtｅriｎg.Keyword: whoｌe eｘome seqｕencｉng, pre－proｃｅssｉng, vａｒｉantｓｆilｔｅｒｉngSuｐpｏrteｄ bｙｔheＧeｎeｒal Pｒogram of Nationａl NatｕraｌＳciｅnce Fouｎdatｉｏn oｆ Chｉｎa (03１8，3093００8２),Naｔｉonal Scｉenｃe ａｎｄＴechnｏlogy Mａjor Proｊect（200８ZX1０00２-０06,2０12ZＸ１０002０07), the Founｄatｉon for Sci & Ｔech Reｓearcｈ Projecｔof Ｃhoｎgｑｉng (cstc2012gg－yyjsB１0007)Correspondiｎg author: Ren Hoｎg,Tel: 02３-, Ｅ-mａil：自全外显子组技术出现以来，研究者们利用该技术不断揭示了众多孟德尔疾病发病的原因［1]。
全外显子组测序常见问题（上）
全外显⼦组测序常见问题（上）1全外显⼦组测序必须要有参考基因组吗？必须有，如果没有参考因组，要提供近缘物种的序列，但不能保证捕获结果的可靠性。
因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的，如果已知⽬标区域与参考基因组⽐有较⼤出⼊，例如⼤⽚段的插⼊缺失，是不推荐的。
2为什么外显⼦测序在分析时需要跟全基因组⽐对，⽽不是直接与⽬标区域⽐对？第⼀，⽬标区域相对于全基因组⼀般较短，⽽且可能不连续，如果将⽬标区域单独提取出来，会影响区域边缘的序列⽐对效果；第⼆，⽆法评估捕获质量，例如脱靶率、on target⽐例等。
3全外显⼦组测序⼀般建议做多少倍的覆盖？⼀般做100×或150×。
较⾼的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现⼩⽐例的突变。
另外，外显⼦测序的覆盖是随机的，这样较⾼的平均覆盖率有利于保证⼤部分的区域有⾜够的覆盖倍数。
4全外显⼦组测序深度的意义是什么？测序深度如何换算？测序深度代表了序列被探针组覆盖的次数，次数越⾼，测序结果的识别就越精确，后续的统计分析也就越准确。
如果做肿瘤、低频突变研究，建议测序深度⾄少应达到150×以上。
如果只看经典SNP、⾮低频突变，测序深度也⾄少应该在30×以上。
测序深度换算⽅法：⼀般⽬标区域的捕获效率在60-70%，安捷伦和罗⽒等外显⼦捕获试剂盒的⽬标区域⼤⼩在60Mb左右，即测序深度=10G*60%/60Mb=100×。
5全外显⼦组测序能够测出多⼤的⽚段缺失？⼤致能测出50bp的⽚段缺失。
由于外显⼦测序的覆盖很不平均，所以如果有⼤段的缺失，⽆法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。
⽬前能够测到的，就是在⼀个read中发现的缺失。
⼀个read的长度也就是150bp，所以50bp以下的⽚段缺失可以从外显⼦测序中测出来。
6全外显⼦组测序可以做CNV分析吗？检测CNV的⽅法还有哪些？全外显⼦测序因为有⼀个杂交捕获的过程，这样就会有⼀个杂交捕获效率的问题。
全外显子测序结题报告
全外显子测序结题报告客户项目编号上海祥音生物科技有限公司目录1.项目概述 (3)2.建库测序流程 (3)2.1.DNA样本检测 (3)2.2.建库捕获 (3)2.3.库检及上机测序 (3)3.数据分析 (4)3.1.分析流程 (4)3.2.数据库信息 (4)3.3数据分析软件 (5)4.分析结果 (5)4.1.原始数据 (5)4.2.质量控制 (7)4.3.质量评估 (9)4.4.重要指标统计 (15)4.5变异检测结果 (21)5.参考文献 (28)1.项目概述2.建库测序流程2.1.DNA样本检测对DNA样品的检测主要包括3种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA及蛋白等污染。
(2)Nanodrop检测DNA的纯度（OD260/280比值）。
(3)Qubit对DNA浓度进行精确定量。
一般OD值在1.8~2.0之间，含量在1.5ug以上的DNA样品用来建库结果更好。
2.2.建库捕获Agilent SureSelect Human All Exon V6是 Agilent自主研发的全外显子捕获芯片，该产品汲取多个权威数据库（如RefSeq，OMIM_cds）的核心内容，具有更大的捕获区间，更高的捕获效率，保证外显子编码区的高覆盖率及SNP检出率。
将全外显子区域进行捕获并富集后，使用主流的 illumina、Life Technology 等测序平台进行高通量测序。
实验严格按照生产流程进行操作。
2.3.库检及上机测序1)取1μl文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度约在1-10ng/μl；2)取1μl样品使用Agilent2100Bioanalyzer system（Agilent DNA1000Kit）进行文库片段长度测定，文库长度约在220-320bp之间；3)使用高通量测序平台进行测序。
3.数据分析3.1.分析流程获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有参考序列或参考基因组(GRCh37/hg19)的情况下，进行信息分析流程，大致包括以下两个部分：1)测序数据质量评估：主要对数据量、碱基质量、比对率、覆盖率、捕获率、均一性等指标进行统计，评估建库测序是否达到了标准，符合标准则进行后续分析。
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Base_covered_on_target(Mb)10 Coverage_of_target_region11 Fraction_of_target_covered_with_at_least_20x12 Fraction_of_target_covered_with_at_least_10x13 Fraction_of_target_covered_with_at_least_4x14
13721 92.05 47.31
12636 90.86 46.75
9776 66.84 43.05
9616 64.37 41.45
6904
6815
6684
6437
当比对到参考基因组目标区域的数据量在60%之上，认为外显子捕 获效率合格。
3.2.3、染色体覆盖深度分布
注：横坐标为染色体长度，纵坐标为覆盖深度取对数。
二、外显子组测序流程
基因组DNA的随机打断 DNA片段生物信息分析
三、外显子组测序信息分析流程
主要信息分析内容归类
3.1、数据过滤与评估 3.2、整体质量评估 3.3、SNP检测与注释 3.4、InDel检测与注释 3.5、高级分析
外显子组测序在医学研究中的应用
一 • 外显子组测序技术简介 二 • 外显子组测序流程 三 • 外显子组测序信息分析内容 四 • 外显子组测序的应用方案
一、外显子组测序技术简介
外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区 域DNA捕捉并富集后，再进行高通量测序的基因组分析方法。
外显子组序列仅占全基因组序列的1%左右，与人类85% 致病基因突变相关。与全基因组测序相比，外显子组测序不 仅费用较低，而且测序覆盖度更深，数据准确性更高。
3.3.2、 SNP注释
Type
INTERGENIC INTRAGENIC INTRON
UPSTREAM DOWNSTREAM UTR_3_PRIME UTR_5_PRIME SPLICE_SITE_ACCEPTOR SPLICE_SITE_DONOR
CDS
Other
NON_SYNONYMOUS_CODING NON_SYNONYMOUS_START START_GAINED START_LOST STOP_GAINED STOP_LOST SYNONYMOUS_CODING SYNONYMOUS_STOP
3.3、 SNP检测及注释
3.3.1、 SNP检测
SNP的检测主要使用GATK软件工具包实现。
BMK ID SNP Number
Transition Number
X1 X2 X3 X4 Total
985254 842516 263326 289954 1556901
669172 573399 178220 196145
3.3.3、突变特征
突变位点上下文碱基偏好性
注：横坐标为突变位点上下文的碱基位置，0为SNP突变位点，负数代表突变位点前的碱基， 正数代表突变位点后的碱基，纵坐标为不同碱基对应的比例。从图上可以看出，不同类型 的SNP突变上下文具有不同的碱基偏好性。
3.4、 InDel检测及注释
3.4.1、 InDel检测
3.1、数据过滤与评估
3.1.1、原始数据过滤
1. 过滤接头。对含接头的reads去除接头序列。 2. 一条reads上N（未能确定出具体的碱基类型）的比例
大于5%，则过滤掉该reads。 3. 过滤低质量reads，过滤掉Q30<85% reads。
3.1.2、测序数据统计与评估
测序质量值分布图
892 975
111 121 218 865 610 652 51 277 303 32 77 112 124
776 850 14 14 19 21 882 925 00 93 100 32 10 8 10 923 940 00 32 18
3.3.3、突变特征
突变频谱图
注：横坐标为不同类型的突变，纵坐标为不同类型突变对应的频率。
Transversion Number
316082 269117 85106 93809
Ti/Tv Ratio
2.11 2.13 2.09 2.09
Heterozygosity Number
207400 167179 26436 30446
Homozygosity Number
777854 675337 236890 259508
Region Insertion Deletion Heterozygosity Homozygosity
Total
R01 51689 57643 89744 19588 109332
R02 44234 51061 78848 16447 95295
X1 118.70
X2 118.70
X3 118.70
X4 118.70
Reads_mapping_ref(single reads)2
182.95
168.48
97.76 96.16
Mapping_datasize(Mb)3 Effective_sequences_on_target(Mb)5 Average_sequencing_depth_on_target7
R01
449352
3425
401739
24452
95551
395 2165 31 61 1971 2 378 8 26 5 1772 1 106
R02
380794
2896
343966
21350
83565
407 1891 36 54 1899 1 346 6 24 3 1732 1 89
R0 R0 34 113 125 110 682
碱基含量分布图
3.2、整体测序质量评估
3.2.1、测序深度统计
注：横坐标代表测序深度，纵坐标代表目标区域上对应深度的碱基数占总碱 基数的百分比。目标区域的单碱基分布近似服从泊松分布。
3.2.2、外显子捕获统计
Target region stat Length_of_target_region(Mb)1